Associação entre interleucina-6 polimorfismo na região de -174 G/C e perda auditiva em idosos com história de exposição ao ruído ocupacional

Associação entre interleucina-6 polimorfismo na região de -174 G/C e perda auditiva em idosos com história de exposição ao ruído ocupacional

Autores:

Miula Portelinha Braga,
Sandra Mara Maciel,
Luciana Lozza de Moraes Marchiori,
Regina Célia Poli-Frederico

ARTIGO ORIGINAL

Brazilian Journal of Otorhinolaryngology

versão impressa ISSN 1808-8694

Braz. j. otorhinolaryngol. vol.80 no.5 São Paulo set./out. 2014

http://dx.doi.org/10.1016/j.bjorl.2014.07.001

Introdução

A saúde do idoso tem despertando cada vez mais o interesse dos pesquisadores, uma vez que a população está envelhecendo, sendo uma realidade tanto em países desenvolvidos como naqueles em desenvolvimento.1 Estima-se que até 2040 os países em desenvolvimento tenham um bilhão de pessoas com 60 anos ou mais.2 Devido à grande velocidade e à extensão desse crescimento, o cuidado com este grupo específico é essencial, de modo que possam envelhecer de forma saudável e com qualidade de vida.3

Os tipos mais comuns de perda auditiva são a presbiacusia (envelhecimento) e a perda auditiva induzida por ruído4 (PAIR). A PAIR se deve à exposição contínua a níveis intensos de ruídos, resultando em diminuição gradual da acuidade auditiva, geralmente sendo bilateral, simétrica, neurossensorial e irreversível. Comumente manifesta-se nas altas frequências audiométricas de 3.000 a 6.000 Hz.5 A etiologia da perda auditiva possui, além dos componentes ambientais, os genéticos e, mais recentemente, foi avaliada a indução de respostas inflamatórias e aumento da regulação de citocinas pró-inflamatórias no ouvido interno na presença de ruído exacerbado.5 - 7 A existência de células inflamatórias no estado estacionário e seu aumento após lesões no ouvido interno têm sido relatados por vários pesquisadores.6 , 8 - 10

A exposição ao ruído induz a expressão de citocinas pró-inflamatórias, incluindo o fator de necrose tumoral α (TNF- α), interleucina 1β (IL-1β) e interleucina-6 11 (IL-6). So et al.12 observaram uma up-regulação transitória de IL-6 em modelos animais tratados com cisplatina. Wakabayashi et al.13 investigaram o efeito da inibição da IL-6 usando um anticorpo anti-IL-6 (MR16-1) em camundongos. Estes autores verificaram que o MR16-1 apresentou efeito protetor contra a lesão coclear induzida pelo ruído, principalmente devido à supressão da perda neuronal e, presumivelmente, através do alívio da resposta inflamatória. Dados semelhantes foram encontrados por Nakamoto et al.14 Estes autores sugeriram que a supressão da citocina pro inflamatória HSF-1 na cóclea pela administração de GGA (geranilgeranilacetona) pode ser uma importante forma de proteção do ouvido interno.

A expressão de citocinas pode ser influenciada pela variação genética, resultando em condições patogênicas,15 e vários estudos têm investigado polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) como fatores de risco para doenças inflamatórias.16 Estes SNPs podem afetar a expressão, secreção e transporte celular das interleucinas,17 , 18 e podem também diminuir o nível do antagonista do receptor da IL-1 (IL-1Ra), o que aumenta a produção e atividade da IL-1β.19

O SNP na região -174 do gene da interleucina-6 consiste na troca de G por C, sendo que a presença do alelo C representa uma função protetora, devido à produção reduzida da IL-6.20

Considerando que na PAIR está envolvido o processo inflamatório, este trabalho teve por objetivo avaliar a associação entre o polimorfismo no gene da citocina pró-inflamatória-6 (IL-6) e a suscetibilidade à PAIR em idosos brasileiros fisicamente independentes.

Método

População de estudo

Este estudo transversal foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Humana da Universidade do Norte do Paraná (0070/09). É parte de uma investigação mais ampla, o "Estudo sobre envelhecimento e longevidade", que foi realizado em Londrina desde 2009. A cidade de Londrina (aproximadamente 500.000 habitantes) está situada na região norte do estado do Paraná, Brasil.

