AÇÃO DO ÁCIDO TRANEXÂMICO NA REGENERAÇÃO HEPÁTICA APÓS HEPATECTOMIA PARCIAL: MODELO EXPERIMENTAL EM RATOS

AÇÃO DO ÁCIDO TRANEXÂMICO NA REGENERAÇÃO HEPÁTICA APÓS HEPATECTOMIA PARCIAL: MODELO EXPERIMENTAL EM RATOS

Autores:

Felipe Antonio SOBRAL,
Henrique DAGA,
Henrique Nogueira RASERA,
Matheus da Rocha PINHEIRO,
Igor Furlan CELLA,
Igor Henrique MORAIS,
Luciana de Oliveira MARQUES,
Luiz Martins COLLAÇO

ARTIGO ORIGINAL

ABCD. Arquivos Brasileiros de Cirurgia Digestiva (São Paulo)

Print version ISSN 0102-6720On-line version ISSN 2317-6326

ABCD, arq. bras. cir. dig. vol.29 no.2 São Paulo Apr./June 2016

https://doi.org/10.1590/0102-6720201600020009

RESUMO

Racional:

Muitas são as injúrias que acometem o fígado e levam a estímulo lesivo. Alguns procedimentos terapêuticos para tratamento dessas lesões dependem da regeneração hepática para aumentar a sua capacidade funcional.

Objetivo:

Avaliar o efeito do ácido tranexâmico na regeneração hepática após hepatectomia parcial em ratos.

Método:

Foram utilizados 40 ratos (Rattus norvegicus albinus, Rodentia mammalia) convencionais da linhagem Wistar-UP. Foram divididos aleatoriamente em dois grupos de 20: grupo controle (CT) e grupo ácido tranexâmico (ATX). Cada um deles foi divido em dois subgrupos para avaliar a regeneração hepática no tempo de 32 h e 7 dias do pós-operatório. A regeneração do órgão foi avaliada quanto ao peso e histologia, sendo esta última por hematoxilina-eosina e antígeno nuclear de proliferação celular.

Resultados:

A média dos pesos dos animais dos grupos ATX 7 dias e CT 7 dias no pré-operatório foram de 411,2 g e 432,7 g, respectivamente, e após a regeneração foram de 371,3 g e 392,9 g. As médias das taxas de mitose coradas por HE dos dois grupos em 7 dias foram de 33,7 e 32,6 mitoses, respectivamente, e de 14,5 e 14,9 mitoses para os grupos ATX e CT 32 h. A contagem de células por antígeno nuclear de proliferação celular mostrou valores de 849,7 para o grupo ATX 7 dias e 301,8 para o CT 7 dias; 814,2 para o grupo ATX 32 h e 848,1 para o CT 32 h.

Conclusão:

O ácido tranexâmico mostrou-se efetivo na regeneração hepática somente em período mais longo de observação após hepatectomia parcial.

DESCRITORES: Ácido tranexâmico; Hepatectomia; Regeneração hepática

ABSTRACT

Background:

Different lesions may affect the liver resulting in harmful stimuli. Some therapeutic procedures to treat those injuries depend on liver regeneration to increase functional capacity of this organ.

Aim:

Evaluate the effects of tranexamic acid on liver regeneration after partial hepatectomy in rats.

Method:

40 rats (Rattus norvegicus albinus, Rodentia mammalia) of Wistar-UP lineage were randomly divided into two groups named control (CT) and tranexamic acid (ATX), with 20 rats in each. Both groups were subdivided, according to liver regeneration time of 32 h or seven days after the rats had been operated. The organ regeneration was evaluated through weight and histology, stained with HE and PCNA.

Results:

The average animal weight of ATX and CT 7 days groups before surgery were 411.2 g and 432.7 g, and 371.3 g and 392.9 g after the regeneration time, respectively. The average number of mitotic cells stained with HE for the ATX and CT 7 days groups were 33.7 and 32.6 mitosis, and 14.5 and 14.9 for the ATX and CT 32 h groups, respectively. When stained with proliferating cell nuclear antigen, the numbers of mitotic cells counted were 849.7 for the ATX 7 days, 301.8 for the CT 7 days groups, 814.2 for the ATX 32 hand 848.1 for the CT 32 h groups.

Conclusion:

Tranexamic acid was effective in liver regeneration, but in longer period after partial hepatectomy.

