Comparação da dimensão fractal e entropia de Shannon em miócitos de ratos submetidos à cardioplegia utilizando solução histidina-triptofano-cetoglutarato e histidina-triptofano com glutamato
Comparação da dimensão fractal e entropia de Shannon em miócitos de ratos submetidos à cardioplegia utilizando solução histidina-triptofano-cetoglutarato e histidina-triptofano com glutamato
Autores:
ARTIGO ORIGINAL
Brazilian Journal of Cardiovascular Surgery
versão impressa ISSN 0102-7638
Rev Bras Cir Cardiovasc vol.29 no.2 São José do Rio Preto abr/jun. 2014
http://dx.doi.org/10.5935/1678-9741.20140052
| Abreviaturas, acrônimos & símbolos | |
|---|---|
| HTG | Histidina-triptofano-glutamato |
| HTK | Histidina-triptofano-cetoglutarato |
| IP | Intraperitoneal |
INTRODUÇÃO
Durante a cirurgia cardíaca é usual a parada temporária do coração, permitindo ao cirurgião realizar a operação no interior das cavidades cardíacas em ambiente isento de sangue e movimento. Antes que houvesse qualquer solução que produzisse parada cardíaca segura, foi de Gibbon em 1953 o mérito de utilizar uma técnica descrita por Senning em fechamento de comunicação interatrial experimental em cães utilizando fibrilação ventricular[1].
Em 1955, Melrose et al.[2] introduziram o conceito de parada química usando solução contendo 2,5% de citrato de potássio, que despolariza a membrana celular e para a condução do potencial de ação. Entretanto, a concentração elevada de potássio causou necrose miocárdica focal e morte em muitos pacientes, resultando em abandono da cardioplegia hipercalêmica como solução protetora por quase 20 anos. Em meados dos anos 70, cardioplegias alternativas contendo menos potássio que a de Melrose foram introduzidas com sucesso, como a solução de St. Thomas[3], cardioplegia sanguínea de baixo volume[4,5] e solução de histidina-triptofano-cetoglutarato (HTK)[6]. Apesar desses avanços, a solução de cardioplegia ideal ainda não foi desenvolvida[7,8].
A substituição do cetoglutarato por glutamato tem consequências ainda incertas no comportamento do músculo miocárdico, porém será um meio eficaz de avaliar indiretamente sua incorporação ao Ciclo de Krebs, retirando o piruvato da mitocôndria, evitando assim a acidose que é conhecidamente danoso tanto à célula quanto a seus mecanismos enzimáticos[9].
Soluções cardioplégicas com baixa concentração de cálcio como o HTK podem provocar o chamado "paradoxo do cálcio", desestabilizando a membrana celular, o que culmina com necrose, marginação leucocitária e apoptose[10]. Modificações histológicas provocadas por soluções cardioplégicas poderiam gerar alteração na quantidade e distribuição de informação contida na lâmina. Já é fato conhecido que alterações estruturais teciduais podem ser quantificadas por meio da dimensão fractal e entropia de Shannon[11,12].
A análise da dimensão fractal e entropia de Shannon foram recentemente usadas em várias áreas da medicina como cardiologia, neurologia, oftalmologia e radiologia[11,13], sendo úteis na caracterização de estruturas irregulares e complexas[11,13,14]. Utilizando análise fractal, Arruda et al.[11] e Douglas et al.[12] correlacionaram grau de desdiferenciação e invasividade tumoral em câncer de próstata e grau de rejeição em tumores cardíacos, respectivamente.
O presente trabalho objetiva avaliar se a solução de estudo histidina-triptofano-glutamato (HTG) é melhor que a HTK (solução padrão) por meio da dimensão fractal e entropia de Shannon em miócitos de rato submetidos, considerando-se os marcadores caspase, IL-8 e KI-67.
MÉTODOS
Após aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (autorização número 015/2012), foram utilizados 20 ratos (10 para cada grupo), machos, raça Wistar, com peso médio de 280±29 gramas.
Todos os animais receberam cuidados conforme recomendações do Committee on Care and Use of Laboratory Animals - Institute of Laboratory Animal Resources (ILAR) - National Research Council, Estados Unidos[15].
