Avaliação comparativa da qualidade da coloração de Papanicolaou em diferentes tempos de fixação em álcool etílico a 96%

Avaliação comparativa da qualidade da coloração de Papanicolaou em diferentes tempos de fixação em álcool etílico a 96%

Autores:

Shirley Borges S. Quintana,
Fabiano L. Carvalho,
Glória Regina F. Silva,
Maria Beatriz T. Campos,
Maria Conceição S. Maia,
Mario Lucio C. Araújo Júnior,
Marcel S. B. Quintana

ARTIGO ORIGINAL

Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial

versão impressa ISSN 1676-2444versão On-line ISSN 1678-4774

J. Bras. Patol. Med. Lab. vol.55 no.1 Rio de Janeiro jan./fev. 2019 Epub 09-Maio-2019

http://dx.doi.org/10.5935/1676-2444.20190006

INTRODUÇÃO

O processo de fixação dos esfregaços citológicos consiste na imersão imediata do esfregaço no fixador adequado para conservar as características bioquímicas e morfológicas celulares, sendo essencial para a análise microscópica e a interpretação diagnóstica. O fixador ideal recomendado para colpocitologia é o álcool a 96% (92,8°GL-INPM). De acordo com vários autores, os principais motivos de dessecamento são demora na fixação do material e fixador inadequado para conservação das amostras(1-3).

A fixação adequada é um passo fundamental na preparação dos esfregaços cervicais, pois garante que as células possam ser bem coradas e claramente visíveis para análise microscópica imediata ou para futuras reavaliações. Segundo o Manual de Gestão da Qualidade para Laboratórios de Citopatologia do Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva (INCA)(4), é comum a troca do álcool por outros produtos habitualmente utilizados nos serviços de saúde para outros fins. Equivocadamente, na falta do álcool indicado é utilizado o álcool a 70%, útil para desinfecção de bancadas, porém totalmente inadequado como fixador para exames citopatológicos.

Segundo Koss e Gompel (2006)(5), 15 minutos é tempo suficiente para fixar o material em álcool. A amostra poderá permanecer na solução durante alguns dias, ou até semanas. É importante que os esfregaços fiquem totalmente imersos no tubete fechado que contém a solução, evitando, ao máximo, a evaporação. Entretanto, alguns autores afirmam que, em situações especiais e para facilitar o transporte, pode-se desprezar o álcool e manter a lâmina dentro do tubete devidamente fechado para enviar ao laboratório(4,6).

Uma alternativa é a fixação utilizando spray fixador, composto por uma base de álcool e carboximetilcelulose a 2,5% (Carbowax), que fornece uma fina camada protetora sobre a lâmina. O Carbowax deve ser removido após imersão da lâmina em álcool antes da coloração. Esfregaços que forem fixados com esse método devem chegar ao laboratório de citopatologia no máximo em 15 dias(4).

OBJETIVO

Avaliar a influência de diferentes tempos de fixação nas características morfológicas e tintoriais de amostras fixadas em álcool etílico e coradas pelo método de Papanicolaou.

METODOLOGIA

Trata-se de uma pesquisa experimental, realizada em três fases, no período de abril a maio de 2015, na qual foram analisadas quantitativa e qualitativamente 99 amostras de raspado da mucosa jugal obtidas com auxílio de espátula de madeira, em uma população de 33 funcionários e alunos do curso técnico em citopatologia do INCA.

Foram colhidas três amostras de cada participante, fixadas em álcool etílico a 96%, formando três grupos:

  • grupo A - 33 amostras com fixação de 15 minutos;

  • grupo B - 33 amostras com fixação de 30 minutos;

  • grupo C - 33 amostras com fixação em sete dias.

Fase 1 - Obtenção das amostras de raspado da mucosa jugal (coleta e fixação)

Nesta primeira fase, o estudo baseou-se no convite a 33 funcionários e/ou alunos do curso de nível médio em Citotecnologia da Seção Integrada de Tecnologia em Citopatologia (SITEC) para atuarem como participantes do experimento. O critério de escolha dos profissionais e/ou alunos entrevistados foi a concordância para assinar o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE).

