versão impressa ISSN 0021-7557versão On-line ISSN 1678-4782
J. Pediatr. (Rio J.) vol.90 no.2 Porto Alegre mar./abr. 2014
http://dx.doi.org/10.1016/j.jped.2013.08.009
A sensibilização a alérgenos inaláveis é um fator de risco para o desenvolvimento de doenças alérgicas como asma e rinite. O conhecimento sobre os alérgenos sensibilizantes e seu grau de exposição nos diferentes ambientes é fundamental para o diagnóstico e tratamento das doenças alérgicas respiratórias. Os ácaros Dermatophagoides pteronyssinus e Blomia tropicalis são são os principais sensibilizantes de pacientes com diagnóstico de asma e rinite alérgica.1 , 2
A participação dos insetos nas reações alérgicas respiratórias é discutida há décadas.3 O inseto mais estudado tem sido a barata, cuja infestação doméstica é causa de asma, sendo considerada questão de saúde pública.4 Há descrições sobre asma e rinite desencadeadas por espécies de moscas e mosquitos como may fly e caddis fly. 5 , 6 Estudo realizado com asmáticos na cidade de São Paulo mostrou positividade ao teste cutâneo alérgico (TCA) com extrato de mosquitos em 32,5% dos casos, e mariposas em 65%.7
Há diversos relatos de indivíduos que, no processo de produção da seda, desenvolveram doenças alérgicas respiratórias. Durante a criação do bicho-da-seda, os trabalhadores estão expostos diretamente aos seus antígenos inaláveis, presentes desde a seleção até a eclosão dos casulos, quando há contato com poeira das asas das mariposas.8 Estes alérgenos podem desencadear sintomas de asma,9 rinite e conjuntivite.10
A mariposa do bicho-da-seda tem reatividade cruzada com outras espécies de mariposas e borboletas, e foi comprovado que pacientes com doenças alérgicas respiratórias podem desenvolver sintomas a partir da exposição ambiental aos seus alérgenos.11 , 12 Concentrações de antígenos de mariposa verificadas por radioimunoensaio em amostras de poeira em ambiente externo (não domiciliar) foram, durante um período de três anos, elevadas e em níveis comparáveis aos de polens. Testes cutâneos com extratos de mariposa em pacientes alérgicos mostraram 45% de reatividade nesta população.13 Em 1997, testes cutâneos alérgicos em crianças atópicas, na cidade de Curitiba, detectaram 38,4% de positividade ao extrato de mariposa (1:20 peso/volume Heterocera), a segunda mais frequente após o ácaro Dermatophagoides pteronyssinus (97,5%). Sugeriu-se que o alto índice de sensibilização à mariposa requeria uma melhor avaliação sobre sua relevância clínica.14
O objetivo deste estudo foi verificar a sensibilização à Bombyx mori por meio de TCA, com antígenos de asas de mariposa do bicho-da-seda e IgE (Imunoglobulina E) específica sérica em crianças com diagnóstico de asma e/ou rinite alérgica.
Estudo analítico transversal por amostragem não probabilística de 99 crianças e adolescentes de ambos os sexos, com diagnóstico de asma e/ou rinite alérgica em acompanhamento no ambulatório de Alergologia do Hospital de Clínicas, Universidade Federal do Paraná, que apresentavam positividade ao TCA para pelo menos um dos seguintes antígenos: Dermatophagoides pteronyssinus, Blomia tropicalis, Blattella germanica, Lolium multiflorum, epitélio de cão ou epitélio de gato.
O diagnóstico e a classificação das doenças alérgicas respiratórias (asma e rinite) seguiram as recomendações dos documentos internacionais: GINA (Global Iniciative for Asthma)15 e ARIA (Rinite Alérgica e seu Impacto na Asma),16 respectivamente.
