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Alterações citogenéticas e moleculares em leucemia mieloide aguda: revisão e descrição de casos

Alterações citogenéticas e moleculares em leucemia mieloide aguda: revisão e descrição de casos

Autores:

Elvira Deolinda Rodrigues Pereira Velloso,
Carlos Henrique Ares Silveira da Motta,
Juliana Braga Furtado,
Nydia Strachman Bacal,
Paulo Augusto Achucarro Silveira,
Cynthia Bachir Moyses,
Roberta Sitnik,
João Renato Rebello Pinho

ARTIGO ORIGINAL

Einstein (São Paulo)

versão impressa ISSN 1679-4508versão On-line ISSN 2317-6385

Einstein (São Paulo) vol.9 no.2 São Paulo abr./jun. 2011

http://dx.doi.org/10.1590/s1679-45082011ao2041

INTRODUÇÃO

As leucemias mieloides agudas (LMAs) são um grupo heterogêneo de doenças neoplásicas com grande variabilidade no curso clínico e resposta a terapêutica, assim como em sua base genética e molecular (mais de 300 translocações cromossômicas e mutações gênicas já foram descritas). Acredita-se que mais de um evento mutagênico seja necessário para a gênese da doença, envolvendo mecanismos de proliferação celular (mutações de classe I, como exemplos BCR-ABL, FLT3, Alterações citogenéticas e moleculares em leucemia mieloide aguda 185 RAS, c-Kit, PTPN11, NF1, TEL-PDGRß ) e bloqueio da diferenciação (mutações de classe II, como exemplos CBFß-MYH11, AML1-ETO, TEL-AML1, PML-RARA, MLL, NUP98-HOXA9, PU.1, C/CEP α, AML1, AMLAMP19, CEBPA, NPM1 )(1,2).

Associada ao fator idade, as alterações citogenéticas e moleculares presentes ao diagnóstico são as principais variáveis relacionadas ao prognóstico na LMA. Até cinco anos atrás, as anormalidades citogenéticas definiam três grupos de risco para portadores de LMA com idade inferior a 60 anos. Aproximadamente 25% dos pacientes pertenciam ao grupo de risco favorável, apresentando t(15;17), t(8;21) e inv(16); 25 a 30% ao de risco desfavorável, envolvendo rearranjos gênicos MLL, t(6;9), t(9;22), monossomia/deleções dos cromossomos 5 e 7, inv(3)(q21q26) e cariótipos complexos. Finalmente, 50 a 60% dos pacientes eram portadores de risco intermediário, envolvendo t(9;11), +8, -Y e cariótipo normal, este último correspondendo a até 50% dos casos(35). A estimativa de sobrevida de 5 anos para portadores de subtipos citogenéticos de risco bom, intermediário e desfavorável foi estimada em 55, 38 e 11% em casuística compreendendo 609 pacientes com LMA e idade inferior a 60 anos(4).

Pacientes mais idosos apresentam classicamente maior porcentagem de anormalidades citogenéticas de mau prognóstico (até 51%) e menor porcentagem de bom prognóstico (cerca de 4%)(6). A partir dos 60 anos, nota-se um nítido decaimento nas curvas de sobrevida para o mesmo subtipo citogenético, à exceção da leucemia promielocítica aguda (LPA), conforme trabalho compreendendo 1.225 portadores de LMAs(5). Também Farag et al. mostraram que para a população acima de 60 anos e tratados com esquemas quimioterápicos clássicos, apenas 6% estavam vivos após 5 anos(7,8).

Nos últimos anos, uma série de anormalidades genéticas foram descobertas nas LMAs com cariótipo normal, particularmente mutações nos genes NPM1 (nucleofosmina), FLT3 (fms-related tyrosine kinase 3); CEPBA (CCAAT/enhancer binding protein α); MLL PTD (myeloid-lymphoid ou mixed-lineage leukemia), NRAS-(neuroblastoma RAS viral oncogen), BAALC (brain and acute leukemia gene), ERG (v-ets erytroblastosis virus E26 oncogene-like ), entre outros(9). Aproximadamente 45% dos casos de LMA possuem cariótipo normal, sendo que, dentre estes, as mutações dos genes NPM1 e FLT3 são as mais prevalentes, correspondendo, respectivamente, a 45 a 55% e a 35 a 45% dos casos(10).

