Análise de IgA do colostro contra bactérias envolvidas em infecções neonatais

Análise de IgA do colostro contra bactérias envolvidas em infecções neonatais

Autores:

Elizabeth Moreira Dias,
Denise Bertulucci Rocha Rodrigues,
Vinícius Rangel Geraldo-Martins,
Ruchele Dias Nogueira

ARTIGO ORIGINAL

Einstein (São Paulo)

versão impressa ISSN 1679-4508versão On-line ISSN 2317-6385

Einstein (São Paulo) vol.15 no.3 São Paulo jul./set. 2017

http://dx.doi.org/10.1590/s1679-45082017ao3958

INTRODUÇÃO

Infecções bacterianas neonatais ainda são a principal causa de morbimortalidade no período neonatal. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, 6,3 milhões de crianças com menos de 5 anos morreram em 2013, e 45% dos óbitos ocorreram no período neonatal. (1) No Brasil, cerca de 60% da mortalidade infantil deve-se a infecções bacterianas. (2)

A maior suscetibilidade a infecções bacterianas neonatais é justificada pela imaturidade imunológica relativa de recém-nascidos, (3) consequência direta do ajuste imunológico no período de transição entre as vidas intra- e extrauterina. (4) A ontogenia do sistema imunológico começa no embrião e continua durante a vida fetal, mas apenas se completa alguns anos após o nascimento. (5) Porém, certas práticas hospitalares, maternais e obstétricas podem contribuir para a ocorrência de contaminação bacteriana, que resulta em infecções gastrintestinais e respiratórias, (6) sepse neonatal e envolvimento sistêmico. (2)

A sepse neonatal, terceira causa mais comum de morte precoce, é responsável por 500 mil mortes por ano. (7,8) Os patógenos isolados com mais frequência, envolvidos em infecções neonatais, são Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli , Salmonella enteritidis e Staphylococcus aureus . (8)

Embora E. coli colonize o trato gastrintestinal no neonato dentro de algumas horas de vida e desenvolva uma relação mutualista com seu hospedeiro, (9) esta espécie é a mais frequentemente envolvida na sepse neonatal. (10,11) Alguns sorotipos de E. coli , como o enteropatogênico, entero-hemorrágico, enteroagregativo e enterotoxigênico, já foram descritos como principais causa de diarreia em crianças com menos de 1 ano de idade. (12) O sorotipo O6 da E. coli também já foi detectado em diversos casos de meningite (13) e sepse neonatais. (14) Outra relevante bactéria associada a infecções gastrintestinais neonatais é a S. enteritidis , que geralmente aparece após a primeira semana de vida e causa gastrenterite aguda e sérias complicações para o recém-nascido, como sepse e/ou meningite. (15)

S. aureus também está associada a inúmeras infecções durante o período neonatal, como sepse neonatal de início tardio, (8) impetigo, (16) artrite e osteomielite. (17) Antígenos de virulência da S. aureus estão predominantemente relacionados à superfície bacteriana, como polissacarídeos capsulares, ácido teicoico, peptidoglicanos, adesinas, proteína A e toxinas. (18) K. pneumoniae é um patógeno oportunista causador de pneumonia, bacteremia e infecções do trato urinário, (19) tendo já sido relatada como um agente comum em casos de sepse neonatal. (20) Também está associada a alta mortalidade, muitas vezes por meio de cepas multirresistentes a antibióticos associados à produção de betalactamase. (20)

Após o nascimento, com a interrupção da transferência de IgG via cordão umbilical, a mãe pode fornecer outra forma de proteção passiva ao recém-nascido por meio do aleitamento materno, que possui atributos protetores inquestionáveis associados à redução do risco de infecção neonatal, (3,21) já que contém diversos componentes imunes, como a IgA secretora (IgAS). (22) A presença de IgAS representa a primeira linha de defesa das membranas mucosas, oferecendo proteção contra infecções e revestimento às superfícies mucosas, prevenindo a adesão e a invasão de microrganismos nos tecidos. (3,21,23)