Protocolo Experimental
Os animais foram anestesiados com injeção de 65 mg/Kg intraperitoneal (IP) de pentobarbital sódico e receberam heparinização sistêmica IP (500 UI/kg). Após a abertura do tórax, foi realizada cardiectomia. Os corações receberam solução de Ringer lactato para "lavar" a árvore coronariana e, em seguida, solução cardioplégica conforme seu grupo.
Os corações nessa fase do experimento foram divididos em dois grupos. No Grupo 1 foi utilizada solução de HTK a 4ºC e, no Grupo 2, solução de histidina-triptofano-glutamato (HTG) a 4ºC. A Tabela 1 mostra a composição de cada uma das soluções. Em todos os casos a infusão da cardioplegia foi feita em dose única de 40 ml/Kg na raiz da aorta, seguida por imersão do órgão na mesma solução por 2 horas a 4ºC.
Tabela 1 Composição das soluções utilizadas.
| Substância | HTK (g/L) | HTG (g/L) |
|---|---|---|
| Cloreto de sódio | 0,8766 | 0,8766 |
| Cloreto de potássio | 0,671 | 0,671 |
| Cloreto de magnésio | 0,8132 | 0,8132 |
| Cloreto de cálcio | 0,0022 | 0,0022 |
| Potássio-hidrogênio-2-cetoglutarato | 0,1842 | --- |
| Glutamato | --- | 0,1842 |
| Histidina | 27,9289 | 27,9289 |
| Cloreto de histidina, H2O | 3,7733 | 3,7733 |
| Triptofano | 0,4085 | 0,4085 |
| Manitol | 5,4651 | 5,4651 |
| Água para injeção | a 1000 ml | a 1000 ml |
HTK: histidina-triptofano-cetoglutarato; HTG: histidina-triptofanoglutamato
Após esse tempo, os corações foram colocados em sistema de Langendorff e perfundidos com solução tampão de Ringer Locke oxigenado, em normotermia e pressão constante de 100 cm H2O, por método gravitacional durante 30 minutos. A drenagem do ventrículo direito foi realizada pela abertura da artéria pulmonar, sendo mantido intacto o átrio direito no intuito de preservar o nó sinusal[16].
Foram inseridos três fios de marca-passo epicárdico em pontos equidistantes dos ventrículos para documentação eletrocardiográfica dos eventos cardíacos. Foi anotado o tempo de início da fibrilação ventricular e o primeiro batimento cardíaco contado a partir do início da infusão da solução de Ringer Locke.
Após 30 minutos de infusão de Ringer Locke, o experimento foi descontinuado. Os corações foram retirados do sistema de Langendorff, sendo coletados fragmentos de ápice cardíaco, que foram armazenados em tubos estéreis como Falcon contendo formol 10%, para posterior preparação histólogica e imunohistoquímica.
Preparação histológica e técnica imunohistoquímica
Inicialmente, o material foi incluído em parafina, procedimento que oferece resistência permitindo seu corte em espessura de 3 µm e colocados em lâminas silanizadas. A silanização das lâminas consistiu na preparação destas com um adesivo que fixa o fragmento às lâminas impedindo seu descolamento durante o procedimento imunohistoquímico. Para tanto, estas foram imersas em acetona PA (2 minutos), solução de silano 4% diluído com acetona (2 minutos) e novamente em acetona PA (4 a 5 mergulhos). A secagem das lâminas foi realizada na estufa a 60ºC.
O bloco foi preso ao micrótomo, a espessura do corte foi regulada para 3 µm e os cortes colocados em lâmina silanizada identificada e deixados na estufa a 60ºC por 24 horas. As lâminas passaram pelo processo de desparafinização em xilol, seguida por hidratação em álcool absoluto I, II e III, finalizando com seis mergulhos em água corrente, incubados com 3% de peróxido de hidrogênio por 30 minutos para o bloqueio da peroxidase endógena.
A recuperação antigênica foi realizada na panela a vapor com tampão específico para cada anticorpo por 30 minutos (Tabela 2). Em seguida, as lâminas foram encobertas com solução contendo soro fetal bovino (BSA) e incubadas com o anticorpo primário.