Cada participante teve acesso ao TCLE, com as instruções e os esclarecimentos feitos pelo profissional responsável pela pesquisa, preencheu o documento e o assinou. Em seguida, recebeu uma espátula de madeira e coletou o próprio material de sua mucosa jugal de forma abrasiva (raspagem), entregando-o imediatamente aos profissionais responsáveis. Estes distenderam a amostra em uma camada fina, uniforme e homogênea sobre três lâminas de vidro separadamente, com bordas foscas previamente identificadas por lápis preto, como grupo A (15 minutos), grupo B (30 minutos) e grupo C (sete dias), sendo prontamente acondicionadas em três frascos (tubete) contendo álcool etílico a 96%.

Para cada grupo o material foi fixado em tempos diferentes. No grupo A, após 15 minutos de fixação, o álcool foi desprezado e a lâmina acondicionada no frasco sem álcool até o momento da coloração; no grupo B, após 30 minutos de fixação, o álcool também foi desprezado e a lâmina seguiu o mesmo procedimento do grupo A; já as lâminas do grupo C ficaram imersas no álcool por sete dias. Transcorrido esse período, todas as lâminas dos grupos A, B e C foram coradas no mesmo dia e no mesmo carrinho de coloração. A coloração realizada foi a preconizada por Papanicolaou, utilizando-se coradora automatizada modelo Leica ST5020 acoplada à montadora automática modelo Leica CV5030. Utilizaram-se como meio de montagem resina Entellan® e lamínula.

Os avaliadores que participaram da pesquisa são profissionais altamente capacitados, habilitados e experientes em citopatologia, pertencentes ao quadro de funcionários do INCA. Este projeto faz parte do programa de qualidade encaminhado ao Comitê Permanente de Ética em Pesquisa (COPEP) do Instituto Nacional de Câncer, sendo aprovado sob o no. 040628/2016. Todos os participantes da pesquisa assinaram o TCLE.

Fase 2 - Avaliação analítica: qualidade da coloração

Nesta fase foi realizada a avaliação da qualidade da coloração por cinco avaliadores que observaram todas as lâminas em microscópio binocular multihead (capacidade para cinco observadores); após análise, eles chegaram a um consenso. As lâminas dos grupos A, B e C foram devidamente comparadas e analisadas, atribuindo os conceitos ótimo, bom, regular e ruim de acordo com a qualidade da coloração, a afinidade tintorial e as alterações morfológicas. Os resultados das avaliações das amostras foram registrados em planilha eletrônica. Foram avaliados os detalhes das colorações nucleares e citoplasmáticas de células epiteliais e não epiteliais (hemácias, leucócitos), muco e microbiota.

Para que a amostra tenha sido classificada como ótima, foi encontrada maior nitidez nos detalhes citoplasmáticos, como cianofilia, orangeofilia, eosinofilia, contorno de membrana e granulação citoplasmática (cerato-hialina, nucleoproteínas) e nuclear (cromatina, contorno de membrana nuclear). Para amostra classificada como boa, foi encontrada cromatina pouco opaca e menor nitidez da cianofilia, eosinofilia ou orangeofilia (menor densidade), além de dificuldades para visualização de grânulos citoplasmáticos (cerato-hialina, nucleoproteínas). Para amostra classificada como regular, foram observadas ausência de detalhes de grânulos citoplasmáticos (cerato-hialina, nucleoproteínas), cromatina opaca, ausência na definição do contorno de membrana nuclear e quase ausência de cianofilia e/ou orangeofilia. Apesar de não ter sido encontrada, a amostra para ser classificada como ruim deveria apresentar ausência de diferenciação nuclear e citoplasmática, com intensa perda da nitidez citoplasmática cianófila, bem como presença de cromatina intensamente opaca, sem definição de contorno de membranas, além de ausência de nitidez na coloração nuclear de neutrófilos e grânulos citoplasmáticos.

Fase 3 - Análise dos resultados

O procedimento desta fase baseou-se na análise estatística dos resultados comparativos entre os três grupos do material fixado, utilizando-se software(7) R versão 3.2.2.

Para avaliar se existiam associações significativas entre os grupos e as classificações, foi utilizado o teste exato de Fisher(8) e definido o nível de significância de 0.05.

RESULTADOS

Das 99 lâminas coradas, 19 foram desprezadas devido à ausência de material (esfregaço acelular), impossibilitando qualquer tipo de avaliação, restando apenas 80 lâminas para serem analisadas. Destas, foram avaliadas 28 no grupo A, 26 no

grupo B e 26 no grupo C. A Figura 1 apresenta a distribuição dos percentuais das classificações em cada grupo. O grupo C apresentou o maior percentual de amostras com a classificação ótima (92,3%). Agregando as categorias bom, regular e ruim (devido à baixa frequência) à categoria “não ótimo”, o teste Exato de Fisher indicou que existe associação entre as classificações e os grupos (p = 0,01).

