INTRODUÇÃO

A indução da parada temporária do coração durante a cirurgia cardíaca é um procedimento relativamente comum que permite ao cirurgião realizar procedimentos em ambiente isento de sangue e movimento ^{[ 1 - 3 ]}. Um dos agentes cardioplégicos utilizados é a solução histidina-triptofano-cetoglutarato (HTK).

O HTK foi testado por Bretschneider et al. ^{[ 4 ]}, na Alemanha, em 1975. Seu mecanismo de ação vem da ausência do cálcio, que evita seu influxo para o interior da célula pelos canais de cálcio tipo "L" na fase de platô do potencial de ação, inibindo a liberação de mais cálcio do retículo sarcoplasmático do miócito, resultando na inativação dos miofilamentos ^{[ 5 , 6 ]}.

Esse mecanismo é complementado pela proteção celular dada pelos constituintes dessa solução, cujas funções principais incluem: 1- histidina: sistema tampão dependente de temperatura, inibidor de metaloproteinases de matriz e impermeante celular ^{[ 7 ]}; 2- triptofano: atua na manutenção da integridade da membrana celular ^{[ 8 ]} e, 3- cetoglutarato: melhora pressão máxima desenvolvida e evita aumento da fração MB da creatinofosfoquinase ^{[ 8 ]}.

Segundo Pisarenko et al. ^{[ 9 ]}, a substituição do alfacetoglutarato pelo glutamato traria algumas vantagens para o miócito: a diminuição do lactato e a elevação do pH na matriz mitocondrial, mesmo em isquemia, evitando a acidose intracelular e o edema, contribuindo para a manutenção do trifosfato de adenosina (ATP) intracelular, protegendo o miócito da lesão de isquemia-reperfusão.

Por sua vez, a redução da lesão de reperfusão provocaria diminuição da caspase ^{[ 10 - 12 ]} e da IL-8, devido à redução da apoptose e da necrose celular, respectivamente ^{[ 13 , 14 ]}. Entretanto, a diminuição da lesão de reperfusão pode não estar atuando sozinha em benefício ao miócito. Proteínas proliferativas, como o KI-67, poderiam voltar a serem codificadas, contribuindo para a redução da morte celular e mesmo formação de novas fibras miocárdicas ^{[ 15 , 16 ]}.

Este trabalho objetiva avaliar solução de HTG como agente cardioplégico em coração isolado de ratos, considerando análise imuno-histoquímica dos marcadores caspase, IL-8 e KI-67.

MÉTODOS

Após aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (autorização número 015/2012), foram utilizados 20 ratos (10 para cada grupo), machos, raça Wistar, com peso médio de 280±29 gramas.

Todos os animais receberam cuidados conforme recomendações do Committee on Care and Use of Laboratory Animals - Institute of Laboratory Animal Resources (ILAR) - National Research Council, Estados Unidos ^{[ 17 ]}.

RESULTADOS

O peso médio dos animais foi 277,4±24,6 g (grupo 1) e 288±34,5 g (grupo 2), respectivamente, não havendo diferença significante entre os grupos (P=0,4396). Com relação ao volume médio de Ringer Locke coletado de seio coronário ao final de 30 minutos (363,1±177,3 ml e 277,4±33,7 ml, respectivamente), não houve diferença significante entre os grupos (P=0,1923).

Achados imuno-histoquímicos

Após 2 horas de isquemia e 30 minutos de reperfusão, a atividade da caspase foi significativamente menor no grupo 2 (P<0,0001), a atividade de KI-67 foi maior no grupo 2 (P<0,0001) e a da IL-8 não foi diferente entre os grupos (Figura 1).