Tabela 2 Relação dos anticorpos utilizados.
| Anticorpo | Especificidade | Diluição | Tampão | Laboratório |
|---|---|---|---|---|
| anti-KI-67 | Monoclonal | 1:200 | Citrato pH6 | Biocare Medical |
| anti-Caspase 3 | Policlonal | 1:1000 | Citrato pH6 | Abcam |
| anti-IL-8 | Monoclonal | 1:50 | Citrato pH6 | Santa Cruz |
Após essa etapa, as lâminas foram lavadas em solução PBS por 15 minutos e incubadas com kit Starr Trek Universal HRP Detection (Biocare Medical®), que consistiu no anticorpo secundário biotinilado por 1 hora e no complexo estreptavidina-peroxidase por 30 minutos, seguidas de lavagem com PBS por 15 minutos. A revelação foi feita com substrato cromógeno (Betazoidchromogen DAB) do kit Starr Trek Universal HRP Detection (Biocare Medical®) de 2 a 5 minutos e a contra-coloração com hematoxilina de Harrys por 40 segundos. Os tecidos foram desidratados em álcool em grau crescente e banhados no xilol antes da montagem das lâminas em meio ERV-MOUNT (Erviegas®).
Os controles negativos das reações foram obtidos pela omissão do anticorpo primário. Foram utilizados tecido de tonsila para reações de KI-67 e caspase 3 e como controle positivo tecido de mama para reação de IL-8.
As lâminas foram fotografadas e as enzimas quantificadas pelo software AxioVision no aumento de 40X do microscópio Axioskop 2 Zeiss. Para cada amostra, foram selecionadas três regiões do tecido cardíaco.
Dimensão fractal e entropia de Shannon
As lâminas fotografadas foram então binarizadas para leitura da dimensão fractal e entropia de Shannon. Elas foram estimada pelo método Box-counting, com auxílio do programa computacional ImageJ do Instituto Nacional de Saúde dos Estados Unidos (NIH), amplamente utilizado na literatura e disponível gratuitamente na Internet (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
Esse programa considera o Box-counting em duas dimensões, permitindo a quantificação da distribuição de pixels nesse espaço, não considerando, portanto, a textura da imagem. A influência disso é que duas imagens com a mesma distribuição dos pixels, uma binarizada e outra em níveis de cinza, possuirão a mesma DF. Com isso, a DF calculada com o ImageJ ficará sempre entre 0 e 2, não distinguindo texturas diferentes.
Análise estatística
Os dados obtidos foram submetidos ao teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov e, subsequentemente, a análises paramétrica pelo teste t de Student não pareado ou não paramétrica pelo teste de Mann-Whitney e exato de Fisher para dados categóricos. Os resultados foram expressos em média ± desvio padrão, ou mediana (percentil 25,75), quando necessário. Valor de P<0,05 foi considerado significante. Utilizou-se o programa de cálculos estatísticos GraphPad Instat e Prism 6.0, ambos para Windows®.
RESULTADOS
O peso médio dos animais foi 277,4±24,6 (Grupo 1) e 288±34,5 g (Grupo 2), respectivamente, não havendo diferença significante entre os grupos (P=0,4396). Com relação ao volume médio de Ringer Locke coletado de seio coronário ao final de 30 minutos (363,1±177,3 e 277,4±33,7 ml, respectivamente), não houve diferença significante entre os grupos (P=0,1923).
Achados durante perfusão com solução cardioplégica e Ringer Locke
Todos os corações apresentaram perfusão adequada de cardioplegia e Ringer Locke, demonstrada pela coloração clara na parede ventricular. A frequência cardíaca média após 5 minutos de perfusão (233±36 e 188±53,4 batimentos por minuto, respectivamente) apresentou diferença significante (P=0,0086). O tempo de início de fibrilação ventricular, (49±28,2 e 45±17 segundos, respectivamente) e o tempo de primeiro batimento (153±78 e 117±96,8 segundos, respectivamente) não mostraram diferença significante (P=0,5869 e P=0,187, respectivamente).