HEADINGS: Tranexamic acid; Hepatectomy; Liver regeneration

INTRODUÇÃO

As doenças hepáticas apresentam elevadas taxas de morbimortalidade no Brasil, e ainda são responsáveis por altos custos ao sistema de saúde do país3,16. É manifesto que a maioria das hepatopatias leva à injuria celular, e quando não tratadas adequadamente levam o órgão a falência, que por sua vez tem por consequência o desequilíbrio da homeostase corporal, a desregulação do nível glicêmico, a deficiência da depuração de substâncias tóxicas, a deficiência de fatores de coagulação e proteínas plasmáticas, além de alterações no ciclo da ureia e secreção biliar8.

Muitos dos procedimentos terapêuticos utilizados, como o transplante de doadores vivos e a ressecção tumores hepáticos primários ou mesmo secundários, dependem da regeneração hepática para aumento da capacidade funcional do órgão. Diante desse conhecimento, muitos estudos têm sido publicados6,9,12,17,19.

Ainda dentro deste foco de pesquisa, o papel das plaquetas vem sendo investigado. No ano de 2000 surgiu o primeiro artigo dirigido especificamente ao papel das plaquetas na regeneração hepática. Desde então, os estudos experimentais com plaquetas evidenciam que elas contribuem expressivamente para a regeneração do órgão, sendo sua eficácia proporcional à sua quantidade na corrente sanguínea6,19.

Tais estudos identificaram aumentos significativos na velocidade de regeneração do órgão de cobaias portadores de trombocitose e contagem normal de plaquetas, quando comparadas com trombocitopênicos. Ainda, alguns autores demonstraram aumento na sobrevida dessas cobaias em relação ao último grupo6,19.

Partindo desta hipótese, faz-se necessário a verificação de fármacos que possam manter taxas elevadas destes elementos em situações de injúria celular. Os antifibrinolíticos, por exemplo, permitem a manutenção da quantidade de plaquetas ao inibirem a fibrinólise que impede ou diminui a formação dos produtos de degradação da fibrina. Além disso, eles diminuem a conversão do plasminogênio em plasmina, promovendo atividade proteolítica nos receptores plaquetários14.

O objetivo deste estudo foi avaliar o uso do ácido tranexâmico na regeneração hepática após hepatectomia parcial em ratos.

MÉTODOS

O experimento foi conduzido na Faculdade Evangélica do Paraná, Curitiba, PR, Brasil. O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Sociedade Evangélica Beneficente de Curitiba [004117/2013] e foram respeitados os princípios éticos de manuseio e experimentação animais definidos pela Comissão de Ética em Uso de Animais e Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório.

Foram utilizados 40 ratos machos adultos (Rattus norvegicus albinus, Rodentia mammalia), convencionais da linhagem Wistar. Foram mantidos em ciclo claro/escuro de 12/12h, umidade de 55±10%, em temperatura ambiente de 21-24ºC, com livre acesso à ração própria para a espécie e à água. Os animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos de 20: grupo controle (CT) e grupo ácido tranexâmico (ATX). Ambos foram subdivididos em dois subgrupos com 32 h (CT32/ATX32) e sete dias (CT7/ATX7) de acordo com tempo de eutanásia após o procedimento cirúrgico. A técnica cirúrgica consistiu, primeiramente, em anestesia intraperitoneal 0,1 ml/100 g de quetamina 10% e 0,05 ml/100 g de xilazina 2%; epilação; degermação; e laparotomia mediana de aproximadamente 5 cm. A manutenção anestésica foi feita com Isoflurano inalatório com concentração de 1% a 2,5%.

Após a localização do fígado, foi realizada a ressecção do ligamento redondo e a ligadura do pedículo vasculobiliar do lobo mediano com fio de algodão 4.0 e posterior ressecção. O mesmo procedimento foi feito no lobo lateral esquerdo, resultando em hepatectomia de aproximadamente 70%7.

Os grupos CT32 e CT7 receberam tratamento placebo com infusão de 1 ml/kg de solução salina isotônica 0.9% intraperitoneal após a hepatectomia parcial. Já os grupos ATX32 e ATX7 receberam, após a hepatectomia parcial, infusão de ácido tranexâmico (Transamin(r)) em 50 mg/kg na cavidade peritoneal.

Os lobos ressecados foram pesados e em seguida foi feita a laparorrafia com dois planos de sutura. A analgesia pós-operatória foi realizada com cloridato de tramadol na dose de 7 mg/kg de peso intramuscular a cada 12 h durante quatro dias de pós-operatório nos grupos CT7 e ATX7, e até o momento da eutanásia nos grupos CT32 e ATX32.

