Avaliação da glutationaS-transferaseM1 (GSTM1) e seu polimorfismo GSTM1 nulo na resposta ao tratamento com quimioterapia do câncer avançado de ovário

Avaliação da glutationaS-transferaseM1 (GSTM1) e seu polimorfismo GSTM1 nulo na resposta ao tratamento com quimioterapia do câncer avançado de ovário

Autores:

Gilberto Kendi Takeda,
Daniela Batista Leite,
Michele Gilvana Junqueira,
Luiz Augusto Freire Lopes,
Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva,
Fausto Farah Baracat

ARTIGO ORIGINAL

Einstein (São Paulo)

versão impressa ISSN 1679-4508versão On-line ISSN 2317-6385

Einstein (São Paulo) vol.9 no.3 São Paulo jul./set. 2011

http://dx.doi.org/10.1590/s1679-45082011ao1872

INTRODUÇÃO

Nos Estados Unidos, foram estimados, para 2010, 21.880 casos novos de câncer de ovário com 13.850 óbitos, segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA)(12). No Brasil, segundo dados divulgados pelo INCA, foram estimados 3.837 casos novos de câncer de ovário para o ano de 2009. O número de mortes por câncer de ovário em 2008 foi estimado em 2.836. O INCA coloca as neoplasias de ovário entre as de baixa incidência. Estima-se que, no Brasil, corresponda a cerca de 2 a 3% dos cânceres femininos(3).

O câncer de ovário é o mais letal dentre os tumores malignos ginecológicos, sendo assintomático e de difícil detecção nos estádios iniciais. Aproximadamente 62% são diagnosticados quando a doença já está disseminada, e a sobrevida de 5 anos é de apenas 27,6%(4).

O tratamento padrão para o câncer de ovário consiste na remoção cirúrgica (citorredução) completa do tumor seguido de quimioterapia sistêmica baseada na platina. Numerosos estudos provam que o volume do tumor residual tem grande impacto no prognóstico das pacientes. O uso da quimioterapia pré-operatória foi proposta no intuito de aumentar o número de pacientes que se beneficiarão com a citorredução completa, além de diminuir a morbidade e a mortalidade associadas a cirurgias maiores(5). A citorredução completa é o principal fator na sobrevida das pacientes seguida da citorredução ótima, na qual se deixa menos de 1cm no diâmetro máximo tumoral, porém isto nem sempre é possível. Quando se deixa de 1 a 2cm (citorreduçãosubótima) ou mais de 2cm de tumor residual, não há impacto na sobrevida das pacientes e, nestes casos, opta-se por realizar a quimioterapia pré-operatória seguida da cirurgia, na qual se procura realizar a remoção completa do tumor(6,7). O esquema de quimioterapia padrão utilizado após a citorredução primária é a combinação da cisplatina com a ciclofosfamida e, para a quimioterapia pré-operatória, é a combinação da cisplatina e o paclitaxel(8,9). Uma das estratégias para se conseguir uma melhor sobrevida dessas pacientes seria a escolha de uma droga quimioterápica eficaz no tratamento. As características genéticas podem contribuir para predizer a resposta ao tratamento quimioterápico(10).

A glutationaS-transferase (GST) pode agir catalisando a inativação dos quimioterápicos porsua conjugação com a glutationa(GSH), o antioxidante mais abundante no compartimento intracelular(11).

A glutationa S-transferase mu-1 (GSTM1) é um membro polimorfo do gene da classe mu da família da GST. O alelo GSTM1 nulo é o resultado da deleção de 15 quilobases (Kb), e este não apresenta atividade da GSTM1(12).

A resistência à quimioterapia representa uma das causas mais importantes na falha do tratamento de pacientes com câncer de ovário. Há evidências de que indivíduos portadores do gene polimórfico GSTM1 nulo podem ter maior sobrevida(13).

OBJETIVO

Avaliar se o genótipo da GSTM1 e o seu polimorfismo GSTM1 nulo podem influir na resposta ao tratamento quimioterápico.

MÉTODOS

Foi feito estudo retrospectivo de caso-controle de 112 pacientes portadoras de câncer avançado de ovário do tipo epitelial, que necessitaram de tratamento quimioterápico no período de Janeiro de 1995 a Dezembro de 2005 no Serviço de Ginecologia e Obstetrícia do HSPE-FMO. Este trabalho recebeu a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Instituição (n° 0121/06).

