INTRODUÇÃO

A hemoglobinúria paroxística noturna (HPN) é um defeito clonal raro da célula tronco hematopoiética. A doença afeta todas as linhagens de células sanguíneas e tem incidência estimada em 1,3 novo caso por milhão de habitantes/ano. A etiologia reside em uma mutação somática adquirida no gene da fosfaditilinositolglicana classe-A (PIGA - phosphatidylinositol glycan class A), que codifica uma enzima essencial para a biossíntese das âncoras de glicosilfosfatidilinositol (GPI - glycophosphatidylinositol). A incapacidade de produzir uma enzima funcional resulta em deficiência completa ou parcial de proteínas de membrana ancoradas por GPI.^(1–4)

O fator acelerador de degradação (DAF - decay accelerating factor; CD55) das proteínas ancoradas por GPI e o inibidor da lise de membrana (MIRL - membrane inhibitor of reactive lysis; CD59) são responsáveis pelas manifestações clínicas e laboratoriais associadas à HPN.^(5,6) Tais proteínas impedem a ativação da C3 convertase e inibem a formação do complexo de ataque à membrana, protegendo as hemácias normais da lise mediada por complemento.⁽³⁾ As células sanguíneas com expressão reduzida de CD55 e CD59 são sensíveis à lise mediada pela ativação do complemento, que culmina na manifestação clínica da doença.

A tríade clássica de manifestações clínicas da HPN se caracteriza por hemólise intravascular, trombose em locais incomuns e insuficiência de medula óssea. A gravidade da hemólise depende do tamanho do clone HPN, e pacientes com hemólise grave geralmente necessitam de transfusão sanguínea. A ocorrência de hemoglobinúria e a baixa contagem de leucócitos aumentam a gravidade da doença, devido à perda urinária crônica de ferro e à maior suscetibilidade à infecção. Eventos trombóticos são tidos como um mau indicador prognóstico e constituem a principal causa de óbito em pacientes afetados por HPN.⁽⁷⁾

O tratamento eficaz da HPN depende do diagnóstico clínico e laboratorial correto.⁽⁷⁾ A citometria de fluxo (CF) é o padrão-ouro para o diagnóstico e monitoramento da HPN, mesmo em pacientes com clones pequenos. Trata-se de uma técnica de alta sensibilidade e especificidade, e de rápida execução, que permite a análise qualitativa e quantitativa de proteínas ancoradas por GPI.⁽⁸⁾ Entretanto, a padronização da técnica de CF é fundamental para a obtenção de resultados precisos. Diretrizes técnicas validadas para o diagnóstico e o monitoramento da HPN por CF foram disponibilizadas na literatura.^(3,9)

Até 2004, o diagnóstico da HPN em nosso laboratório de CF era baseado na análise da expressão antigênica de CD14, CD55 e CD59 por CF com duas cores. Em dezembro de 2012, a técnica foi aprimorada por meio da implementação de melhorias nas fases analíticas e elaboração do relatório final, da introdução de novos marcadores fenotípicos e da aquisição de novos citômetros de fluxo. Este artigo descreve nossos 10 anos de experiência na detecção de clones HPN por CF e os avanços técnicos recentes que permitiram o refinamento dos procedimentos, com melhora da resolução do ensaio e determinação mais precisa do tipo e do tamanho de clones em linhagem eritroides e mieloides, principalmente em pacientes com clones pequenos.

OBJETIVO

Discutir a implementação de avanços técnicos no diagnóstico e no acompanhamento laboratorial da hemoglobinúria paroxística noturna para validação da técnica de citometria de fluxo de alta sensibilidade, além de apresentar análise comparativa de diferentes protocolos e respectivos custos.

MÉTODOS

Procedimentos técnicos

Os procedimentos técnicos empregados na detecção de clones HPN por CF após as atualizações técnicas encontram-se resumidos na figura 1.

EDTA: ácido etilenodiaminotetracético; PBS: tampão fosfato salino; FITC: isotiocianato de fluoresceína; PE: ficoeritrina; NH₄CL: cloreto de amônio.