O extrato alergênico de Bombyx mori foi preparado a partir das asas desta espécie de mariposa do bicho-da-seda, com o seguinte método: o material proveniente do inseto foi macerado com um pilão em um gral de cerâmica, e o conteúdo foi desengordurado com éter etílico. Para extração do antígeno, a medida aproximada de 2 g das partículas do inseto foi colocada em 20 mL de solução tampão estéril fria (PBS), misturada por seis minutos e deixada em repouso por 48 horas a 8 ºC. A mistura foi centrifugada por 15 minutos a 12.000 rotações por minuto, e o sobrenadante purificado com filtros esterilizados de poliestersulfona (Millipore(r)) contendo poros com diâmetros de 0,2 µm. Após provas bacteriológicas de esterilidade, o filtrado foi diluído em glicerina 50%, a 1:20 (peso/volume). Utilizou-se esta concentração final por permitir comparação com os resultados de estudo semelhante realizado em 1997, no qual foram realizados testes cutâneos alérgicos com extrato alergênico padronizado a 1:20 da espécie de mariposa Heterocera sp (Hollister-Stier Laboratories (r) , EUA) em crianças com diagnóstico de asma e rinite alérgica.14 Esta concentração 1:20 é habitualmente usada pelos fabricantes de extratos alergênicos glicerinados para testes cutâneos por puntura.
O extrato alergênico foi acondicionado em frascos com conta-gotas e mantido refrigerado a 4 ºC.17
Todos os indivíduos foram submetidos a TCA com o extrato preparado de Bombyx mori obedecendo à seguinte técnica: foi realizada assepsia da superfície volar do antebraço direito com álcool etílico a 70%; em seguida, foi aplicada uma gota do extrato na pele e o local assinalado com caneta marcadora. O controle positivo foi realizado com histamina na concentração de 10mg/mL (IPI/ASAC, Brasil), e o negativo com solução salina/glicerol a 50% (IPI/ASAC, Brasil), com intervalo de 3 cm de distância entre eles. Utilizou-se técnica de puntura, com agulha estéril de 27 mm superficialmente na pele, em ângulo de 20º. Após 15 minutos, procedeu-se à leitura da reação com auxílio de régua milimetrada. Considerou-se teste positivo quando a média entre os dois diâmetros perpendiculares da pápula foi maior ou igual a 3 mm.18
Amostras de soro foram aliquotadas em tubos Eppendorf a -80°C até a determinação de IgE total e específicas para os alérgenos Bombyx mori, Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Blomia tropicalis, Blattella germanica epitélio de cão e epitélio de gato pelo método ImmunoCAP(r). Cada alérgeno foi acoplado a uma fase sólida por ligação covalente e reagiu com os anticorpos IgE específicos contidos na amostra de soro dos pacientes. No caso da Bombyx mori, o antígeno fixado à fase sólida é derivado das asas desta espécie de mariposa, não sendo disponíveis os componentes alergênicos para este inseto. Em seguida, os anticorpos não-específicos foram eliminados por meio de lavagem e foram adicionados anticorpos anti-IgE ligados à enzima β-galactosidase. Após incubação, os anticorpos (anti-IgE-enzima) não ligados foram eliminados por novo processo de lavagem. O substrato da enzima, contido na solução reveladora (devel- opment), foi adicionado ao meio reacional. Em seguida, a reação foi interrompida pela adição de solução stop e foi medida a fluorescência, que é proporcional à quantidade de IgE específica contida na amostra. A concentração de IgE total foi expressa em kU/L, e para as IgEs específicas em kUA/L.19 Foram considerados positivos os valores acima de 0,7 kUA/L.
O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos do HC-UFPR. Os pais ou responsáveis assinaram termo de consentimento livre e esclarecido, e os participantes maiores de 12 anos, termo de assentimento.
Para análise estatística, utilizou-se o programa Statistica(Statsoft(r)). As medidas de tendência central e de dispersão foram expressas em medianas e valores mínimo e máximo. Foi utilizado o teste não paramétrico de Mann-Whitney para a estimativa da diferença de variáveis de distribuição assimétrica. A estimativa de diferença entre variáveis categóricas foi realizada pelo teste exato de Fisher e Qui-quadrado de Pearson. Foi utilizado modelo de regressão logística univariada para estimar a probabilidade de positividade do TCA de acordo com os níveis de IgE específica para Bombyx mori. Para todos os testes foi considerado um nível mínimo de significância de 5% e poder de teste mínimo de 85%.