FIGURA 1 Avaliação da coloração em amostras com tempos diferenciados de fixação. Coloração classificada em ótima, boa e regular 

Os achados deste estudo mostram que os esfregaços fixados com sete dias apresentaram maior nitidez nas colorações citoplasmáticas e nucleares, contudo não demonstraram classificação regular, diferentemente das com 15 e 30 minutos, que apresentaram, respectivamente, 10,7% e 7,7%, sugerindo que o menor tempo de fixação influenciou na avaliação da amostra.

As amostras fixadas em 15 e 30 minutos tiveram resultados próximos na avaliação de coloração ótima (60,7% e 61,5%, respectivamente), muito abaixo das amostras fixadas em sete dias (92,3%).

Em nosso estudo observamos que a orangeofilia celular não foi significativamente influenciada pelo tempo de fixação, enquanto cianofilia e metacromasia sofreram influência devido à redução do tempo de fixação. Em sete dias notou-se maior nitidez, com redução de sua densidade à medida que o tempo de fixação diminuiu.

Dos três corantes utilizados na coloração de Papanicolaou, o que sofreu maior influência no tempo de fixação foi hematoxilina, sendo também o que mais influenciou na classificação das amostras.

Amostras classificadas como ótima apresentaram maior nitidez no contorno de membranas nucleares e citoplasmáticas e melhor definição da cromatina e das granulações, bem como coloração nuclear de neutrófilos, conforme mostra a Figura 2.

FIGURA 2 Coloração classificada como ótima em três tempos de fixação A) fixação em sete dias; B) fixação em 30 minutos; C) fixação em 15 minutos. 

Amostras classificadas como boa apresentaram diminuição da nitidez citoplasmática cianófila e presença de cromatina um pouco mais opaca em relação à classificação ótima. Houve manutenção na definição de contorno de membranas, porém com redução na coloração nuclear de neutrófilos e grânulos citoplasmáticos, de acordo com a Figura 3.

FIGURA 3 Coloração classificada como boa em três tempos de fixação A) fixação em sete dias; B) fixação em 30 minutos; C) fixação em 15 minutos. 

Amostras classificadas como regular mostraram perda da nitidez citoplasmática cianófila, bem como presença de cromatina opaca, sem definição de contorno de membranas, além de ausência de nitidez na coloração nuclear de neutrófilos e grânulos citoplasmáticos, conforme apresentado na Figura 4.

FIGURA 4 Coloração classificada como regular em dois tempos de fixação A) fixação em 30 minutos; B) fixação em 15 minutos. 

Nos três grupos não houve representação na categoria ruim.

DISCUSSÃO

Este estudo avalia a influência de diversos tempos de fixação por álcool etílico a 96% na qualidade da coloração de amostras citológicas.

Na literatura, são raros os trabalhos a respeito do tempo de fixação das amostras. Koss e Gompel (2006)(5) relatam que o tempo mínimo de fixação das amostras citológicas é de 15 minutos. Em nosso estudo identificamos que o tempo de fixação de 15 e/ou 30 minutos influencia as características citomorfológicas e tintoriais das células. Ainda constatamos que amostras fixadas por sete dias apresentaram melhores resultados na qualidade das colorações, quando comparadas com as de fixação por 15 e 30 minutos.

Em face do grande número de amostras dessecadas recebidas pelos laboratórios e do trâmite, desde a coleta do exame até a entrega do resultado ao paciente - um longo caminho que envolve muitas etapas e muitos profissionais e procedimentos -, a fixação adequada do esfregaço tem a função de preservar a estrutura celular e conservar os detalhes. Tal papel evita a distorção celular, o aparecimento de artefatos e a perda da afinidade tintorial, além de possibilitar uma coloração satisfatória e avaliar os critérios citomorfológicos, o que garante a qualidade dos resultados.