Figura 1 Procedimentos técnicos padronizados empregados na detecção de clones de hemoglobinúria paroxística noturna por citometria de fluxo 

RESULTADOS

Impacto dos avanços técnicos na resolução da citometria de fluxo para detecção de hemoglobinúria paroxística noturna

A resolução dos dados de CF foi fundamental para a diferenciação de populações normais e HPN em misturas de partículas com intensidade diferente de sinal. Antes da implementação dos avanços técnicos, o CD55/CD59 (eritrócitos e neutrófilos) e o CD14 (monócitos) eram usados com sucesso na detecção de clones HPN; entretanto, a resolução não era adequada. Por esse motivo, uma amostra de sangue periférico normal era sempre corada para servir de referência na identificação de populações HPN positivas e negativas.

A introdução de novos marcadores (Quadro 2) e o aprimoramento dos procedimentos técnicos (Figura 1) permitiram identificar clones HPN em alta resolução, com sensibilidade de 0,01%, além da caracterização de diferentes clones com base na deficiência total ou parcial de proteínas ancoradas por GPI (Figuras 2 e 3).

FSC: dispersão frontal (forward scatter); SSC: dispersão lateral (side scatter); FITC: isotiocianato de fluoresceína; PE: ficoeritrina.

Figura 2 Resolução dos dados de citometria de fluxo na investigação de hemoglobinúria paroxística noturna em linhagens eritroides após a implementação dos avanços técnicos. A análise por citometria de fluxo e as estratégias de gating empregadas foram baseadas nas recomendações de Sutherland et al.⁽¹¹⁾ (A) Gating sequencial para detecção correta de eritrócitos CD235a positivos. Tal estratégia de gating é importante para a eliminação de problemas no sistema fluídico (Side scatter long versus tempo) e agregação eritrocitária. (B e C) Diferentes clones de hemoglobinúria paroxística noturna com base na expressão de CD59. Conjuntos de dados contendo gráficos de pontos, gráficos de densidade e histogramas são úteis para melhor detecção e caracterização de diferentes clones de hemoglobinúria paroxística noturna 

FSC: dispersão frontal (forward scatter); SSC: dispersão lateral (side scatter); FITC: isotiocianato de fluoresceína; PE: ficoeritrina; HPN: hemoglobinúria paroxística noturna.

Figura 3 Resolução dos dados de citometria de fluxo na investigação de hemoglobinúria paroxística noturna em neutrófilos e monócitos após a implementação dos avanços técnicos. (A, B, C e F) Estratégias de gating empregadas na identificação de neutrófilos e monócitos. (D, E, G e H) Tamanho do clone de hemoglobinúria paroxística noturna em neutrófilos CD45/CD15+ (D e E) e monócitos CD45/CD64+ (G e H), com base na expressão de proaerolisina marcada com fluoresceína e CD24 e proaerolisina marcada com fluoresceína e CD14, respectivamente 

Desempenho dos protocolos de detecção de hemoglobinúria paroxística noturna antes e depois da implementação de avanços técnicos

A comparação do desempenho dos protocolos de detecção de HPN foi baseada no número de casos positivos detectados antes e depois da implementação de avanços técnicos. Foram consideradas apenas as amostras positivas ou negativas analisadas para fins de diagnóstico, excluindo-se as analisadas para monitoramento. De um total de 745 amostras analisadas antes da atualização técnica, 573 (76,9%) foram selecionadas, contra 172 após a atualização. Os clones HPN foram detectados em 4% (23/573) e 4,7% (8/172) amostras analisadas antes e depois da implementação de avanços técnicos, respectivamente. Entretanto, as diferenças não alcançaram significância estatística (p=0,714) (Figura 4).

HPN: hemoglobinúria paroxística noturna.