O gene FLT3, localizado no cromossomo 13q12, codifica um receptor com atividade tirosina-quinase relacionado à ativação de vias de sinalização celular responsáveis pela proliferação celular, sendo este normalmente muito expresso em estágios iniciais de células precursoras mieloides. Mutações do tipo FLT3-ITD consistem em inserções em tandem de comprimento variável na região que codifica o domínio justamembrana do receptor. Já a mutação FLT3-TKD é do tipo pontual e afeta o domínio tirosina-quinase. Ambas as mutações resultam em constante atividade tirosina-quinase. A primeira mutação possui frequência de 35 a 45% dos casos de LMA com cariótipo normal, já a segunda apresenta frequência inferior a 5%(10).

O gene NPM1, localizado no cromossomo 5q35, codifica uma fosfoproteína nucleolar que realiza o transporte entre o núcleo e o citoplasma, e está envolvida diretamente na regulação e estabilidade de proteínas nucleares. A mais frequente mutação consiste na duplicação de quatro pares de bases no éxon 12 (85% dos casos), mas também podem ocorrer outros tipos de inserção de quatro pares de bases na mesma região. Essa mutação causa a localização aberrante da proteína NPM1 no citoplasma(11).

Trabalhos têm demonstrado que as LMAs com cariótipo normal e mutação nos genes NPM1 e CEBPA, ou em ambos, possuem prognósticos favoráveis, enquanto que mutações no gene FLT3 possuem prognóstico desfavorável. Já os casos em que ocorrem mutações simultâneas nos genes FLT3 e NPM1 possuem prognóstico intermediário(12).

Baseando-se nesses conhecimentos, a Organização Mundial da Saúde (OMS), em 2008, classificou a LMA em vários grupos, incluindo as LMAs com anormalidades genéticas recorrentes, que abrangem nove subtipos, sendo dois deles entidades ainda provisórias (Quadro 1)(13,14).

Quadro 1 Classificação da Organização Mundial da Saúde, 2008, para as leucemias mieloides agudas 

LMA com anormalidades genéticas recorrentes
LMA com t(8;21)(q22;q22)-RUNX1T1-RUNX1
LMA com inv(16)(p13.1q22) ou t(16;16)(p13.1;q22)-CBFß-MYH11
Leucemia promielocítica aguda com t(15;17)(q22;q21)-PML-RARA
LMA com t(9;11)(p22;q23)-MLLT3-MLL
LMA com t(6;9)(p23;q34)-DEK-NUP214
LMA com inv(3)(q21;q26.2) ou t(3;3)(q21;q26.3) RPN1-EVI1
LMA (megacarioblástica) com t(1;22)(p13;q13)-RBM15-MKL1
LMA com mutação NPM1- entidade provisória
LMA com mutação CEBPA- entidade provisória
LMA com alterações relacionadas à mielodisplasia
Neoplasias mieloides relacionadas à terapêutica
LMA não especificadas
Sarcoma mieloide
Proliferações mieloides relacionadas à síndrome de Down
Neoplasia de célula dendrítica plasmocitoide blástica

LMA: leucemia mieloide aguda.

Assim, novos grupos de risco genético têm sido definidos recentemente para LMA, conforme mostra o quadro 2.

Quadro 2 Classificação da leucemia mieloide aguda em 2010, de acordo com subtipo citogenético e molecular(14) 