O material para estudo do genótipo da GSTM1 e sua deleção foi obtido do arquivo do Serviço da Anatomia Patológica do Hospital Servidor Público Estadual “Francisco Morato de Oliveira” (HSPE-FMO). Foram feitos dez cortes de um mícron, em blocos de peças parafinadas, obtidas para estadiamento cirúrgico do câncer de ovário. O estudo do genótipo da GSTM1 e sua deleção foram feitos no Laboratório de Ginecologia Molecular do Departamento de Ginecologia da Escola Paulista de Medicina da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). O tecido foi desparafinado e o ácido desoxirribonucleico (DNA) foi extraído segundo protocolo do kit (Qiagen, Chatworth, CA). Foram realizadas reações em cadeia da polimerase (PCR) para análise do polimorfismo da GSTM1.

As reações foram processadas em um volume final de 25 mL contendo 1mLde cada primer (iniciador, oligonucleotídeo) (10 pmol/mL), 2mLde DNA genômico (100 ng/mL), 10 mLde PCR Master Mix (Promega, Madison, USA) (50 U/mLTaq DNA Polimerase, 400 mM dNTP, 3 mM MgCl2) e 12mL de água destilada. As reações foram incubadas em termociclador (GeneAmp PCR System 9700-Perkin Elmer) nas seguintes condições: na primeira etapa do ciclo (desnaturação), a temperatura é elevada a 95°C durante 5 minutos, seguida de 40 ciclos a 94°C por 60 segundos;na segunda etapa (anelamento),a temperatura é reduzida a 55° C por 60 segundos; e, na última etapa, do ciclo (extensão da fita do DNA) a temperatura é elevada a 72°C por 60 segundos, findando com incubação a 72°C por 10 minutos.

Os produtos das reações foram analisados em gel de agarose 2% (Amersham Pharmacia Biotech), corado com brometo de etídeo.

Devido ao polimorfismo da GSTM1 poder apresentar deleção homozigótica para os dois alelos, foi necessária a utilização de um segundo iniciador, com intuito de se obterem controles internos indicativos da presença de DNA, bem como a integridade dos reagentes utilizados. Portanto, foi adicionado um par de oligonucleotídeos de um gene constitucional (beta-globina) nas reações de PCR.

Os iniciadores alelo-específicos utilizados foram a GSTM1 – 215 pares de base (1 direto (sense): 5’ – GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C – 3’ e 2 reversos (antisense): 5’– GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G – 3’) e a beta-globina – 268 pares de base (1 direto (sense): 5’– CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC – 3’ e 2 reversos(antisense): 5’– GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC – 3’)(14).

O produto da PCR gera dois genótipos distintos, nos quais a presença das bandas de 268 pb e 215 pb evidencia que a paciente possui o gene da GSTM1, sendo caracterizado como positivo (+/+). Quando se observa apenas a banda de 268 pb, correspondente à beta-globina, conclui-se que o GSTM1 não está presente, sendo denominado de nulo (-/-).

A resposta à quimioterapia foi determinada pelos níveis plasmáticos de CA 125 e/ou resposta clínica usando os critérios da Organização Mundial da Saúde (OMS). As pacientes foram classificadas como sem resposta à quimioterapia quando houve progressão ou doença estável(15).

Foi considerada resposta ao tratamento se esta foi completa ou parcial e manteve-se por pelo menos 4 semanas.

Para comparação da distribuição da variável “idade”, foi utilizado o teste t, com resultado expresso em média, mínimo e máximo. Quanto à raça, exame físico, tipo histológico, estadiamento cirúrgico, quimioterapia pré e pós-operatória e GSTM1 presente e nulo, utilizou-se o teste de proporção simples, com valores expressos em porcentagem.

Todas as informações e resultados foram analisados utilizando o software estatístico Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) 15.0 para Windows, com cálculo descritivo de média e desvio-padrão para variáveis quantitativas, e de frequência para variáveis qualitativas. A análise categórica foi feita por meio do teste do χ2 ou exato de Fischer (quando variável < 5). A significância estatística foi estabelecida como p<0,05. As variáveis incluídas foram polimorfismo do GST (presente ou nulo), resposta à quimioterapia pré-operatória (sim ou não) e resposta à quimioterapia pós-operatória (sim ou não). Foram feitas tabulações cruzadas entre o polimorfismo do GST versus resposta à quimioterapia pré-operatória e entre o polimorfismo do GST versus resposta à quimioterapia pós-operatória.

RESULTADOS

A idade das pacientes variou de 18 a 86 anos, com média de 58,34.