A média de idade dos pacientes foi de 10,4 ± 2,2 anos, com intervalo de seis a 15 anos (IC 95% = 9,9-10,8), sendo 61 (61,6%) do sexo masculino. Apresentavam asma 87 pacientes (87,9%), e 95 (95,9%) rinite alérgica. Doze (12,1%) apresentavam somente rinite e quatro (4,0%) somente asma.
Entre os pacientes com asma, 31 (35,6%) foram classificados com a forma intermitente ou leve persistente, 46 (52,9%) moderada persistente e 10 (11,5%) grave persistente. Entre os pacientes com rinite alérgica, 24 (25,3%) apresentavam a forma leve (rinite intermitente ou persistente leve) e 71 (74,7%) persistente moderada/grave.
Sintomas oculares (prurido ocular, lacrimação, hiperemia conjuntival ou congestão) foram relatados por 66,7% dos pacientes. Entre as outras doenças alérgicas, dermatite atópica foi diagnosticada em nove (9,1%) pacientes, e urticária em seis (6,1%).
Apresentaram TCA positivo ao extrato preparado de mariposa 52 pacientes (52,5%), o segundo em frequência após os ácaros poeira: Dermatophagoides pteronyssinus 82 (82,8%), e Blomia tropicalis, 69 (69,7%). Os demais foram barata (Blattella germanica) epitélio de cão, pólen do azevém (Lolium multiflorum) e epitélio de gato, com 17,2%; 16,2%; 15,1% e 12,1% de testes positivos, respectivamente.
Na tabela 1 estão descritas as frequências de positividade ao ImmunoCAP(r), utilizando valor de corte 0,7 kUA/L, assim como os níveis das IgEs específicas e IgE total expressos em mediana (valor mínimo e máximo).
IgE (kUA/l) | n (%) | Medianas (mín-max) | |
---|---|---|---|
Blomia tropicalis | 88 (88,9) | 17,7 | (0- > 100,0) |
Dermatophagoides pteronyssinus | 86 (86,7) | 82,4 | (0- > 100,0) |
Dermatophagoides farinae | 85 (85,8) | 46,2 | (0- > 100,0) |
Bombyx mori | 60 (60,6) | 1,1 | (0- > 100,0) |
Blattella germanica | 47 (47,5) | 0,6 | (0-52,4) |
Epitélio de cão | 22 (22,2) | 0,2 | (0-31,5) |
Epitélio de gato | 16 (16,2) | 0,0 | (0-71,3) |
IgE total (kU/L) | - | 883,0 | (73,9- > 5.000,0) |
Análise de regressão logística univariada mostrou boa relação entre positividade ao TCA e os níveis de IgE específica para Bombyx mori (p = 0,006).
Houve relação entre a positividade do TCA para Bombyx mori e a presença de rinite alérgica (p = 0,04), dermatite atópica (p = 0,03) e urticária (p = 0,02). No entanto, não houve associação com a presença de asma (p = 0,36) ou sintomas oculares (p = 0,14). Da mesma maneira, não se observou diferença conforme a gravidade dos sintomas de asma (p = 0,73) ou de rinite alérgica (p = 0,37).
Quanto à frequência de positividade à Bombyx mori em relação aos demais testes cutâneos, não houve associação significativa (tabela 2).
Alérgenos | TCA Bombyx + | TCA Bombyx – | p |
---|---|---|---|
n = 52 (%) | n = 47 (%) | ||
Dermatophagoides pteronyssinus | 43 (82,7) | 39 (83,0) | 1,00 |
Blomia tropicalis | 36 (69,2) | 33 (70,2) | 1,00 |
Blattella germanica | 08 (15,4) | 09 (19,1) | 0,79 |
Lolium multiflorum | 09 (17,3) | 06 (12,8) | 0,58 |
Epitélio de cão | 11 (21,1) | 05 (10,6) | 0,18 |
Epitélio de gato | 08 (15,4) | 04 (8,5) | 0,36 |
Teste exato de Fisher |
Teste exato de Fisher
A análise dos níveis séricos de anticorpos IgE total e específica em relação ao TCA para Blatella germanica mostrou uma tendência a serem mais elevados em pacientes sensibilizados à mariposa. No entanto, nestes pacientes cujo TCA foi positivo para Bombyx mori (tabela 3), só foram significativamente elevados os níveis de IgE específica sérica para barata e para a própria mariposa.