Favorável t(15;17)(q22;q21)- PML-RARA
t(8;21)(q22;q22)-RUNX1T1-RUNX1
inv(16)(p13.1q22) ou t(16;16)(p13.1;q22)-CBFß-MYH11
NPM1 mutado e sem FLT3-ITD (cariótipo normal)
Intermediário I CEBPA mutado (cariótipo normal)
NPM1 mutado e com FLT3-ITD (cariótipo normal)
NPM1 selvagem e com FLT3-ITD (cariótipo normal)
NPM1 selvagem e sem FLT3-ITD (cariótipo normal)
Intermediário II t(9;11)(p22;q23)-MLLT3-MLL
Anormalidades citogenéticas não favoráveis ou desfavoráveis
Desfavorável inv(3)(q21;q26.2) ou t(3;3)(q21;q26.3) -RPN1-EVI1
t(6;9)(p23;q34)- DEK-NUP214
t(v;11)(v;q23)- rearranjo MLL
-5/5q-, –7/7q
Cariótipo complexo

Outras anormalidades genéticas não computadas no quadro 2 também parecem predizer sobrevida. Mutações no gene c-Kit parecem se associar à pior prognóstico nas LMAs com t(8;21) ou inv(16), também denominadas LMAs CBF (core binding factor ) (2,15). Também cariótipo monossomal definido como o cariótipo com duas ou mais monossomias autossômicas ou uma monossomia autossômica associada à anormalidade estrutural tem sido associado ao pior grupo de risco(16,17).

A citometria de fluxo multiparamétrica é essencial na caracterização das neoplasias mieloides e analisa grande volume de células em curto período de tempo, caracterizando vários antígenos por célula. A identificação de antígenos de diferenciação leucocitária, na membrana e intracitoplasmática, possibilita detectar fenótipos mistos, aberrantes e acompanhar doença residual mínima. A expressão de certos antígenos, como CD7, CD11b, CD14, CD56 e CD34 pode estar associada a prognósticos adversos. Fenótipos aberrantes são encontrados em pelo menos 75% das LMAs(13). A imunofenotipagem mostra características peculiares na LMA com NPM1 mutado, ou seja: expressão antigênica de CD13, CD33 e MPO concomitante com expressões de antígenos monocíticos CD14 e CD11b, e ausência de expressão de CD34(13).

OBJETIVO

Estudar a frequência de mutações, que podem configurar bom ou mau prognóstico, bem como sua relação com estudo de cariótipo e imunofenotípico, em portadores de LMA.

MÉTODOS

O Laboratório de Técnicas Especiais do Hospital Israelita Albert Einstein (HIAE) recebe amostras de portadores de LMA para realização de estudos imunofenotípicos, citogenéticos e moleculares, procedentes de diversos centros de tratamento. A partir de 2009, após a assinatura de termo de consentimento livre e esclarecido, 30 amostras de medula óssea procedentes de pacientes com LMA recém-diagnosticada ou em recaída foram submetidas à pesquisa das mutações FLT3-ITD, FLT3-TKD e NPM1. Todas as amostras foram submetidas a estudo imunofenotípico e 25 delas a estudo cariotípico.

O estudo imunofenotípico foi realizado utilizando células marcadas com anticorpos monoclonais para painel proliferativo (CD2, CD4, CD7, CD10, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD34, CD56, CD64, CD71, CD117, HLADR, glicoforina A, CD3 c, MPOc, TdT e CD79a). Após o preparo com cloreto de amônia (tampão hemolítico), foi realizada análise em citômetro de fluxo (Epics XLMCL ou FC-500 – Beckman Coulter).

O estudo citogenético foi realizado em culturas de 24 e 48 horas, sem agentes estimulantes, submetidas a bandamento G e descritas conforme nomenclatura internacional (ISCN 2009).

Para análise das mutações nos genes FLT3 e NPM1, o DNA das amostras foi extraído pelo kit QIAmp DNA Blood Mini Kit (Quiagen), purificado (EXOSAP) e submetidos a PCR para amplificação, utilizando primers específicos e marcados para as mutações FLT3-ITD (éxon 14/15) e NPM1. Eletroforese capilar foi utilizada para análise do FLT3-ITD e NPM1 por tamanho de fragmento. Para a pesquisa das mutações FLT3-TKD, foi realizada nova reação de PCR com primers específicos para a realização de Nested-PCR, seguido de sequenciamento. A análise da mutação FLT3-ITD e NPM1 foi realizada no software GeneMapper, e os sequenciamentos no SeqScape.