Após os períodos de renegeração pré-determinados, os grupos foram operados novamente para o estudo dos órgãos regenerados. No pós-operatório imediato, todos os ratos foram submetidos à eutanásia sob overdose de isoflurano inalatório. Somente os grupos CT7 e ATX7 foram analisados quanto a estimativa de regeneração pela fórmula de Kwon.

Foi realizada a fixação em formalina tamponada para confecção das lâminas e estudo das mitoses com HE. Ainda foram confeccionadas lâminas seguindo o método de Microarranjo Tecidual (TMA), marcadas por Antígeno Nuclear de Proliferação Celular (PCNA), para quantificação dos hepatócitos em fase de duplicação na imunoistoquímica13,15.

Os dados coletados foram submetidos à análise estatística pelo teste de Wilcoxon, realizado pelo programa Action 2.8 para Microsoft Windows 8, adotando como padrão p<0.05.

RESULTADOS

As médias ponderadas foram 411,2 g±10,27 para ATX7 e 432,7 g±40,54 para CT7; 391,4 g±43,86 para ATX32 e 417 g±41,84 para CT32. Após o sétimo dia de pós-operatório os pesos dos grupos ATX7 e CT7 foram novamente verificados e foram obtidas, respectivamente, as médias 371,3 g±13,06 e 392,9 g±41,28. Pode ser verificada na Tabela 1 o peso dos animais antes da hepatectomia parcial e após a regeneração.

TABELA 1 Peso antes do procedimento cirúrgico e após o período de sete dias de pós-operatório 

CT32 ATX32 CT7 ATX7
Pesagem inicial
Rato 1 390g 460g 390g 418g
Rato 2 415g 300g 379g 390g
Rato 3 340g 330g 400g 420g
Rato 4 390g 370g 430g 410g
Rato 5 440g 411g 470g 415g
Rato 6 415g 403g 372g 415g
Rato 7 505g 415g 447g 410g
Rato 8 440g 410g 446g 420g
Rato 9 440g 410g 503g 420g
Rato 10 395g 405g 400g 394g
Pesagem após sete dias de regeneração
Rato 1 - - 372g 380g
Rato 2 - - 330g 359g
Rato 3 - - 380g 380g
Rato 4 - - 410g 370g
Rato 5 - - 443g 345g
Rato 6 - - 340g 373g
Rato 7 - - 420g 385g
Rato 8 - - 430g 386g
Rato 9 - - 450g 385g
Rato 10 - - 354g 360g

A diferença entre a regeneração hepática dos grupos ATX7 e CT7, quando aplicada a fórmula de Kwon não foi significante (p=0,91). A contagem de mitoses na microscopia óptica não apresentou alteração na morfologia das células hepáticas e evidenciou médias mitóticas de 33,6±12,8 para o grupo ATX7, 32,6±10,7 para CT7, 14,5±13,3 para ATX32 e 14,9±20,5 para CT32. Foram insignificantes as diferenças mitóticas apresentadas por ambos os grupos nos dois períodos de 32h e sete dias (p=0,38 e p=1,0 respectivamente). Os valores obtidos na marcação por HE estão apresentados na Tabela 2.

TABELA 2 Número de mitoses marcadas por HE 

CT32 ATX32 CT7 ATX7
Rato 1 0 4 1 0
Rato 2 62 17 0 0
Rato 3 10 9 0 0
Rato 4 35 46 0 0
Rato 5 0 8 0 0
Rato 6 0 28 0 0
Rato 7 2 12 0 0
Rato 8 28 13 4 1
Rato 9 8 6 0 0
Rato 10 4 2 0 2

Na análise imunoistoquímica foram obtidos valores médios de 849,7± 134 células marcadas para o grupo ATX7, 301,8±241,8 para CT7, 814,2±153,2 para AXT32 e 848,1±52,2 para o grupo CT32. A comparação mitótica entre o grupo CT32 e ATX32 não foi significativa estatisticamente (p=1,0). No entanto, nos grupos avaliados com 7 dias de regeneração, a análise estatística evidenciou maior taxa mitótica para o grupo ATX7 (p=0,0002056). Os números obtidos na marcação imunoistoquímica estão apresentados na Tabela 3.