A raça branca foi a mais frequente (92%), seguida da parda e negra com 4% cada.

Os achados no exame físico foram tumor abdominal (79,4%), ascite (13,2%) e normal (7,4%).

Os tipos histológicos encontrados foram carcinoma seroso (66%), carcinoma SOE (19%), carcinoma mucinoso(10%), carcinoma endometrioide(3,5%) e tumor de Brenner (1,5%) dos casos.

Os estadiamentos cirúrgicos mais frequentemente encontrados foram IIIC (61,6%) e IC (17%) (Tabela 1).

Tabela 1 Estadiamento cirúrgico 

Variáveis n %
Estádio I A/B 8 7,1
Estádio IC 19 17
Estádio II A/B 8 7,1
Estádio II C 1 0,9
Estádio III A/B 2 1,8
Estádio III C 69 61,6
Estádio IV 5 4,5

A quimioterapia pré-operatória foi realizada em 42 pacientes (37,5% dos casos), sendo que em 22 (52,4%) com resposta e em 20 (47,6%) sem resposta.

A quimioterapia pós-operatória foi realizada em 91 pacientes (81,3% dos casos), sendo em 58 (63,7%) com resposta e em 33 (36,3%) sem resposta.

A GSTM1 foi encontrada em 60 pacientes (53,6% dos casos), sendo nulo em 9 (15%) e presente em 51 (85%).

Dentre as pacientes que responderam à quimioterapia pré-operatória, 11,1% apresentavam GSTM1 nulo e 88,9% GSTM1 presente. Dentre as pacientes que não responderam à quimioterapia pré-operatória, 14,29% apresentavam GSTM1 nulo e 85,71% GSTM1 presente (p=0,825) (Tabela 2).

Tabela 2 Resposta à quimioterapia pré operatória em relação ao GSTM1 e seu polimorfismo GSTM1 nulo 

Resposta à Qt pré operatória GSTM1 nulo (%) GSTM1 (%) Total
Não 2 (14,29) 12 (85,71) 14
Sim 1 (11,1) 8 (88,9) 9
Total 3 20 23

Para análise estatística, χ2 de Pearson bicaudal e teste exato de Fisher: p=0,825 e p=1,000, respectivamente.

QT: quimioterapia; GSTM1: glutationa S-transferase mu-1.

Dentre as pacientes que responderam à quimioterapia pós-operatória, em 80,65% a GSTM1 era presente e em 19,35%, nulo. Dentre as pacientes que não responderam à quimioterapia pós-operatória, em 87,5% a GSTM1 foi presente e em 12,5% nulo (p=0,553) (Tabela 3).

Tabela 3 Resposta à quimioterapia pós operatória em relação ao glutationa S-transferase mu-1 e seu polimorfismo glutationa S-transferase mu-1 nulo 

Resposta à Qt pós operatória GSTM1 nulo (%) GSTM1 (%) Total
Não 2 (12,5) 14 (87,5) 16
Sim 6 (19,35) 25 (80,65) 31
Total 8 39 47

Para análise estatística, χ2 de Pearson e teste exato de Fisher (bicaudal):p=0,553 e p=0,697, respectivamente.

QT: quimioterapia; GSTM1: glutationa S-transferase mu-1.

DISCUSSAO

As biotransformações das drogas, em especial as processadas no fígado, são comumente agrupadas em duas fases. Na fase 1, geralmente realizada pelas enzimas do citocromo P-450 (CYP), que inclui as reações de oxidação, redução ou hidrólise, as drogas podem ser ativadas, inativadas ou inalteradas suas atividades. Durante a fase 2, que envolve reações de conjugação, quase sempre ocorre a inativação total do xenobiótico, sendo geralmente realizada pelas enzimas GSTs e N-acetiltransferases (NATs). A presença do polimorfismo nesses genes modifica a atividade enzimática, levando à menor eficácia na destoxificação dos compostos reativos que podem estar envolvidos na carcinogênese ovariana. O efeito da GST no tratamento quimioterápico é contrário ao encontrado na suscetibilidade ao câncer de ovário, pois a destoxificação dos quimioterápicos poderia diminuir sua eficácia. A presença do polimorfismo nesses genes poderia potencializar a resposta ao tratamento com drogas quimioterápicas(16,17).

A GST catalisa a destoxificação da glutationa (GSH) dependente de xenobióticoseletrofílicos e de certos produtos do estresse oxidante, e são, portanto, críticos na homeostase celular. Há duas famílias da GST. A família da GST citosólica (solúvel), que compreende as classes alfa, kapa, mu, omega, pi, sigma, teta e zeta. A segunda família é a GST microssomal(18,19).