Tomando como exemplo o câncer do colo do útero, o rastreamento mais efetivo se faz a partir do exame preventivo de Papanicolaou, um exame rápido, de baixo custo, com grande efeito na detecção de lesões precursoras. Para tanto utiliza-se uma coloração que recebe o mesmo nome e tem sido utilizada de forma universal na citologia esfoliativa porque permite demonstrar as diferenças entre as variações das camadas epiteliais, possibilitando a identificação precoce do câncer e de outras doenças(5). No Brasil, entre 2006 e 2013, cerca de 290 mil exames foram classificados como insatisfatórios, tendo 50% o dessecamento pela má fixação como principal motivo(9), uma vez que ele dificulta a entrada dos corantes nas células, segundo o Painel de Indicadores do Câncer do Colo do Útero(10). Esse método consiste em múltiplas etapas e possui um conjunto de corantes destinados a evidenciar as variações na morfologia, nos graus de maturidade e na atividade metabólica celular(11-13).

A hematoxilina de Harris, corante básico que reage com os ácidos nucleicos, confere ao núcleo uma coloração azulada. O EA36 (eosina, verde-luz ou verde-brilhante e pardo de Bismarck) é um corante ácido que fixa os componentes básicos do citoplasma. A eosina cora o citoplasma das células superficiais, os nucléolos, a mucina endocervical e os cílios. O verde-luz cora o citoplasma de células metabolicamente ativas, células intermediárias, parabasais, profundas, células colunares e histiócitos com coloração cianófila (esverdeada). O orange G6 é um corante ácido monocromático que apresenta afinidade por componentes básicos do citoplasma, corando as células anucleadas (escamas córneas), as células queratinizadas, os grânulos de eosinófilos e as hemácias com uma coloração alaranjada(13,14).

Ainda no processo de coloração, as funções de três outros elementos são indispensáveis para um bom resultado. O xilol, um solvente orgânico, tem a função de tornar as células translúcidas e participa na etapa de clarificação, cuja fase promove a transparência celular. Já o álcool etílico (70%, 96% e absoluto) tem a função de lavar e preparar o material para receber o corante alcoólico. A goma de Damar e o bálsamo do Canadá ou sintético (Entellan) servem para fazer a ligação entre a lâmina e a lamínula. Essa ligação protege o esfregaço da dessecação e confere maior durabilidade em relação à coloração(14).

O Manual de Gestão da Qualidade em Citopatologia menciona que se a amostra for fixada com álcool poderá permanecer na solução durante alguns dias ou mesmo semanas. É importante que os esfregaços fiquem totalmente imersos no tubete que contém a solução e que este esteja devidamente fechado, evitando-se ao máximo a evaporação. Ressalta, ainda, que em situações espec iais, o álcool pode ser desprezado para fins de transporte. Entretanto, as amostras necessitam de pelo menos 15 minutos totalmente imersas para que a fixação seja adequada, e o material deve ser encaminhado o quanto antes para o laboratório. Não foram encontrados na literatura estudos referentes ao tempo máximo entre a coleta da amostra e a chegada ao laboratório capaz de preservar os detalhes citológicos da célula.

É primordial destacar que o material biológico deve ser bem fixado, uma vez que a fixação preserva as características citomorfológicas e tintoriais das células(15). A amostra deve ser fixada imediatamente após a coleta do material para evitar o dessecamento pelo ar ou o ressecamento por alguma fonte de calor. Oliveira et al. (2010)(16) afirmam que o tempo para colocar a lâmina no tubo contendo o fixador não deve ultrapassar 15 segundos, entretanto, Mikel (1994)(17), em estudo realizado no Instituto de Patologia das Forças Armadas Americana, destaca que para uma ótima preservação a fixação deve ser imediata, enquanto o espécime ainda está úmido, pois mesmo uma mínima dessecação ao ar, de uma amostra, alterará os aspectos celulares. Além disso, comenta que o álcool etílico absoluto pode ser substituído por outros álcoois que dão resultados equivalentes, como o metanol a 100%, álcool desnaturado a 95%, isopropanol a 80% e vários fixadores em spray disponíveis comercialmente. O fixador ideal não pode ser tóxico, não deve evaporar a temperatura ambiente e o custo deve ser aceitável. Por tais razões, o álcool é considerado mundialmente o melhor fixador para os esfregaços citológicos(15).

CONCLUSÃO

Este estudo demonstrou que há diferença significativa na qualidade da coloração (p = 0,01) quando a amostra é fixada em diferentes tempos, sendo melhor quando fixadas por mais de 30 minutos. Esse dado é importante na prática da citopatologia, e outros estudos devem ser realizados a fim de padronizar condutas técnicas de forma a obter resultados melhores possíveis, beneficiando os pacientes e facilitando o processo de trabalho dos profissionais da citopatologia.

REFERÊNCIAS

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