TABELA 3 Número de mitoses marcadas por PCNA  

CT32 ATX32 CT7 ATX7
Rato 1 827 405 90 810
Rato 2 823 853 347 851
Rato 3 948 895 214 868
Rato 4 872 783 854 926
Rato 5 854 947 257 958
Rato 6 769 808 448 620
Rato 7 869 912 40 792
Rato 8 899 888 69 664
Rato 9 792 794 260 959
Rato 10 828 857 439 1049

DISCUSSÃO

Conhecer a capacidade de regeneração do fígado e como ele irá responder a um fármaco frente a injúrias celulares nos ajuda a programar terapêutica de qualidade aos pacientes. Na literatura foram encontrados poucos experimentos parecidos a este e ainda eles não utilizaram drogas da mesma classe nem no mesmo período de avaliação aqui apresentado. Com isso, a comparação de resultados é limitada.

O período determinado de 32 h para se avaliar a resposta do fígado frente ao estresse causado foi baseado no fato de que neste tempo após a operação observa-se o pico máximo de mitose no órgão. Já em sete dias estima-se que o processo regenerativo esteja completo10,18.

A análise da regeneração hepática através da fórmula de Kwon não evidenciou diferenças estatisticamente significantes. Contudo, este resultado pode ser considerado duvidoso. Um trabalho publicado no Journal of Hepatology1 demonstrou que a análise por este método não se mostra eficiente, uma vez que o peso do órgão sofre influência de fatores como o depósito de lipídios, glicogênio e reação inflamatória.

De acordo com um estudo brasileiro2, a avaliação da velocidade de crescimento das figuras de mitose na microscopia óptica por HE não é método com boa acurácia, visto que é impossível evidenciar quais são exatamente as células que entraram no ciclo de divisão celular, em função de que as fases G1, S e G2 do ciclo celular não são identificadas na microscopia óptica. Dessa forma, a análise aqui presente mostra-se também duvidosa, mesmo não apresentando diferença entre os grupos. Já o PCNA tem-se mostrado parâmetro de boa precisão para análise de proliferação celular, inclusive de regeneração hepática após hepatectomia parcial. Ele transforma-se em parâmetro útil para análise da atividade da regeneração hepática21. Comparando os grupos ATX7 e CT7 pelo PCNA observou-se que o grupo em uso da droga obteve resposta regenerativa significativamente maior do que o grupo que não recebeu o fármaco.

Em outro estudo20, usando o sirolimo como droga imunossupressora, foi realizada a leitura de lâminas para a regeneração hepática com o Ki-67 e chegou-se a um valor significativo (p=0,04) na análise entre os grupos controle e estudo após sete dias da hepatectomia parcial, e também a um valor não significativo na análise entre os grupos controle e estudo em 24 h de pós-operatório. Neste aspecto, a regeneração do fígado não se mostra significante em curtos períodos do pós-operatório, como abaixo de 32 h aqui evidenciado.

Utilizando o Tacrolimus para estudo da regeneração hepática4, foram separados grupos para avaliação em 24 h e sete dias após hepatectomia, sendo a imunoistoquímica realizada com KI-67 e PCNA. Concluiu-se que o KI-67 não evidenciou diferenças entre os grupos e o PCNA, por sua vez, sim, corroborando com dados apresentados neste trabalho. Entretanto, contrariando os resultados deste estudo, houve diferença entre os grupos em 24 h. Essa discrepância pode ter ocorrido pela diferença de ação das drogas estudadas.

Pelo fato de os resultados obtidos neste trabalho terem apontado para aumento na taxa mitótica em período mais tardio (sete dias) do que o tempo do pico mitótico normal para os casos de injúria hepática, pode-se levantar a hipótese de que a droga estudada estaria atrasando a atividade celular. Contudo, esta hipótese não é válida, uma vez que para isso as taxas de mitose no tempo de 32 h deveriam ser inferiores no grupo ATX comparado com o CT, o que não foi observado neste estudo.

Uma a duas horas após a hepatectomia parcial ocorre aumento dos fatores de crescimento mitóticos, como o HGF (hepatocyte growth factor), fator de maior potencial mitótico, chegando a valores 20 vezes maiores que os apresentados no pré-operatório11. Três a quatro dias depois da hepatectomia as taxas mitóticas das células hepáticas estão bastante diminuídas, devido ao aparecimento de fatores inibidores de crescimento, como o TGF-β1 (transforming growth factor-β1), o qual é considerado sinal do fim da regeneração do órgão10. Neste período, o fígado atingiu praticamente o seu volume original. Partindo deste conhecimento, parece possível que o ácido tranexâmico atue intervindo nos níveis de fatores de crescimento e inibidores5.

CONCLUSÃO

O modelo experimental com ácido tranexâmico mostrou-se efetivo na regeneração hepática em período mais longo de observação após hepatectomia parcial.

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