RESULTADOS

O quadro 3 mostra a descrição dos achados imunofenotípicos, moleculares e cariotípicos.

No total de casos estudados, observamos a presença de mutação no gene NPM1 em 10 das 30 amostras (33,3%), sendo a mesma frequência para a mutação FLT3-ITD. A coexistência de ambas ocorreu em seis casos. Nenhuma amostra se mostrou positiva para mutação FLT3-TKD.

Das 25 amostras que tiveram seus cariótipos analisados, 10 apresentaram-no normal (40%). Quando analisamos apenas os cariótipos normais, 50% possuíam mutação no gene NPM1 e 40% a mutação FLT3-ITD. A presença concomitante de ambas foi diagnosticada em 30% desses casos.

Quadro 3 Relação de todos os pacientes analisados, com os resultados imunofenotípicos, mutações FLT3-ITD e NPM1 e cariótipo 

NÚMERO SEXO IDADE NPM1 FLT3 CARIÓTIPO Classiifcação genética Linhagem (CD) Maturação (CD) Imaturidade Ativação Proliferação Linhagem B (CD) Linhagem T/NK (CD)
ITD prognóstica 13 33 117 MPO 11b 11c 15 14 15/64 4 Tdt 38 HLA-DR 71 19 20 22 79a 2 7 56
1 FEM 65 POS POS 46,XX[20] intermediário-1 POS POS POS NEG POS NEG POS NEG - POS NEG NEG POS POS NEG NEG - - NEG POS POS NEG
2 FEM 34 POS POS 46,XX[20] intermediário-1 POS POS NEG - POS POS POS NEG - - NEG - POS NEG POS - - - - NEG NEG NEG
3 FEM 30 POS POS 46,XX[20] intermediário-1 POS POS POS POS NEG POS POS NEG - POS NEG - POS POS POS NEG - - NEG NEG NEG NEG
4 MASC 30 POS NEG 46,XY[20] favorável POS POS POS POS NEG POS POS NEG - POS NEG - POS NEG POS NEG - - NEG NEG NEG NEG
5 FEM 48 POS NEG 46,XY[20] favorável POS POS POS POS NEG POS POS NEG - NEG POS - POS POS NEG NEG - - NEG NEG POS NEG
6 FEM 72 NEG POS 46,XX[20] intermediário-1 POS POS POS POS - POS POS NEG - NEG POS - POS POS POS NEG - - NEG NEG NEG NEG
7 FEM 57 NEG NEG 46,XX[20] intermediário-1 POS POS POS POS NEG POS POS NEG - NEG POS - POS POS POS - - - NEG NEG NEG NEG
8 FEM 32 NEG NEG 46,XX[20] intermediário-1 POS POS POS POS POS POS POS NEG - POS NEG - POS POS POS NEG - - NEG NEG NEG NEG
9 MASC 73 NEG NEG 46,XY[20] intermediário-1 POS POS POS POS POS NEG POS NEG - POS NEG - POS POS POS NEG - - NEG NEG POS NEG
10 FEM 44 NEG NEG 46,XX, inv (9) (p12q13)[20] intermediário-1(variante normal) POS POS POS POS NEG NEG NEG NEG - NEG POS NEG POS NEG POS NEG - - NEG NEG NEG NEG
11 FEM 30 NEG POS 46,XX, t(15;17)(q22;q21) [14] favorável (LPA) POS POS POS POS NEG NEG POS NEG - NEG POS NEG POS NEG POS NEG - - NEG POS NEG NEG
12 FEM 11 NEG POS 46,XX,t(15;17)(q22;q21)[16]/46,XX[4] favorável (LPA) POS POS POS POS NEG NEG NEG NEG - NEG NEG - FOG- NEG POS POS NEG NEG NEG NEG NEG NEG
13 FEM 30 NEG NEG 46,XX,t(15;17)(q22;q21)[7],46,XX[13] favorável (LPA) POS POS POS POS NEG NEG NEG NEG - NEG NEG - POS NEG NEG NEG - - NEG NEG NEG NEG