Embora a amamentação exclusiva seja recomendada e praticada, alguns recém nascidos em amamentação podem desenvolver infecções bacterianas durante o período neonatal. Há evidências de que as crianças, apesar de serem amamentadas, podem desenvolver diarreia por Campylobacter , devido à falta de anticorpos específicos contra antígenos de virulência para esta bactéria no colostro. (23) Deste modo, é necessário determinar, em amostras de colostro, a presença de IgA específica contra extratos de bactérias geralmente envolvidas em infecções neonatais, como S. aureus , K. pneumoniae, S. enteritidis e E. coli.

OBJETIVO

Descrever e comparar a especificidade de anticorpos IgA de amostras de colostro contra extratos bacterianos de Klebsiella pneumoniae , Staphylococcus aureus , Escherichia coli e Salmonella enteritidis.

MÉTODOS

Foram incluídas 48 mulheres mediante consentimento. O Comitê de Ética aprovou o estudo CAAE: 02166713.4.0000.5145. Apenas mães saudáveis, 12 horas após o parto, foram incluídas na coleta. Informações sobre dados médicos e socioeconômicos das gestantes e do período gestacional foram obtidas por entrevistas. As amostras de colostro foram coletadas por expressão manual diretamente em tubos de polipropileno estéreis do tipo Falcon. As amostras foram obtidas e transportadas em gelo para o laboratório, centrifugadas a 1.300g por 7 minutos para remoção dos componentes lipídicos e mantidas a -80°C até o momento do uso.

Western blotting da IgA do colostro contra bactérias

Extratos de S. aureus (ATCC 25923), K. pneumoniae (ATCC 13883), S. enteritidis (ATCC 13076) e E. coli (ATCC 11303) foram obtidos de culturas recentes, conforme descrito. (20) Foram separados por SDS-page 6% 17µg de extratos e transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas foram incubadas com as amostras de colostro (1:1.000). Após a lavagem, receberam uma solução de IgA anti-humana de cabra conjugada a HRP (Sigma), revelada pelo sistema ECL (Amersham Biosciences Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino Unido) e exposta em biofilme por 5 minutos.

Os filmes de raio X revelados foram escaneados em um densitômetro (Bio-Rad GS-700 Imaging Densitometer), e as imagens foram avaliadas com o software ImageQuant (Amersham Biosciences) para analisar padrões de reconhecimento de antígenos, incluindo o número e a intensidade das bandas reativas. Os sinais foram convertidos em contagens absolutas por comparação com os padrões na mesma membrana. Sinais não detectados foram registrados como zero. Um valor do filme em branco foi subtraído do valor da banda reativa.

Algumas membranas foram incubadas com tampão de bloqueio sem amostras para obtenção do controle negativo. Como controle positivo, as membranas foram incubadas com amostras de saliva, cujos padrões de reação com extratos de antígeno tinham sido previamente medidos. As bandas reativas representam a presença de IgA específica para proteínas separadas pela SDS page de cada extrato de bactéria.

Análise estatística

O número médio de bandas de IgA e valores de densitometria da Ags reativa foram determinados e comparados entre as bactérias por meio de Análise de Variância (ANOVA). As frequências de IgA reativa positiva para antígenos foram avaliadas pelo teste χ 2 . As correlações entre anticorpos IgA e a específica para antígenos foram testadas pela análise de Pearson. Valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

RESULTADOS

As mães estavam saudáveis e não houve complicações durante e nem após o parto. A média de idade das pacientes era 25,2±3,3 anos. Não houve diferenças entre perfis raciais (p>0,05). Todos os bebês nasceram a termo (>37 semanas de gestação). Não foram achadas associações entre níveis de imunoglobulina e dados sobre etnia, idade da mãe, tipo de parto e caráter socioeconômico (Pearson, p>0,05). Também não foram achadas diferenças estatisticamente significativas entre níveis de imunoglobulina e tipo de parto: cesariana ou normal (p>0,05).