Figura 4 Desempenho dos protocolos de detecção de hemoglobinúria paroxística noturna antes e depois da implementação de avanços técnicos. A frequência de amostras negativas e positivas não diferiu de forma significante entre os protocolos (p=0,714) 

Uso alternativo do CD157 para detecção de hemoglobinúria paroxística noturna

Diversas proteínas ancoradas por GPI podem ser usadas na investigação de HPN por CF. Estudos recentes empregando amostras sanguíneas HPN estabilizadas revelaram desempenho superior de algumas dessas proteínas na detecção de leucócitos HPN em relação aos marcadores CD14, CD16, CD24 e FLAER.⁽¹²⁾ Dados recentes de literatura mostraram que o CD157 é um marcador dotado de alta sensibilidade e especificidade, além de potencialmente útil para a detecção de HPN, podendo inclusive ser usado para avaliar a expressão de proteínas ligadas ao GPI em neutrófilos e monócitos na mesma reação.^(13,14)

Para efeito de padronização do procedimento citado,⁽¹⁴⁾ um protocolo baseado no uso de um único tubo contendo cinco conjugados para análise simultânea de neutrófilos e monócitos foi validado em nosso laboratório. Os marcadores empregados encontram-se descritos no quadro 3. Foram utilizados os citômetros de fluxo Cytomics FC500 e Navios flow cytometer (Beckman Coulter).

Quadro 3 Ensaio com cinco cores em tubo único para investigação de hemoglobinúria paroxística noturna em leucócitos 

Células alvo	Anticorpo e fluorocromo	Clone	Fabricante
Neutrófilos e monócitos (ensaio com cinco cores)	FLAER Alexa Fluor 488	NA	Cedarlane
	CD157 PE	SY11B5	Exbio
	CD64 ECD	22	Beckman Coulter
	CD15 PE-Cy5	80H5	Beckman Coulter
	CD45PE-Cy7	J33	Beckman Coulter

FLAER: proaerolisina marcada com fluoresceína; NA: não se aplica; PE: ficoeritrina; PE-Cy5: ficoeritrina-cianina 5; PE-Cy7: ficoeritrina-cianina 7.

Para efeito de comparação de desempenho, 20 amostras foram analisadas empregando-se o ensaio atual (quatro cores em dois tubos) e o ensaio com cinco cores em um único tubo. Clones de tamanhos diferentes foram detectados em neutrófilos (0,2% a 76,0%) e monócitos (0,9% a 77,0%) em dez amostras, sem diferença estatística entre os tamanhos dos clones HPN detectados pelos dois métodos (Figuras 5 e 6). As dez amostras restantes foram negativas em ambos os ensaios.

HPN: hemoglobinúria paroxística noturna.

Figura 5 Comparação do tamanho dos clones de hemoglobinúria paroxística noturna detectados por ensaios com quatro cores em dois tubos e cinco cores em um único tubo. (A e B) Correlações entre neutrófilos CD15+ (A) e monócitos CD64+ (B) e diferentes tamanhos de clones de hemoglobinúria paroxística noturna. A significância estatística foi investigada por testes de correlação e regressão linear (R2=0,9998; p<0,0001) 

FLAER: ficoeritrina; HPN: hemoglobinúria paroxística noturna; SSC: side scatter.

Figura 6 Análise de leucócitos pelo ensaio de cinco cores em um único tubo descrito no quadro 3. As estratégias de gating empregadas para identificação de neutrófilos e monócitos encontram-se descritas na figura 3. (A, B, C e D) Tamanho do clone hemoglobinúria paroxística noturna em neutrófilos CD45/CD15+ (A e B) e monócitos CD45/CD64+ (C e D), com base na expressão de proaerolisina marcada com fluoresceína e CD157. (E e F) Amostras contendo clones de hemoglobinúria paroxística noturna tipos II e III detectados em linhagens mieloides por ensaios baseados em proaerolisina marcada com fluoresceína e CD157. (G, H, I e J) Linfócitos (SSCxCD45) empregados como controle interno para avaliação de procedimentos técnicos, desempenho dos reagentes e ajustes do citômetro de fluxo 

Amostras obtidas de um programa de avaliação externa de qualidade (United Kingdom National External Quality Assessment Service; UK NEQAS) também foram avaliadas para efeito de validação. Como exemplo, ensaios baseados em FLAER e CD157 revelaram 0,12% de células em neutrófilos CD15+ em uma das amostras em questão. Tal resultado mostrou-se compatível com a faixa de 0,08% a 0,13% proposta nos ensaios de HPN do UK NEQAS.

