INTRODUÇÃO

A doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum e possui etiologia multifatorial, envolvendo fatores genéticos e ambientais. Muito embora os pacientes com etiologia claramente genética não sejam os mais comuns, a descoberta de genes relacionados à DP tem contribuído para o esclarecimento da fisiopatologia da doença, possibilitando desvendar a cadeia de eventos relacionados ao processo neurodegenerativo, bem como de que forma os fatores ambientais estariam interagindo com os fatores genéticos, predispondo à morte neuronal⁽¹⁾.

Nos últimos anos, uma série de genes relacionados à DP foram clonados: SNCA (alfa-sinucleína); PARK2 (Parkin), PARK5 (UCHL1), PARK6 (PINK1), PARK7 (DJ1), PARK8 (LRRK2), PARK9 (ATP13A2). Destes, as alterações mais frequentemente encontradas estão nos genes PARK2, nas formas com herança autossômica recessiva, e PARK8, nas formas com herança autossômica dominante. Mutações no gene PARK2 estão predominantemente relacionadas à DP de início precoce (com início antes dos 50 anos), enquanto as mutações no PARK8 foram inicialmente descritas em pacientes com início da doença após essa idade, mas há descrições recentes de pacientes com início precoce⁽²⁾. Muito embora o gene PARK2 tenha sido inicialmente relacionado à herança autossômica recessiva, há um crescente número de relatos de casos de parkinsonianos que apresentam uma única mutação nesse gene, e questiona-se se um único alelo mutado seria apenas uma fator de risco ou um fator causal para a DP⁽³⁾. Nossos resultados preliminares mostram que mutações nos genes PARK2 ou PARK8 associam-se a 18% dos casos de DP de início precoce entre brasileiros⁽²⁾.

É provável que diferentes causas genéticas de parkinsonismo estejam conectadas por meio de vias metabólicas em comum. As funções e interações das proteínas produzidas por esses genes ainda não estão completamente esclarecidas, porém, alguns estudos já nos permitem afirmar que mutações nesses genes levam a disfunções na via ubiquitina-proteassoma (UP) e/ou à maior suscetibilidade ao estresse oxidativo^(4,5). Em cultura de células, verificou-se que há interação entre os produtos dos genes PARK2 (Parkina) e PARK8 (LRRK2). Parkina é uma ubiquitina-ligase E3 e LRRK2 é uma quinase. Aparentemente, as duas interagem por meio do domínio RING2 da parkina⁽⁵⁾. Sabe-se que a proteína sinfilina-1, encontrada nos corpúsculos de Lewy, interage com a parkina, mas uma série de outros substratos ligados a essas proteínas e à via UP ainda são desconhecidos.

Atualmente, não existe tratamento curativo para a DP, apenas sintomático, não sendo possível evitar sua progressão. O processo neurodegenerativo começa muito antes de as primeiras manifestações clínicas aparecerem. Ao surgimento dos primeiros sintomas, estima-se que já tenha havido uma perda de 75% da população de neurônios dopaminérgicos na substância negra pars compacta, uma das principais regiões afetadas na DP. Não se sabe exatamente em que época da vida esse processo se inicia. O diagnóstico pré-sintomático desses indivíduos seria de grande valia tanto para a melhor compreensão da fisiopatologia da doença, como para a possibilidade de tratamento precoce, uma vez que terapias neuroprotetoras se tornem disponíveis.

A descoberta de biomarcadores para a DP traria grande benefício para a identificação de pacientes em risco de desenvolver a doença, bem como para o diagnóstico e acompanhamento de sua progressão. Além disso, a descoberta de novas vias envolvidas no processo neurodegenerativo possibilitaria a identificação de potenciais novos alvos terapêuticos.

Uma das maiores dificuldades em se encontrarem bons biomarcadores para a DP é o fato de que suas manifestações ocorrem predominantemente no sistema nervoso central (SNC) e esse tecido não é facilmente acessível em vida. Estudos recentes mostraram modificações importantes da expressão gênica na substância negra de pacientes com DP^(6–8). Entretanto, para que marcadores moleculares tenham aplicação clínica, sua detecção por meio de métodos pouco invasivos, como em sangue periférico, é desejável. Embora a DP tenha seus sinais cardinais relacionados à degeneração de células do SNC, modificações pró-apoptóticas e alterações da atividade do sistema UP, possivelmente relacionadas à ativação das caspases, já foram observadas em leucócitos do sangue periférico de pacientes^(9,10). Verificou-se, também, que linfócitos do sangue periférico podem ser utilizados para estudar modificações nos sistemas de receptores e neurotransmissores de algumas doenças neurodegenerativas. Na DP, constatou-se uma redução da imunorreatividade do transportador de dopamina (DAT) em linfócitos do sangue periférico⁽¹¹⁾. Um estudo recente utilizando microarrays identificou marcadores moleculares da DP de início precoce no sangue periférico⁽¹²⁾. A utilização de microarrays de DNA pode avaliar a expressão gênica de milhares de genes em paralelo, permitindo uma rápida triagem de possíveis biomarcadores.