A partir de uma população de 43.610 idosos matriculados nas 38 unidades básicas de saúde na área urbana da cidade, o tamanho da amostra foi definido em 343 indivíduos, considerando um intervalo de confiança de 95% e uma margem de erro aceitável de 5%.21 Visando a representatividade amostral, foi realizada a estratificação aleatória considerando o gênero e as regiões da cidade. Foram incluídos no estudo indivíduos com 60 anos ou mais, de ambos os sexos, que se encontravam vivendo de forma independente, e estes foram classificados nos níveis 3 ou 4, como proposto por Spirduso.22 Esta classificação avalia o nível de independência dos idosos: o nível 1 indica uma falta de mobilidade, e o nível 5 indica atletas. Os idosos que tinham alguma doença ou limitação que impedisse a realização dos testes, como deficiência física ou mental, foram excluídos da amostra. Todos os participantes assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido.

Avaliação audiológica

A avaliação audiológica foi realizada através de audiometria tonal liminar convencional com audiômetro da marca Interacoustics. Para determinar a severidade da perda auditiva, foram usados: os critérios propostos pela BIAP - Bureau Internacional d´Audio Phonologie - instituição formada por diversas associações de países europeus com o objetivo principal de nortear a atividade dos profissionais dessas regiões; a média dos limiares auditivos em dB, na via aérea, nas frequências de 500 Hz, 1kHz, 2kHz e 4kHz; a recomendação 02/1 de 1997 analisadas; e ambas as orelhas direita e esquerda foram avaliadas para grupo de indivíduos com histórico de ruído ocupacional e para o grupo de indivíduos sem histórico de ruído ocupacional.23 - 25

Avaliação da exposição ocupacional ao ruído

A avaliação da exposição ocupacional ao ruído foi obtida através de entrevistas com os idosos participantes, usando um questionário semiestruturado. Foram coletadas informações sobre se o trabalho era realizado ou não em ambiente barulhento, quantos anos de trabalho em um ambiente barulhento e se usavam aparelho auditivo. Além disso, foram coletadas características demográficas (gênero, idade e etnia).

Genotipagem para o polimorfismo do gene da IL-6 G-174C (rs1800795)

As amostras de sangue periférico foram colhidas em tubos a vácuo contendo 6% de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e o DNA foi extraído a partir de leucócitos do sangue periférico utilizando o protocolo descrito por Olerup e Zeterquist.26

A partir das amostras originais, o DNA foi diluído para uma concentração de 100 ng/mL. A concentração foi determinada em espectrofotômetro a 260 nm e 280 nm (Biomate 3, Thermo Fisher Scientific, Madison, EUA).

O sítio polimórfico C para T, situado na posição -174 do gene da IL-6 (rs1800795), foi amplificado por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR), resultando em um fragmento de 99 pb. A PCR continha uma mistura de tampão pH 8,0 1X, 1,5 mM de MgCl2, 8 mM de cada um dos desoxirribonucleotídeos trifosfatos, 1 uM de cada um dos iniciadores e 1U de Taq DNA polimerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Os iniciadores utilizados foram: F-5'TTG TCA AGA CAT GCC AAG TGC T- 3' e R-5'GCCTCAGAGACATCTCCAGTCC-3'27 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA).

A amplificação por PCR foi realizada em um termociclador (TC-512 Resistência Techne, Burlington, Nova Jersey, EUA), sob as seguintes condições: desnaturação inicial a 95°C durante 5 minutos, seguido por 30 ciclos de 95°C durante 1 minuto, 56°C durante 1 minuto e 72°C durante 1 minuto, e extensão final a 72°C durante 5 minutos.

O produto da PCR foi digerido com 2U da enzima de restrição NlaIII (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) overnight a 65°C. Os fragmentos digeridos foram separados em géis de agarose a 2% (Invitrogen Life Technologies, São Paulo, Brasil). Uma amostra com o genótipo conhecido foi usado como controle positivo da PCR, e para o controle negativo foi utilizada água ultrapura.