Especificidade da resposta da IgA contra extratos bacterianos

Exemplos de imunoensaios de amostras com resposta positiva da IgA contra os antígenos bacterianos estão representados na figura 1 . As frequências de amostras com respostas positivas (com pelo menos uma banda detectável) e negativas às quatro cepas estão demonstradas na tabela 1 . A maioria das amostras mostrou IgA reativa contra S. aureus , seguida de S. enteretidis , E. coli e K. pneumoniae ( Tabela 1 ). O número de amostras com respostas positivas a S. aureus mostrou-se estatisticamente mais alto do que a outras bactérias ( Tabela 1 ; p<0,05; q>15,00).

Figura 1 Padrões de IgA reativa contra antígenos de Staphylococcus aureus , Klebsiella pneumoniae , Salmonella enteritidis e Escherichia coli em amostras de colostro. Identidades dos extratos de antígeno estão acima de cada coluna. Tamanhos moleculares padrão (kDa) estão indicados à esquerda dos imunoblots 

Tabela 1 Intensidade e frequência de IgA reativa a Staphylococcus aureus , Klebsiella pneumoniae , Salmonella enteritidis e Escherichia coli e antígenos detectados nas amostras de colostro 

Extratos bacterianos e peso molecular (kDa) Número de amostras com respostas Média da intensidade total da reatividade da IgA do colostro ± DP

Positiva n (%) Negativa n (%)
Staphylococcus aureus 45 (93,8) *†‡ 3 (6,2) *†‡ 410,7±186,3 §¶||
230 26 (57,8) 48,5±41,9
221 18 (40,0) 33,6±41,6
208 25 (55,6) 46,7±42,2
185 17 (37,8) 31,7±41,2
Salmonella enteritidis 30 (62,5) 18 (37,5) 217,8±186,3 §¶||
244 16 (53,4) 31,6±30,3
220 16 (53,4) 30,2±29,7
176 14 (46,7) 27,0±29,4
144 15 (50,0) 28,4±29,6
Klebsiella pneumoniae 27 (56,3) 21 (43,7) 133,2±101,9 ¶#
244 10 (37,0) 16,7±22,2
229 7 (25,9) 12,0±20,7
203 7 (25,9) 10,9±19,6
194 7 (25,9) 12,5±21,9
73 8 (29,6) 13,9±22,4
6 8 (29,6) 13,3±20,9
Escherichia coli 29 (60,4) * 19 (39,6) * 251,8±129,9 ||#
238 12 (41,4) 27,7±33,6
16 15 (51,7) 34,6±34,0
202 15 (51,7) 32,7±23,8
62 13 (44,8) 30,0±33,9

* χ 2: p=0,001, q=15,10; χ 2: p=0,001, q=18,00; χ 2: p=0,001, q=17,10; § ANOVA: p<0,001; ANOVA: p<0,001; || ANOVA: p<0,05; # ANOVA: p<0,05.

DP: desvio padrão.

Complexidade da resposta da IgA contra antígenos bacterianos

O número de bandas de IgA reativas a S. aureus variou entre 2 e 11 (média: 4,89±2,19); a K. pneumoniae , entre 1 e 11 (média 2,93±2,19); a S. enteretidis , entre 1 e 11 (média 3,73±2,21); e contra E. coli , entre 1 e 8 (média: 3,76±1,911). O número médio das bandas reativas a antígenos microbianos de S. aureus , E. coli , K. pneumoniae e S. enteritidis está representado na figura 2 . O número médio de bandas reativas a S. aureus mostrou-se elevado, e foram encontradas diferenças estatisticamente significativas em comparação a outras bactérias ( Figura 2 ; p<0,05). Não houve diferenças significativas no número médio de bandas entre K. pneumoniae , S. enteritidis e E. coli (p>0,05).

*p=0,02; **p=0,02; ***p=0,04.