Assim, estudos da expressão gênica em pacientes com DP com mutações genéticas caracterizadas poderiam fornecer, potencialmente, novos dados sobre genes e proteínas associados ao processo neurodegerativo.

OBJETIVO

Avaliar por microarrays a expressão gênica no sangue periférico de pacientes com DP portadores e não-portadores das mutações nos genes PARK2 e PARK8, comparando-os a controles sadios. Comparar os resultados obtidos quanto à expressão global com informações disponíveis na literatura de forma a contribuir para a validação dos biomarcadores já descritos e avaliar a utilização desse tipo de abordagem para a identificação de marcadores de interesse.

MÉTODOS

RESULTADOS

O presente estudo procurou identificar, em sangue periférico, alterações na expressão de genes possivelmente relacionados com o desenvolvimento da DP em indivíduos portadores de mutações específicas nos genes PARK2 ou PARK8 em comparação com parkinsonianos sem mutações nesses genes e controles normais. Conforme detalhado a seguir, observou-se grande variabilidade entre as amostras estudadas com relação à expressão gênica global, não sendo possível identificar um padrão que diferenciasse esses pacientes de forma clara. Em contrapartida, identificou-se que a expressão de alguns genes estava alterada entre grupos de pacientes, sugerindo um possível papel desses genes na DP.

Padrões de expressão gênica global

Em um primeiro momento, avaliou-se o perfil de expressão gênica global das amostras selecionadas. Com esse propósito, utilizou-se um método de análise das componentes principais de variação (PCA) nesse conjunto de dados (Figura 1). A PCA ressalta que as amostras possuem uma variação de expressão muito acentuada. No sangue periférico, a presença das mutações estudadas não teve impacto global significativo passível de ser constatado em nível de genoma total.

Figura 1 PCA mostrando a projeção dos valores de expressão gênica obtidos por microarrays. Cada esfera representa a expressão global de uma amostra. Cada cor representa um tipo de amostra. Azul: parkinsonianos sem mutação em PARK2 ou PARK8; vermelho: pacientes portadores de mutação em PARK2; roxo: pacientes portadores de mutação em PARK8; verde: controles sadios. 

DISCUSSÃO

A tecnologia de microarrays vem reformulando a maneira tradicional de se fazer pesquisa, pois permite que questões relevantes sejam abordadas sob uma perspectiva integrada, favorecendo o surgimento de novos paradigmas. Os microarrays permitem a avaliação simultânea da expressão de milhares de genes, tendo sido largamente utilizados em experimentos projetados para estudar as funções e as interações de genes dentro de um contexto global. Uma questão central no estudo apresentado aqui é a aplicação de microarrays para a compreensão da biologia da DP. Com essa estratégia, podem-se inferir, por exemplo, vias de sinalização ativadas ou desativadas em pacientes com características genéticas particulares. Uma vez que esse tipo de abordagem estabelece associações entre o genoma e processos biológicos envolvidos na manifestação do fenótipo, a tecnologia gera novas hipóteses que deverão ser testadas em estudos posteriores mediante uso de abordagens mais direcionadas.

A avaliação dos padrões de expressão global das 20 amostras não foi capaz de segregar parkinsonianos de indivíduos sadios, nem de distinguir pacientes portadores de mutações específicas, sugerindo que os efeitos globais dessas mutações no sangue periférico são modestos quando comparados com a variabilidade geral na expressão gênica do material estudado. Essa variabilidade na expressão gênica representa uma combinação entre a variabilidade metodológica e a variação biológica inerente aos pacientes selecionados.

Dentre as variáveis metodológicas, a natureza do ensaio escolhido, análise de expressão gênica por microarrays, traz consigo um número bastante grande de etapas que agregam variáveis à análise. Dentre essas etapas, merecem destaque os processos de coleta, armazenamento de amostras, extração de RNA e protocolo experimental para a hibridização dos arrays. Quanto ao protocolo de hibridização dos arrays, todos os cuidados para a diminuição da variabilidade experimental foram tomados; em particular, ressaltamos a seleção de amostras com qualidade de RNA semelhante, a randomização na seleção da ordem das amostras hibridizadas nos arrays e a realização das etapas experimentais para todas as amostras em um mesmo dia. Dessa forma, pode-se atestar que as diferenças observadas são inerentes às amostras analisadas, podendo ser de natureza biológica. Muito embora a via final comum da DP seja a degeneração neuronal, principalmente no que diz respeito aos neurônios dopaminérgicos da substância negra pars compacta, existe grande dificuldade clínica de se obter amostra homogênea de pacientes, pois eles diferem entre si no que diz respeito à sintomatologia, esquema terapêutico e idade de início da doença, dentre outros aspectos.