14 FEM 27 NEG NEG 46,XX,t(15;17)(q22;q21) [20] favorável (LPA) POS POS POS POS NEG NEG NEG NEG - NEG NEG - POS NEG NEG NEG - - NEG NEG NEG NEG
15 FEM 66 NEG NEG 46,X,del(X)(q24),t(4;21;8)(q21;q22;q22)[21] favorável (variante (8;21)) NEG POS POS NEG NEG POS POS NEG - POS NEG - POS POS NEG NEG - - NEG NEG NEG POS
16 MASC 11 NEG NEG 46,XY, del(16)(q22)[20] intermediário-2 POS POS POS POS NEG NEG NEG NEG - NEG POS - POS POS- POS NEG - - NEG NEG NEG NEG
17 FEM B NEG NEG 46,XX, add(2)(q37)[20] intermediário-2 POS POS POS POS NEG NEG NEG NEG - NEG POS - POS POS NEG NEG - - NEG NEG NEG POS
18 MASC 59 NEG NEG 46,XY,del(3)(p21)[18] intermediário-2 NEG POS NEG - NEG NEG NEG NEG - NEG NEG - POS NEG POS NEG - - - POS POS NEG
19 FEM 48 POS POS 47,XX,+5[3]/46,XX[17] intermediário-2 POS POS POS POS NEG NEG NEG NEG - POS POS - POS POS POS NEG - - NEG NEG NEG NEG
20 FEM 68 NEG NEG 46,XX,t(6;19)(q 16;p 12) [5]/46,X[15] intermediário-2 POS POS POS NEG NEG POS NEG NEG - NEG NEG - POS POS POS NEG - - NEG NEG POS NEG
21 MASC 61 NEG NEG 46,XY,t(3;3)(q21;q26)[19]/46,XY[1] desfavorável POS POS POS NEG POS NEG NEG NEG - NEG POS POS POS POS POS NEG - - NEG NEG POS NEG
22 MASC 15 NEG NEG 46,XY,t(6;9)(p23;q34)[20] 46,XY, inv(9) desfavorável POS POS NEG - POS POS POS NEG - POS NEG - POS POS NEG NEG - - - NEG NEG NEG
23 MASC 9 NEG NEG p21q13), t(11;?)(q23;?) [19] desfavorável POS POS POS NEG NEG NEG NEG NEG - NEG POS - POS POS POS NEG - - NEG NEG NEG NEG
24 FEM 61 NEG NEG 46,XX,del(7)(q21)[7]/46,XX[13] desfavorável POS POS POS POS NEG NEG NEG NEG - POS POS - POS NEG NEG NEG - - NEG NEG NEG POS
25 MASC 20 NEG NEG 46,XY,t(9;18)(q34;q22),t(13;20)(q12;q13.2)[15]/46,XY[5] desfavorável POS POS POS - - POS POS NEG - POS POS - POS POS POS NEG - - - NEG NEG POS
26 MASC 61 POS POS - POS POS NEG POS NEG NEG NEG NEG - NEG NEG - NEG NEG NEG NEG - - NEG NEG NEG POS
27 FEM 89 POS POS - POS POS POS NEG NEG NEG NEG NEG - NEG POS - POS POS POS NEG - - NEG NEG POS NEG
28 FEM 51 POS NEG - POS POS POS POS POS POS POS NEG - POS NEG - POS POS POS NEG - - NEG NEG POS NEG
29 FEM 94 POS NEG - POS POS POS NEG NEG NEG NEG NEG - NEG POS - POS POS POS NEG - - NEG NEG POS NEG
30 FEM 61 NEG POS - POS POS POS POS - NEG POS NEG - NEG POS - POS POS POS NEG - - NEG NEG POS NEG

Dentre as 15 amostras diagnosticadas com cariótipo anormal, 4 delas apresentaram cariótipos com a t(15;17) e 1 com variante t(8;21), consideradas de bom prognóstico. Cinco amostras apresentaram cariótipos de prognóstico desfavorável, sendo estes de t(3;3), t(6;9), del(7) (q21), rearranjo 11q23 e um complexo. Ainda foram registrados mais cinco casos considerados de prognóstico intermediário, como del(16)(q22), add(2)(q37), del(3) (p21), trissomia do 5 e t(6;19).