Análise da dimensão fractal e entropia de Shannon
A dimensão fractal com a utilização do marcador caspase foi 1,59±0,09 (sem unidade) para o grupo 1 e 1,55±0,13 para o grupo 2, respectivamente (P=0,4400), do KI-67 1,53±0,13 e 1,54±0,18, respectivamente (P=0,9595) e da IL-8 de 1,52±0,15 e 1,51±0,12, respectivamente (P=0,9164) (Figura 1).
Fig. 1 Histogramas demonstrando distribuição da dimensão fractal em: (A) caspase, (B) IL-8 e (C) KI-67. Grupo 1: solução com histidina-triptofano-cetoglutarato, Grupo 2: solução com histidinatriptofano- glutamato
A entropia de Shannon com a caspase foi 0,4±0,07 bits para o grupo 1 e 0,38±0,08 bits para o grupo 2 (P=0,5487), do KI-67 0,36±0,1 bits e 0,37±0,13 bits, respectivamente (P=0,9149), e da IL-8 0,35±0,11 bits e 0,35±0,08 bits, respectivamente (P=0,9678) (Figura 2).
Fig. 2 Histogramas demonstrando distribuição da entropia em: (A) caspase, (B) IL-8 e (C) KI-67. Grupo 1: solução com histidinatriptofano- cetoglutarato, Grupo 2: solução com histidina-triptofanoglutamato
DISCUSSÃO
Apesar de ainda não ser conhecido o efeito da substituição do cetoglutarato por glutamato na solução com histidina e triptofano, o glutamato possui papel bem documentado quando colocado como constituinte de solução cardioplégica. A adição de glutamato no perfusato mantém o ATP intracelular e diminui tanto o lactato quanto o piruvato, que contribuiriam para acidose. O glutamato exógeno e seus produtos de transaminação restauram seus conteúdos normalmente diminuídos no miocárdio hipóxico, aumentam a concentração de succinato, que leva a também aumento da formação de ATP por via anaeróbica na mitocôndria, aumentando assim a resistência do miócito à isquemia[9].
Outro processo que está intrinsecamente relacionado com lesão isquemia-reperfusão é a apoptose[17,18]. Essas mudanças são feitas por uma família de proteases denominadas caspases[19]. O grau de ativação das caspases é diretamente relacionado ao grau de apoptose[20]. Em contraste com a apoptose, a necrose é um processo irreversível de morte celular em que há ruptura da membrana celular, com extravasamento do citosol ao meio extracelular, marginação leucocitária e ativação da cascata inflamatória[20,21]. Em contraste com a morte celular os corações de mamíferos apresentam pequena capacidade proliferativa após o nascimento. Um dos marcadores utilizados para avaliar proliferação celular é o KI-67[22]. Com esse marcador, Walsh et al.[23] mostram que 12-23% dos cardiomiócitos fetais de ratos apresentam atividade proliferativa, passando a 1-8% até o 7º dia e praticamente indetectável a partir do 14º dia. Assim, selecionamos a análise da caspase, IL-8 e KI-67 para avaliação da apoptose, necrose proliferação celular, respectivamente.
A dimensão fractal é um parâmetro útil para caracterização de estruturas complexas irregulares, mas que quando observadas matematicamente, sua análise denota figuras regulares com característica de autossimilaridade, ou seja, assemelham-se a elas mesmas quando observadas em diferentes escalas de tamanho[24].
A dimensão fractal do objeto conta o número efetivo de graus de liberdade no sistema dinâmico e, portanto, quantifica a sua complexidade. Assim, infere-se que imagens evidenciando maior dimensão fractal sejam, consequentemente, mais complexas. Não se pode, porém, apenas pelo aspecto visual, quantificar essa complexidade. A dimensão fractal viria então sanar essa dificuldade ao adicionar um valor numérico[12].