Figura 2 Número médio de bandas reativas de IgA com antígenos bacterianos de Staphylococcus aureus , Escherichia coli , Klebsiella pneumoniae e Salmonella enteritidis no colostro 

IgA específica contra bandas de extratos bacterianos separados por SDS-PAGE

As bandas de IgA reconhecidas e detectadas nos extratos bacterianos foram analisadas, e seu peso molecular (kDa) foi calculado pela equação obtida pela análise das bandas padrão de peso molecular. O número de amostras com IgA positiva para antígenos e seu peso molecular respectivo com S. aureus , K. pneumoniae , S. enteritidis e E. coli estão representados na figura 3 . Foi observada grande variação nas bandas reconhecidas pela IgA para cada extrato bacteriano, e a maioria delas mostrou grande peso molecular, variando entre 247 e 109kDa. Cerca de 59 bandas de diferentes pesos moleculares foram detectadas. Uma banda de peso molecular de 244kDa mostrou-se comum em amostras de S. aureus , K. pneumoniae e S. enteritidis , mas não houve correlação entre elas (p>0,05; r<0,28).

Figura 3 Número de amostras com IgA reativa para antígenos bacterianos específicos e seu peso molecular (kDa) 

As frequências de amostras com resposta positiva a antígenos mais detectadas estão representadas na tabela 1 . A resposta da IgA contra S. aureus apresentou a maior diversidade; mais de 20 tipos de bandas diferentes foram detectadas (p<0,05). A reatividade da IgA contra S. aureus demonstrou prevalência de bandas com grande peso molecular (p<0,05; Figura 3 ). Mais de 55% das amostras com resposta positiva a S. aureus mostrou IgA reativa a 230kDa e 208kDa. Entre amostras com IgA positiva para S. enteritidis (n=30), 12 bandas diferentes foram encontradas. Bandas de 244 e 220kDa foram reconhecidas em 53,4% das amostras e estatisticamente mais frequentemente detectadas do que as outras ( Tabela 1 ; p<0,05).

A análise da IgA contra K. pneumoniae revelou 14 bandas distintas ( Figura 3 e Tabela 1 ). A frequência da resposta positiva contra as bandas mais detectadas ( Tabela 1 ) não diferiu (p>0,05). Os imunoblots de IgA contra E. coli apresentaram 13 bandas diferentes ( Figura 3 e Tabela 1 ), mas não houve diferenças na frequência da resposta de IgA entre estas bandas (p>0,05).

Houve variações nas intensidades das reações de anticorpos de IgA com as bandas reconhecidas entre as crianças dos dois grupos. A tabela 1 mostra a soma das intensidades das reações de IgA com as bandas detectadas para cada espécie (intensidades totais). Em geral, a intensidade da resposta de IgA foi mais alta para S. aureus do que para outras bactérias (p<0,05). Além disto, a intensidade total da resposta da IgA para E. coli estava diminuída em relação à de K. pneumoniae (p<0,05).

DISCUSSÃO

A maioria das amostras de colostro apresentava IgA reativa a antígenos bacterianos, corroborando diversos estudos que enfatizam a importância do leite materno, que protege contra infecções por Haemophilus influenzae e E. coli , (21) e infecções entéricas causadas por E. coli, Vibrio cholerae, Campylobacter, Shigella spp e Giardia lamblia. (24-26) Deste modo, o aleitamento materno pode proteger neonatos contra a invasão oral de diversos microrganismos. (21)

A maioria das amostras (94%) apresentava anticorpos IgA reativos contra S. aureus acompanhados de respostas intensas e complexas, já que o número de bandas reativas mostrou-se maior do que para outras bactérias. Esta alta frequência de IgA reativa provavelmente ocorreu porque esta bactéria é parte da microbiota humana normal em diversas regiões do corpo humano, o que não exclui a possibilidade deste microrganismo causar doenças sob imunossupressão, ou quando barreiras epiteliais são violadas, o que pode ser limitado à superfície mucosa ou espalhado pelo corpo. (9)