IgE (kUA/L) | TCA + | TCA – | p | ||
---|---|---|---|---|---|
(n = 52) | (n = 47) | ||||
Dermatophagoides pteronyssinus | 88,8 | (0,0-146,0) | 62,6 | (0,0-144,0) | 0,75 |
Dermatophagoides farinae | 50,3 | (0,0-127,0) | 36,2 | (0,0-126,0) | 0,77 |
Blomia tropicalis | 24,2 | (0,0-113,0) | 11,9 | (0,0-111,0) | 0,07 |
Blattella germanica | 1,0 | (0,0-52,4) | 0,3 | (0,0-37,3) | 0,002 |
Epitélio de cão | 0,2 | (0,0-6,3) | 0,2 | (0,0-31,5) | 0,13 |
Epitélio de gato | 0,0 | (0,0-71,3) | 0,0 | (0,0-32,5) | 0,14 |
Bombyx mori | 3,1 | (0,0-100,0) | 0,4 | (0,0-83,0) | < 0,001 |
IgE Total (kUA/L) | 1107,0 | (73,9-5000,0) | 772,0 | (93,0-5.000,0) | 0,13 |
Teste de Mann-Whitney.
Houve uma maior frequência significativa de positividade às IgEs específicas para epitélio de cão, à Blattella germanica e à própria Bombyx mori (tabela 4).
Alérgenos | TCA + | TCA – | p |
---|---|---|---|
n = 52 (%) | n = 47 (%) | ||
Dermatophagoides pteronyssinus | 45 (52,3) | 41 (47,7) | 1,00 |
Dermatophagoides farinae | 45 (52,9) | 40 (47,1) | 1,00 |
Blomia tropicalis | 48 (54,5) | 40 (45,4) | 0,34 |
Blattella germanica | 30 (63,8) | 17 (36,2) | 0,04 |
Epitélio de cão | 16 (72,7) | 06 (27,3) | 0,05 |
Epitélio de gato | 11 (68,7) | 05 (31,2) | 0,18 |
Bombyx mori | 39 (65,0) | 21 (35,0) | 0,003 |
Teste exato de Fisher.
A prevalência de doenças alérgicas respiratórias aumentou em todo o mundo nas últimas décadas.20 , 21 No Brasil, verificou-se a mesma tendência de crescimento dos sintomas de asma e rinite,22 e o conhecimento sobre os aeroalérgenos sensibilizantes é fundamental para o diagnóstico, o tratamento e a prevenção destes pacientes.2
Os ácaros são as principais fontes alergênicas em pacientes com asma e rinite alérgica.23 , 24 A importância dos antígenos inaláveis de insetos vem sendo discutida há décadas.3 , 7 No estudo, a mariposa foi o segundo aeroalérgeno em frequência de positividade verificada por meio de TCA e IgE específica sérica, o que sugere que este inseto deve ser considerado agente sensibilizante de pacientes com asma e rinite alérgica.
Os participantes do estudo não eram trabalhadores da indústria da seda, portanto, não apresentaram exposição ocupacional à Bombyx mori. Kino e Oshima avaliaram pacientes asmáticos de forma aleatória, e encontraram sensibilização à mariposa e à borboleta por meio de teste intradérmico e RAST no soro em mais de um terço dos casos. Os autores concluem que estes são insetos facilmente atraídos pela luz artificial das residências e podem provocar sensibilização e sintomas de alergia respiratória.11
Grupo de asmáticos sem história de exposição ocupacional (n = 50) apresentou frequência de positividade ao TCA para Bombyx mori de 68%,12 que é mais elevada que a dos pacientes deste estudo (52,5%); em ambos foi utilizado extrato antigênico preparado a partir das asas das mariposas. Esta diferença talvez ocorra porque a população foi estudada no Japão é em menor número, composta por adultos com diferentes hábitos de vida e expostos a clima e ambiente diversos.
Nesta pesquisa, verificou-se que houve relação entre a positividade ao TCA para Bombyx mori e a correspondente IgE específica sérica por ImmunoCAP(r), o que demonstra a efetividade do extrato confeccionado para testar a sensibilização à mariposa. Além disso, nos pacientes que apresentaram TCA positivo, os níveis de IgE específica para Bombyx mori foram mais elevados.