O marcador de peso molecular de DNA de 100 pb (Ladder - Invitrogen) foi incluído em cada gel corado com SybrSafe (Invitrogen Life Technologies, São Paulo, Brasil) e visualizados sob iluminação UV. A leitura e interpretação dos géis de agarose foram feitas com o programa LabImage L-PIX (HE) 1D-L340 (Loccus Biotecnologia, São Paulo, Brasil). Foram observados os fragmentos de 13, 227 e 59 pb (alelo G), e fragmentos de 13, 118, 109 e 59 pb (alelo C).

Análise estatística

A análise estatística dos dados foi realizada utilizando o pacote estatístico SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Para testar a associação entre a frequência genotípica e a perda auditiva relacionada à história de exposição ocupacional ao ruído, o teste do Qui-quadrado foi realizado. O equilíbrio de Hardy-Weinberg foi testado em cada grupo utilizando o teste do Qui-quadrado. A razão de chances (OR) com intervalo de confiança de 95% (95% IC) foi calculada. O nível de significância foi fixado em 5%.

Resultados

Do total de 343 idosos, os procedimentos de genética molecular foram conduzidos em 191 deles. Destes, 31,9% relataram histórico de exposição ao ruído, com 18,8% apresentando perda auditiva. Dos 68,1% sem histórico de exposição ao ruído, 59,2% apresentavam perda auditiva. A média de idade foi de 67,8 ± 5,3 anos, havendo maior proporção (58,6%) de idosos do gênero feminino (tabela 1).

Tabela 1 Características gerais e frequências alélicas e genotípicas entre os idosos brasileiros (n = 191) 

Características n %
Gênero
Masculino 79 41,4
Feminino 112 58,6
Idade (anos)
60-64 63 33,0
65-74 104 54,5
75 ou + 24 12,6
Média 67,8 (DP = 5,3)
História de exposição ao ruído
Sem história de exposição ao ruído
Sem perda auditiva 17 8,9
Com perda auditiva 113 59,2
Com história de exposição ao ruído
Sem perda auditiva 25 13,1
Com perda auditiva 36 18,8
Frequência genotípica
GG 107 56,0
CC 15 7,8
GC 69 36,2
Frequência alélica
G 283 74,1
C 99 25,9

Dos idosos avaliados, 56% foram homozigóticos para o alelo G, 7,8% para o alelo C, e 36,2% foram heterozigóticos (tabela 1). A distribuição genotípica para o gene IL-6 estava de acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg (p > 0,05).

Foi encontrada associação estatisticamente significante entre as frequências genotípicas e alélicas do gene da IL-6 -174 (rs1800795) e a perda auditiva entre os idosos com história de exposição ao ruído ocupacional (p < 0,001) (tabela 2). Os idosos portadores do genótipo CC foram menos propensos a ter perda auditiva por exposição ao ruído ocupacional em relação aos idosos portadores do genótipo GG (OR = 0,0124; 95% IC 0,0023-0,0671; p < 0,0001). Entretanto, tal associação não foi verificada no grupo de idosos sem histórico de exposição ao ruído (χ2 = 0,078; p = 0,961).

Tabela 2 Associação entre a frequência genotípica para o gene da interleucina-6 G-174C e a perda auditiva relacionada à história de exposição ocupacional ao ruído (n = 191) 

Exposição Genotipagem Sem perda Com perda Valor de p
ocupacional ao ruído auditiva auditiva
n (%) n (%)
Sem histórico Frequência genotípica 0,961a
GG 09 (52,9) 62 (54,9)
CC 01 (05,9) 08 (07,0)
GC 07 (41,2) 43 (38,1)
Frequência alélica 0,8696b
G 25 (73,5) 167 (76,9)
C 09 (26,5) 59 (23,1)
Com histórico Frequência genotípica < 0,01c
GG 03 (12,0) 33 (91,7)
CC 04 (16,0) 02 (05,5)
GC 18 (72,0) 01 (02,8)
Frequência alélica < 0,01d
G 24 (48,0) 67 (93,0)
C 26 (52,0) 05 (07,0)

a χ2 = 0,078.

b χ2 = 0,027.

c χ2 = 40,201.

d χ2 = 31,605.