O tamanho das caixas para cálculo da dimensão fractal no método Box-counting foi padronizado em 4, 8, 16, 32 e 64 pixels. Sabe-se que o tamanho do pixel depende do grau de resolução utilizado. Como comenta Tambasco et al.[24], o tamanho da caixa utilizado deve guardar uma certa relação com a estrutura estudada, pois pode ser tão pequeno que, na verdade, esteja avaliando subcomponentes da estrutura ou tão grande que, na verdade, estariam sendo incluídos na medição componentes dos arredores da estrutura de interesse e não a estrutura em si. Esses valores, no entanto, são os valores padrão utilizados na literatura e, portanto, provavelmente não causaram interferência nos resultados[12].
Em nosso estudo, não houve diferença significativa da dimensão fractal entre os grupos. Dessa maneira, consideramos que a distribuição das informações contidas nas lâminas dos corações tratados com as soluções HTK ou HTG não foram diferentes.
Uma contribuição importante na Teoria da Informação introduzida por CE Shannon em 1948 foi o conceito de Entropia como sendo a quantidade de informação em um sistema[25]. Vale ressaltar que não se deve confundir "entropia estado" da Termodinâmica com "entropia conceito" da Teoria da Informação[26].
Segundo Shannon, se X é o conjunto de todas as mensagens de x, e p (x) é a probabilidade (variando de 0 a 1) de uma mensagem x, então a entropia de X será[26]:
A entropia de Shannon quantifica o grau de "incerteza" ou grau de "complexidade" de uma informação. Por essa formulação fica fácil entender que, se a probabilidade de ocorrência de um determinado fato é de 100%, ou seja, se P=1 (ausência de incerteza), então a entropia contida na mensagem será zero (log 1 = zero)[26].
Considerando que uma imagem é o resultado de um processo estocástico, no qual a probabilidade pi do cálculo da entropia de Shannon corresponderia à probabilidade de um pixel apresentar uma determinada cor ou intensidade de cinza (variando de 0 a 255). Essa probabilidade de cada intensidade de cinza pode ser obtida facilmente pela construção de um histograma de frequências[26].
Entropia zero de uma imagem é obtida quando todos os pixels se apresentam com a mesma cor ou mesma intensidade de cinza (probabilidade 100%, ou seja 1; log 1=0). Por outro lado, a máxima entropia ocorreria quando a imagem contivesse a mesma quantidade de pixels para cada uma das intensidades presentes. Assim, demonstramos que a entropia não está relacionada com a disposição espacial da informação. Duas imagens podem possuir igual quantidade de pixels com a mesma intensidade e, portanto a entropia total seria a mesma, porém, distribuídos espacialmente de maneira diferente[26].
Em nosso estudo, não houve diferença significativa entre a entropia de Shannon entre os grupos. Dessa maneira, consideramos que as informações contidas nas lâminas dos corações tratados com as soluções HTK ou HTG não foram diferentes.
A literatura mostra vários trabalhos em que há diferença estatística entre grupos avaliados com dimensão fractal ou entropia de Shannon, chamando a atenção do leitor do seu caráter imageológico discriminativo, mas não apresenta qualquer relato da relevância quando os resultados encontrados não alcançam significância estatística, como o que ocorreu em nosso trabalho. A interpretação dos resultados deste estudo é que o grupo HTG não alterou a quantidade ou a distribuição da informação imageológica dos corações de rato quando comparados aos tratados com HTK.
A entropia de Shannon e a dimensão fractal quantificam a distribuição e o grau de complexidade da imagem, respectivamente. Assim, essa técnica não é comparável com o Western-Blot ou PCR, já que essas quantificam o valor total das proteínas estudadas e não sua distribuição ou seu grau de complexidade no tecido.
CONCLUSÃO
A quantidade e distribuição das informações avaliadas pela entropia de Shannon e dimensão fractal nas lâminas de coração de rato submetidas à cardioplegia com soluções HTK ou HTG não foram diferentes, o que mostra que a solução de HTG é tão boa quanto a HTK na preservação dos miócitos em modelo de coração isolado de rato.
| Papéis & responsabilidades dos autores | |
|---|---|
| MABO | Autor principal |
| ACB | Confecção dos gráficos |
| CAS | Confecção dos gráficos |
| PHHB | Manipulação dos animais |
| JLLC | Manipulação dos animais |
| MFG | Coorientador e ajuda na redação final |
| DMB | Orientador e ajuda na redação final |