Identificou-se uma série de genes diferencialmente expressos em comum entre parkinsonianos, bem como algumas diferenças particulares a cada padrão genético. Dentre esses genes, para efeito de ilustração, destacamos o gene TRIM24. Esse gene apresenta expressão reduzida em todos os grupos de parkinsonianos (p < 0,005; fold-change = 1,2) independentemente da presença de mutações. TRIM24 codifica uma proteína de localização nuclear envolvida, dentre outras funções, no controle de transcrição de alguns receptores nucleares. Recentemente, identificou-se que a proteína TRIM24 tem como alvo a proteína p53⁽¹³⁾. Esta proteína está envolvida em diversos processos celulares e, entre estes, o de maior interesse do ponto de vista das doenças neurodegenerativas seria o controle dos mecanismos de apoptose e autofagia. No sistema nervoso central (SNC), na presença de citotoxicidade ou isquemia, observa-se aumento dos níveis de p53 e apoptose⁽¹⁴⁾. TRIM24 atua negativamente como reguladora de p53. Estudos em modelo animal mostram que a depleção de TRIM24 pode levar à apoptose induzida por p53⁽¹³⁾. Há uma série de estudos demonstrando que os níveis de p53 estão aumentados em algumas regiões do SNC em pacientes com doenças neurodegenerativas, tais como Alzheimer, Parkinson e esclerose lateral amiotrófica⁽¹⁴⁾. O estresse oxidativo é um dos fatores que possivelmente contribuem para a DP. Na presença de danos ao DNA, os quais podem ocorrer, por exemplo, em situações de estresse oxidativo, ocorre apoptose induzida por p53⁽¹⁴⁾. Recentemente, identificou-se que a proteína parkina, que é codificada pelo gene PARK2 (relacionado a uma das formas de DP familiar) é um repressor da transcrição de p53⁽¹⁵⁾. A proteína TRIM24 ainda não foi diretamente relacionada à fisiopatologia da DP, porém identificamos que seu gene encontra-se com a expressão reduzida no sangue periférico de parkinsonianos. Esse achado em particular, se for confirmado com a ampliação da amostra de parkinsonianos e validação da expressão gênica por meio de PCR em tempo real, ilustra como a técnica de microarray em células de sangue periférico pode auxiliar na identificação de biomarcadores, novas vias envolvidas na fisiopatologia da DP e até mesmo na identificação de possíveis alvos terapêuticos.

O foco deste estudo foi analisar o perfil de expressão de pacientes portadores e não-portadores de mutações genéticas relacionadas à DP, verificando se métodos pouco invasivos, como a análise em sangue periférico, podem contribuir para a identificação de biomarcadores e elucidação da fisiopatologia da doença. A hipótese é que o padrão de expressão de genes poderia mostrar particularidades associadas à presença dessas mutações. A avaliação dos padrões de expressão global das amostras não foi capaz de segregar pacientes com base nesses critérios, sugerindo que seus efeitos globais na expressão gênica são modestos quando comparados com a variabilidade geral na expressão gênica do material estudado. Entretanto, a investigação da expressão diferencial de genes específicos pode nos ajudar a inferir mecanismos distintos entre grupos de pacientes e, assim, contribuir para a compreensão da fisiopatologia da DP.

CONCLUSÕES

O pequeno número de amostras estudadas aqui não permitiu conclusões definitivas, mas ofereceu indícios de que alterações moleculares específicas podem existir no sangue periférico de pacientes com DP portadores de mutações com alterações funcionais específicas e que esses também apresentam algumas alterações em comum com pacientes sem mutação. O desafio para esse tipo de estudo reside principalmente na seleção de amostras homogêneas quanto às características clínicopatológicas que permitam uma avaliação consistente do impacto da mutação no desenvolvimento da doença.

Em função dos dados preliminares deste estudo piloto, será planejado um segundo projeto, ampliando-se a amostra de pacientes e controles para que se possa realizar a validação desses genes através da técnica de PCR em tempo real e, uma vez confirmada a expressão diferencial de alguns desses genes num grupo maior de parkinsonianos, iniciar estudos funcionais de algumas das proteínas codificadas pelos mesmos para a elucidação de seu papel na DP e investigar seu possível potencial como biomarcadores da doença.