Fig. 1 Histogramas demonstrando densidades ópticas médias de: (A) caspase, (B) KI-67 e (C) IL-8. Grupo 1: solução com histidina-triptofano-acetoglutarato, Grupo 2: solução com histidinatriptofano- glutamato 

DISCUSSÃO

Isquemia miocárdica causa diversos efeitos cardíacos, tais como: diminui força de contração; aumenta pressão diastólica, indicando contratura das miofibrilas em condições isovolumétricas; provoca queda na fosfocreatina e ATP; diminui a contratura, glutamato e aspartato e; aumenta lactato, piruvato, alanina e succinato ^{[ 9 ]}. Segundo Pisarenko et al. ^{[ 9 ]}, a adição de glutamato no perfusato mantém o ATP intracelular e diminui tanto o lactato quanto o piruvato, que contribuiriam para acidose. Esses efeitos contribuem para melhorar a função cardíaca na recuperação após isquemia. Nossos resultados demonstram comportamento semelhante nas duas soluções estudadas referentes ao tempo de fibrilação ventricular e tempo de primeiro batimento, entretanto foi melhor para grupo 2 para frequência cardíaca, que se encontrava mais baixa, o que pode ser correlacionado provavelmente com menor acidose do miócito.

Outro processo que está intrinsecamente relacionado com lesão isquemia-reperfusão é a apoptose ^{[ 10 , 11 ]}, caracterizada por alterações morfológicas, como condensação da cromatina, fragmentação do núcleo e formação de "corpos apoptóticos". Essas mudanças são feitas por uma família de proteases denominadas caspases ^{[ 12 ]}. O grau de ativação das caspases é diretamente relacionado ao grau de apoptose, que desempenha fator crítico na recuperação da função cardíaca ^{[ 13 ]}. Nossos resultados demonstram atividade de caspase menor no grupo 2, sugerindo um potencial protetor para função miocárdica.

Em contraste com a apoptose, a necrose é um processo irreversível de morte celular em consequência à quebra na homeostase celular. Há ruptura da membrana celular, com extravasamento do citosol ao meio extracelular, marginação leucocitária e ativação da cascata inflamatória ^{[ 13 , 14 ]}. Anselmi et al. ^{[ 14 ]} descreveram pico da IL-8 em 35 minutos de reperfusão e da IL-6 em 75 minutos. Lee et al. ^{[ 13 ]} afirmaram que a solução de HTK inibe aumento das interleucinas. Assim, como nesta pesquisa não houve diferença significativa da IL-8 entre os grupos 1 e 2, podemos inferir que a proteção anti-inflamatória dada pela solução HTG não foi diferente daquela dada pela solução HTK.

Corações de mamíferos apresentam pequena capacidade proliferativa após o nascimento. Um dos marcadores utilizados para avaliar proliferação celular é o KI-67 ^{[ 15 ]}. Com esse marcador, Walsh et al. ^{[ 16 ]} demonstraram que 12% a 23% dos cardiomiócitos fetais de ratos apresentam atividade proliferativa, passando a 1% a 8% até o 7º dia e praticamente indetectável a partir do 14º dia. Em nosso estudo, houve aumento significativo do KI-67 no grupo 2, demonstrando atividade proliferativa precoce da solução HTG garantida já com 2 horas de isquemia. Associado a isso, Walsh et al. ^{[ 16 ]} também chamam a atenção da atividade do KI-67 também ser inversamente proporcional à apoptose, o que também é confirmado em nosso estudo, no qual a caspase é menor no grupo 2 que no 1. Entretanto, o aumento da atividade desse marcador é preocupante, pois já foi associado a mixomas ^{[ 19 , 20 ]} e sarcomas cardíacos ^{[ 21 ]}.

Apesar dos resultados aqui obtidos serem concordantes com os da literatura, ainda não são definitivos em relação à substituição do alfacetoglutarato pelo glutamato. Análises quantitativas com ATP e outros marcadores nucleares para proliferação celular devem ser utilizados visando a uma conclusão mais abrangente e segura. Outro aspecto relevante é a concentração do glutamato. Teria o mesmo efeito protetor no coração se alterarmos sua concentração? Novos estudos ainda são necessários para responder essas questões.

CONCLUSÃO

A análise imuno-histoquímica da substituição do alfacetoglutarato pelo glutamato na cardioplegia com histidina e triptofano demonstrou que as células musculares cardíacas não apresentaram maior ocorrência de necrose, visto pela mensuração da IL-8, apresentaram menor ocorrência de apoptose, confirmado pelos valores mais baixos da caspase no grupo 1 e melhor atividade proliferativa, com valores maiores da KI-67 em relação ao grupo 1. Isso sugere que a solução HTG foi mais eficiente que a HTK na preservação dos cardiomiócitos dos corações de ratos.