Três casos com cariótipo anormal também apresentaram alterações moleculares, sendo dois casos com t(15;17) e mutação FLT3-ITD e um de trissomia do 5 com FLT3-ITD e NPM1 mutado.

Segundo nosso estudo, dos 25 casos com estudo cariotípico, 28% dos casos foram classificados como de prognóstico favorável, sendo, dentre estes, 8% com cariótipo normal e NPM1 mutado e 20% com cariótipo anormal (16% t(15;17) e 4% t(8;21)). 32% foram classificados como intermediário-1, todos estes com cariótipo normal e 12% NPM1 mutado e FLT3-ITD, 4% FLT3-ITD e 16% selvagem para ambas mutações. Os demais casos, todos com cariótipo anormal, foram estratificados como intermediário-2 (20%) e desfavoráveis (20%) (Figura 1).

Figura 1 Frequência dos prognósticos segundo a classificação das leucemias mieloides agudas de acordo com os subtipos citogenéticos e moleculares 

O estudo imunofenotípico mostrou que 18 casos (60%) apresentavam expressão de antígenos de linhagem não mieloide: CD7 em 10 casos, CD56 em 5 casos e CD11b em 7 casos, sendo que 4 casos apresentaram concomitância de CD7 e CD11b. A expressão do CD56 foi detectada em 16,6% dos casos de LMA e em 20% dos casos com mutação de FLT3.

Os estudos imunofenotípicos dos 4 casos com mutação do NPM1 e FLT3 selvagem (2 com cariótipo normal e 2 sem estudo cariotípico) mostraram, em 2 deles, ausência de expressão de CD34. Dos 6 casos com genótipo NPM1 mutado e FLT3-ITD (3 com cariótipo normal, 1 com cariótipo anormal e 2 sem estudo cariotípico), 4 deles apresentaram ausência de expressão de CD34. Apenas 1 dos 4 casos de genótipo FLT3-ITD e NPM1 selvagem (1 com cariótipo normal, 2 com t(15;17) e 1 sem estudo cariotípico) mostrou ausência da expressão de CD34.

DISCUSSÃO

Apesar de termos estudado um pequeno número de amostras de portadores de LMA, a frequência observada de mutações em FLT3 e NPM1 foi semelhante àquelas relatadas na literatura, tanto para todos os subtipos de LMA, como para as LMAs com cariótipo normal.

Em trabalho utilizando casuística nacional, foi observado o total de 43,7% de mutações em NPM1 no subtipo de LMA com cariótipo normal, frequência semelhante à observada por nós(18). A presença de mutação FLT3-ITD de 33,3% foi um pouco superior a relatada por Lucena-Araujo (23,6%), sendo essa mutação observada nos vários subtipos de LMA, incluindo na LPA, dados também concordantes com a literatura internacional e nacional(18,19).

Não foi detectada mutação do tipo TKD, o que corrobora o achado menos prevalente dessa mutação em casuísticas brasileiras quando comparadas às americanas e europeias(1820).

Em relação ao estudo imunofenotípico, a pequena casuística prejudicou a comprovação de dados citados na literatura, como a menor frequência de expressão de CD56 no subtipo com FLT3 mutado, e a ausência da expressão de CD34 e HLA-DR nas LMAs com NPM1 mutado. Neste estudo, a frequência da expressão de CD56 foi semelhante à observada na LMA com mutação FLT3 e também um dos portadores de LMA NPM1+/FLT3- apresentou células blásticas com expressão de CD34 e HLA-DR.

Pelo exposto, pode-se inferir que a rotina diagnóstica deve incorporar novos marcadores genéticos para a correta estratificação prognóstica e orientação terapêutica das LMAs.

CONCLUSÃO

A frequência observada das mutações em FLT3 e NPM1 nessa casuística foi semelhante àquelas da literatura, sendo capaz de identificar um subgrupo de casos com cariótipo normal NPM1+/FLT3-, reconhecido atualmente como de bom prognóstico.

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