A GSTM1 pertence à classe mu e localiza-se no lócus 1p13-3. Esse gene é polimórfico, apresentando os alelos GSTM1a e GSTM1b, que diferem entre si pela substituição de um único par de base. O GSTM1 nulo possui uma deleção no gene que codifica a GSTM1, fazendo com que esta não apresente expressão proteica e que a atividade enzimática seja ausente(17).

O polimorfismo genético é facilmente determinado em estudos populacionais usando o DNA isolado de sangue ou tecidos de arquivos histopatológicos. Esses polimorfismos oferecem o instrumento que pode ser usado em estudos epidemiológicos para explorar as hipóteses de que as GSTs têm papel determinante na resposta individual aos carcinógenos químicos e agentes quimioterápicos.

A resistência à quimioterapia representa uma das causas mais importantes na falha ao tratamento de pacientes com câncer de ovário. O polimorfismo da GST (GSTM1, GSTP1 e GSTT1) tem sido implicado na resistência à quimioterapia e na sobrevida de pacientes com câncer de ovário(11).

A sobrevida em casos de câncer de ovário é baixa. O tratamento consiste em cirurgia, que deve retirar todo tumor ou deixar menos que 1cm de tumor residual para, em seguida, instituir a quimioterapia baseada em platina(20).

Apesar do fato de a doença residual ser importante fator prognóstico, algumas pacientes que tiveram citorredução ótima adquiriram resistência à quimioterapia e tiveram baixo índice de sobrevida. Por outro lado, há uma minoria de pacientes cujo tumor não foi retirado de maneira ideal (tumor residual maior que 1cm) e responderam bem ao tratamento com quimioterapia,não apresentando recidivas(21).

A resposta ao tratamento do câncer de ovário é variável e pode ser atribuída, em parte, a variações do polimorfismo genético que pode influenciar no metabolismo das drogas como, por exemplo, a GSTM1, GSTT1 e GSTP1(22).

Por isso, tem sido sugerido que a alta atividade da GST pode resultar em rápida metabolização, diminuindo os efeitos citotóxicos dos quimioterápicos sobre o tumor, levando a uma resposta insatisfatória ao tratamento e a uma menor sobrevida(10).

Alguns estudos relatam benefícios dos genótipos polimórficos das GSTs com a resposta à quimioterapia(13,22).

Nagleet al. estudaram 454 pacientes com câncer epitelial de ovário e observaram melhora da sobrevida quando o polimorfismo GSTP1, GSTT1 e GSTM1 estavam presentes(13).

Medeiros et al. estudaram 24 pacientes com câncer de ovário tratadas com citorredução cirúrgica e quimioterapia pós-operatória com paclitaxel e cisplatina. Os autores verificaram que não houve diferença estatística em relação à sobrevida, porém houve melhora da média de sobrevida e intervalo livre de doença no grupo portador de polimorfismo GSTM1 nulo e GSTT1 nulo(22).

Outros estudos, porém, não demonstraram diferença na resposta à quimioterapia nos casos de câncer de ovário em pacientes com genótipo GST comparado com GST polimórfico(10,12).

Beeghly et al. avaliaram 215 pacientes portadoras de câncer epitelial de ovário em relação aos genótipos GSTM1, GSTT1 e GSTP1 e seus polimorfismos e não houve correlação com a resposta ao tratamento quimioterápico com cisplatina, carboplatina, paclitaxel ou ciclofosfamida(10).

Lallas et al. avaliaram 146 pacientes com câncer epitelial de ovário em relação ao genótipo GSTM1 e seu polimorfismo GSTM1 nulo e não observou influência na resposta ao tratamento quimioterápico(12).

Em um estudo as pacientes que apresentavam polimorfismo combinado da GSTM1 nulo e GSTT1 nulo tiveram pior resposta ao tratamento quimioterápico(23).

Howells et al. avaliaram 78 pacientes com carcinoma epitelial de ovário tratadas com quimioterapia e observaram que as pacientes com combinação GSTM1 nulo e GSTT1 nulo foram associadas à má resposta ao tratamento quimioterápico(23).

CONCLUSÃO

No resultado do presente estudo, não foi observada qualquer ação da GSTM1 comparada ao seu polimorfismo GSTM1 nulo, na resposta ao tratamento quimioterápico do câncer avançado do ovário.

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