Apesar de a maioria das amostras apresentar IgA contra estas bactérias, cerca de 40% não apresentaram IgA reativa para K. pneumoniae ou E. coli, sugerindo que alguns recém-nascidos podem desenvolver infecções a partir destes microrganismos, mesmo sendo amamentados. Uma das razões sugeridas para explicar crianças amamentadas com diarreia por Campylobacter é a falta de anticorpos específicos contra antígenos de virulência comuns de Campylobacter em amostras de colostro. (23) Eis então a importância não apenas de estudarmos a presença de IgA contra bactérias, mas também de avaliarmos e identificarmos os antígenos imunodominantes destas espécies na resposta imune natural.

As razões para a maior ou menor detecção de anticorpos nas amostras podem estar associadas à estimulação antigênica. É então necessário implementar uma estimulação estratégica para aumentar a proteção imune de recém-nascidos em seu período neonatal contra tais microrganismos e elevar os antígenos imunogênicos, o que ocorre com a infecção meningocócica. A imunização de mulheres no período pré-natal, com uma dose única de vacina meningocócica, resulta em aumento de níveis de IgG específica no soro do recém-nascido por 2 a 3 meses após o nascimento e em aumento de níveis de IgA específica para o microrganismo no leite por até 6 meses. (23)

Estes resultados mostram grande diversidade das espécies testadas de antígenos, com predominância de proteínas com alto peso molecular. As bandas mais comuns podem estar relacionadas à ação patogênica e/ou estimulação antigênica destas bactérias, como S. aureus de 230 e 289kDa, e as quatro bandas mais prevalente de S. enteritidis e E. coli são mostradas na tabela 1 . A K. pneumoniae mostrou grande variabilidade na resposta da IgA, mas não apresentou padrão específico de resposta. A literatura oferece algumas informações sobre diversos antígenos destas bactérias envolvidos em suas capacidades patogênicas, mas sabe-se pouco sobre antígenos de alto peso molecular, que apareceram expressivamente nas amostras deste estudo.

Um antígeno de 94kDa chamado “intimina” e outros antígenos reconhecidos pela IgA de 70, 80 e 110kDa estavam associados no processo de lesão attaching and effacing (A/E) pelo E. coli enteropatogênico no leite humano. (6) Além disto, a Rck é uma proteína da membrana externa de 17kDa, expressa em E. coli e S. enteritidis , inibidora de vias complementares, que assim impede a opsonização por estas vias. (27) Nenhuma amostra apresentou IgA reativa para intimina (94kDa) e banda 17kDa, mas cerca de 38 e 17% das amostras responderam a uma banda de 72 e 117kDa, respectivamente, provavelmente da mesma forma que previamente reportado. (6) Antígenos de K. pneumoniae de 35 e 36kDa induzem anticorpos na opsonização (28) e foram reconhecidos por 29% das amostras do presente estudo.

O antígeno de 106kDa (fibronectina tipo A) é uma das mais importantes moléculas envolvidas na adesão em estágios precoces da infecção por S. aureus . (29) Além destas moléculas, constituintes proteicos da membrana da S. aureus de 30 e 36kDa podem cumprir um importante papel em infecções causadas por esta bactéria. (30) Estes antígenos foram detectados em 17% das amostras com respostas positivas.

CONCLUSÃO

A maioria das amostras de colostro pode proteger os recém-nascidos de infecções bacterianas neonatais. É importante entender como estes anticorpos proporcionados pelo aleitamento podem ajudar o sistema imunológico da mucosa contra a colonização e o desafio apresentado por tais espécies, para desenvolvermos estratégias de prevenção e evitarmos estas infecções. A resposta natural aos extratos bacterianos testados mostra um caminho promissor para o desenvolvimento de vacinas contendo antígenos que poderiam ser aplicadas durante a gravidez, aumentando, assim, os níveis de IgA específica no colostro.

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