Impacto dos avanços técnicos sobre os custos do teste para hemoglobinúria paroxística noturna

Os três cenários de avanços técnicos descritos acima foram submetidos à análise pelo método de custeio baseado em atividades (ABC - activity-based costing)⁽¹⁵⁾ para determinação do impacto da implementação de avanços técnicos sobre o custo dos testes. O método ABC elimina as variações de rentabilidade e estabelece políticas de preço com base em custos e processos, incluindo análise de custos variáveis (materiais de consumo, com fracionamento e estimativa de desperdício), fixos (serviços médicos e técnicos, infraestrutura e depreciação) e administrativos.

Variáveis importantes, como tempo de incidência do laser, aquisição e análise de dados de CF, custo de reagentes e materiais de consumo, e tempo de utilização e custos dos serviços médicos e técnicos, foram consideradas na análise comparativa dos procedimentos técnicos. Os resultados revelaram redução significativa de custos. Os custos do ensaio com duas cores mostraram-se 37,0% mais altos do que os do ensaio com quatro cores, e 45,0% mais altos do que os do ensaio com cinco cores em tubo único. Os custos do ensaio com quatro cores foram 12,7% mais altos do que os do ensaio com cinco cores em tubo único (Figura 7).

Figura 7 Custeio baseado em atividades. A redução nos custos do teste para hemoglobinúria paroxística noturna foi associada aos procedimentos técnicos. O ensaio de duas cores foi considerado o ponto de partida para a análise comparativa dos procedimentos técnicos deste estudo (ensaio com quatro cores em dois tubos, e com cinco cores em um único tubo) 

DISCUSSÃO

Este estudo retrospectivo retrata nossa experiência de 10 anos na detecção de clones HPN por meio de CF e discute avanços técnicos recentes, cuja implementação levou ao aumento da resolução e da sensibilidade na detecção de clones HPN de pequeno tamanho. Para tal, as recomendações listadas em diretrizes internacionais foram acatadas e os procedimentos técnicos devidamente atualizados.^{(3,8,9,14,16–18)}

Nos ensaios de leucócitos, o maior avanço no diagnóstico e, principalmente, no monitoramento de clones HPN se deveu ao uso de FLAER, por sua maior precisão e sensibilidade. Acredita-se que tal marcador seja capaz de detectar clones pequenos em níveis de aproximadamente 0,5%,⁽¹⁷⁾ especialmente em casos de neutropenia grave, anemia aplástica (AA) e síndromes mielodisplásicas (SMD).^(19–21) A substituição do CD55/CD59 por FLAER/CD14 (monócitos) ou FLAER/CD24 (neutrófilos) em nossos procedimentos levou à melhora da resolução dos dados de CF (Figuras 3E a 3H), principalmente no que se refere a clones de pequeno tamanho.

Um ensaio consagrado de alta sensibilidade para detecção de leucócitos HPN (ensaio com cinco cores em tubo único)⁽¹⁴⁾ foi recentemente validado em nosso laboratório de CF (Figura 6). A comparação de 20 amostras analisadas por este e pelo ensaio com quatro cores em dois tubos revelou altos níveis de correlação (Figura 5). Clones HPN de tamanho semelhante foram detectados em 10 das 20 amostras analisadas por ambos os métodos, enquanto nas 10 amostras restantes nenhum clone foi detectado.

Curiosamente, o CD157 mostrou-se capaz de detectar leucócitos HPN tipo II (Figuras 6E a 6F), fato esse já relatado em estudos prévios,^(3,14) embora de significado clínico ainda desconhecido.^(3,9,14) A detecção de leucócitos HPN tipo II não se restringe ao emprego do CD157; marcadores como CD55, CD59, CD24 (neutrófilos) e até mesmo CD14 (monócitos) também podem ser utilizados para tal fim.