Discussão

Embora o mecanismo e a função de citocinas pró-inflamatórias na PAIR ainda não estejam bem esclarecidos, sabe-se que a estrutura e a expressão de citocinas pode ser influenciadas pela variação genética, como, por exemplo, o polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), o que resulta em consequências patológicas evidentes.15 A funcionalidade de SNPs, no que diz respeito à expressão do gene, é um assunto importante em estudos de associação a doenças.16

No presente estudo as frequências dos alelos G e C na população estudada foram de 74,1% e 25,9%, respectivamente. Outros estudos também têm demonstrado a predominância do alelo ancestral (G), variando entre 60% e 70%.28 Em adição, foi observada uma maior frequência do genótipo GG (56%), seguida pelo GC (36,2%) e CC (7,8%). Este fato é consistente com os estudos citados anteriormente.20 , 28

Foi observada associação entre o genótipo GG de IL-6 e perda auditiva com história de exposição ao ruído ocupacional (χ2 = 40,201; p < 0,001). Os idosos portadores do genótipo CC apresentaram menor propensão à perda auditiva por exposição ocupacional ao ruído (OR = 0,0124; 95% IC 0,0023-0,0671; p < 0,01) em relação aos idosos portadores do genótipo GG. A presença do alelo C resulta em uma menor expressão da IL6 após um estímulo inflamatório em comparação com o alelo G.29 Sugere-se que o genótipo CC confira uma influência protetora contra o desenvolvimento de comorbidades, o pôde ser constatada nesta análise, quando a frequência do alelo C no grupo de perda auditiva sem exposição ao ruído foi maior do que no grupo PAIR.

Os estudos de Hirose et al.6 e Fujioka et al.11 apontaram a possibilidade de alterações inflamatórias na cóclea após o estímulo por ruído. Fujioka et al.11 demonstraram pela primeira vez a indução de citocinas pró-inflamatórias na cóclea exposta ao ruído e observaram a expressão aumentada das interleucinas TNF-α, IL-1β e IL-6, 3 horas após a exposição ao ruído. Estes autores ressaltaram que este mecanismo é de autoproteção contra a exposição à grande quantidade de ruído, e a consequente expressão excessiva de interleucinas por longos períodos deve piorar a função coclear.

Os achados de So et al.12 demonstraram claramente que a IL-6 atua como um indutor de lesão coclear aguda, pois após a exposição dos animais com cisplatina ocorreu uma up-regulação transitória de IL-6. Alguns estudos têm evidenciado que a inibição da produção da IL-6 apresenta um efeito protetor coclear. Wakabayashi et al.21 utilizaram o anticorpo anti-IL-6 (MR10-1) para inibir a produção de IL-6 em camundongos, verificando um efeito protetor para a lesão coclear induzida pelo ruído. Nesta mesma linha de investigação, Nakamoto et al.14 verificaram que a droga geranilacetona (GGA) estimula a expressão do gene HSF que, por sua vez, inibe a inflamação na cóclea, protegendo o ouvido interno.

Vale ressaltar que estas fortes evidências do envolvimento da IL-6 com PAIR têm sido verificadas por meio de vários estudos em modelos animais.11 - 14 Evidências em humanos em relação às interleucinas pró-inflamatórias e PAIR foram relatadas recentemente por nosso grupo, que investigou a associação do polimorfismo no gene da IL-1β com a PAIR.30 Este estudo demonstrou que o polimorfismo neste gene não está associado à PAIR nos idosos avaliados. Entretanto, os achados do presente estudo mostraram que o polimorfismo no gene da IL-6 deve contribuir para o risco de ocorrência da PAIR em idosos brasileiros.

Considerando este contexto, a determinação do polimorfismo no gene da IL-6 em pacientes com perda auditiva relacionada à história de exposição ocupacional ao ruído pode nos ajudar a compreender a variabilidade individual da inflamação, resultando na perda auditiva, assim como, no futuro, sugerir a genotipagem de indivíduos para este polimorfismo em particular (rs1800795), a fim de determinar a suscetibilidade individual fornecendo uma nova estratégia para a prevenção da perda auditiva relacionada à exposição ao ruído.

Conclusões

Foi encontrada uma associação entre o polimorfismo no gene da IL-6 e a perda de audição associada à exposição ocupacional ao ruído em idosos brasileiros. Estudos baseados em grandes populações e com diferentes etnias deveriam ser conduzidos para confirmar nossos achados.

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