Na avaliação da frequência de positividade à IgE específica para mariposa conforme a gravidade da rinite alérgica, observou-se que pacientes com doença mais grave apresentavam mais IgEs específicas séricas positivas para a mariposa pelo método RAST,25 diferentemente do encontrado para a população do presente estudo, em que houve maior positividade ao TCA para Bombyx mori em pacientes com rinite, mas não apresentou relação com a gravidade dos sintomas. Esta diferença talvez se explique porque foram utilizados métodos diferentes de detecção de IgE específica e o número de participantes incluídos foi maior no estudo realizado no Japão.
Embora o número de pacientes avaliados com dermatite atópica e urticária seja pequeno, foram diagnosticadas mais doenças alérgicas dermatológicas nos reativos à mariposa. Este aspecto poderia ser explorado futuramente, pois há poucos relatos sobre reações alérgicas e irritantes na pele após contato com mariposas.26 , 27
Sabe-se que há reatividade cruzada entre alérgenos de insetos. Foi demonstrado, por ensaio de inibição do RAST, que há reação cruzada entre espécies semelhantes, como mariposa e borboleta,12 e também entre espécies distintas, como mariposa e mosquito.28
As técnicas de alergia molecular permitiram identificar o alérgeno principal da larva de Bombyx mori (Bom m 1), que é constituído pela proteína arginina quinase e apresenta reatividade cruzada com a arginina quinase da barata.29 No estudo, observou-se que os pacientes relativos à mariposa por TCA apresentavam frequência maior de positividade e níveis mais altos de IgEs específicas séricas para a espécie de barata Blattella germanica, o que poderia ser justificado pela reatividade cruzada entre elas. No entanto, o mesmo não ocorreu quando se comparou a positividade aos testes cutâneos entre mariposa e barata, porém não foi feita análise imunoquímica destes alérgenos.
Por outro lado, testes de inibição com extratos de mariposa e ácaro revelaram diferenças entre os seus anticorpos, provando não existir reatividade cruzada entre os mesmos.12 No estudo, não houve associação entre a frequência de reatividade cutânea pelo TCA aos antígenos de mariposa e ácaros (Dermatophagoides pteronyssinus e Blomia tropicalis). Da mesma forma, não houve associação entre positividade ao TCA para e a presença de IgE específica sérica para ácaros (Dermatophagoides pteronyssinus e Blomia tropicalis) porque provavelmente não há reatividade cruzada entre eles.
Na China, identificou-se outro componente alergênico da Bombyx mori(Bom m 7), também obtido da larva deste inseto, mas composto pela proteína tropomiosina,30 considerada um panalérgeno capaz de apresentar ampla reatividade cruzada com componentes de outros insetos, como Der p 10 (proveniente do ácaro Dermatophagoides pteronyssinus) e Bla g 7 (proveniente da barata Blattella germanica).31 , 32 Portanto, para se verificar sensibilização alérgica verdadeira ou reatividade cruzada, em estudos futuros deve-se utilizar diagnóstico baseado em alergia molecular, mas com componentes alergênicos da mariposa, e não da larva da Bombyx mori, como causa de sintomas alérgicos respiratórios.33 , 34
Este estudo foi o primeiro sobre sensibilização à mariposa do bicho-da-seda realizado no Brasil, e mostrou a importância da Bombyx mori como alérgeno sensibilizante de escolares e adolescentes com diagnóstico de doenças alérgicas respiratórias (asma e/ou rinite). Alta frequência de sensibilização à Bombyx mori foi encontrada nos pacientes avaliados por meio de TCA com extrato preparado a partir das asas das mariposas, e estes resultados foram confirmados por meio do ImmunoCAP(r), método consagrado de detecção de IgE específica sérica.
O reconhecimento deste aeroalérgeno (mariposa) junto aos demais grupos que compõem o perfil de sensibilização alérgica nesta população deverá tornar o tratamento destes pacientes mais eficiente, na medida em que permitirá ajustes nas orientações sobre controle ambiental e, futuramente, proporcionará novas opções de imunoterapia específica.