O maior desafio técnico envolvido na análise de eritrócitos reside na combinação de diferentes anticorpos conjugados sem induzir agregação eritrocitária importante que possa prejudicar a detecção de clones HPN tipos II e III. Embora o CD55 e o CD59 sejam os mais tradicionais, os anticorpos CD235 a e CD59 conjugados com FITC e PE, respectivamente, são os marcadores mais bem estabelecidos.⁽⁹⁾ O emprego de tal combinação melhorou a resolução nas análises de eritrócitos (Figura 2). Cabe frisar que, antes da implementação de avanços técnicos como titulação e diluição adequada de marcadores de eritrócitos e racking das amostras antes da aquisição de dados, a diferenciação entre clones HPN tipos II e III não era possível, principalmente nos clones pequenos.

Eritrócitos HPN tipos II e III apresentam níveis diferentes de sensibilidade à ação lítica do complemento,⁽²²⁾ e sua correta identificação guarda relação com as manifestações clínicas e sintomas da doença. Manifestações clínicas associadas à hemólise intravascular foram relatadas em pacientes com mais de 20% de células HPN tipo III.⁽³⁾

O monitoramento do tamanho do clone é importante para o tratamento do paciente. O monitoramento de casos com evidências de pequenos clones requer ensaios de CF de alta resolução e sensibilidade. A técnica descrita neste artigo mostrou-se capaz de detectar clones HPN pequenos (Figuras 3E a 3H e Figuras 6B a 6D), permitindo a aquisição de um milhão de eventos com sensibilidade de 0,01%.⁽¹⁶⁾ Entretanto, cabe ressaltar que clones grandes podem ser adequadamente detectados e monitorados por meio de ensaios de alta precisão e baixa sensibilidade.

A detecção de clones HPN pequenos e subclínicos em pacientes com AA e SMD foi relatada.^(7,21) O monitoramento do tamanho do clone é importante, uma vez que alguns pacientes, principalmente os acometidos por AA, podem responder à terapia imunossupressora; além disso, a expansão do clone HPN pode desencadear manifestações clínicas relacionadas à HPN.^(19,20)

Além de inovação técnica, a atualização dos protocolos de CF proporcionou redução importante dos custos dos testes para HPN, conforme indicam os resultados da análise de custeio (Figura 7). A redução dos custos mostrou-se associada à diminuição do tempo de preparo das amostras, à aquisição e análise dos dados, ao menor custo dos reagentes e materiais de consumo, e à diminuição do tempo de utilização e custos dos serviços médicos e técnicos. Por motivos de confidencialidade, não foi possível traduzir a redução de custos em valor de moeda. Entretanto, tomando-se o ponto de partida para a análise comparativa (ensaio com duas cores; Figura 7) como 100%, seria possível atribuir ao mesmo um valor em moeda nacional (por exemplo, R$ 1,00) para efeito de cálculo da redução de custos em valor monetário. Além disso, o sangue periférico normal deixou de ser usado como controle interno, passando-se a empregar populações HPN negativas e positivas na avaliação dos procedimentos técnicos, desempenho dos anticorpos/reações e ajustes da CF (Figuras 6G a 6J).

Nosso laboratório, passou a integrar os programas de avaliação externa de qualidade UK NEQAS e College of American Pathologists em novembro de 2004 e abril de 2006, respectivamente. Em abril de 2013, passamos a participar também do programa UK NEQAS HPN High-Resolution. Cabe destacar o papel de tais programas na avaliação da qualidade, desempenho e sensibilidade dos testes para HPN. A implementação de ações corretivas e o refinamento contínuo com base nos resultados dos programas de avaliação externa de qualidade nos permitiram aprimorar os protocolos de detecção de HPN por CF.

CONCLUSÃO

A metodologia de citometria de fluxo empregada no diagnóstico da hemoglobinúria paroxística noturna em nosso laboratório foi atualizada de acordo com as recomendações disponibilizadas na literatura para procedimentos técnicos, análise e interpretação de dados, elaboração do relatório final e avaliação de fidedignidade. A implementação de novas estratégias metodológicas resultou em refinamento das técnicas de análise para diagnóstico e/ou monitoramento da hemoglobinúria paroxística noturna, com melhor resolução e detecção de clones de hemácias e leucócitos, e caracterização mais precisa de seu tipo e tamanho, principalmente em amostras contendo clones pequenos (citometria de fluxo de alta sensibilidade). Além disso, a atualização técnica promoveu redução significativa de custos.