Introdução

O carcinoma de células escamosas é a neoplasia mais frequente da laringe e da região glótica e seu prognóstico depende do tamanho da lesão, do nível de invasão local, disseminação cervical linfática e existência de metástases à distância.^{1 - 5} O comportamento do carcinoma de células escamosas é marcado pelo grau de proliferação e diferenciação celular e este índice pode ser inferido pela medida do Ki-67.^{6 - 10}

Histologicamente, o carcinoma epidermóide ou escamocelular destas regiões é semelhante ao das outras. É definido pela proliferação neoplásica de células escamosas em diferentes graus de diferenciação e pelo caráter infiltrativo. Na dependência do poder de queratinização e atipias celulares são graduados em: bem, moderado ou pouco diferenciado.¹

O bem diferenciado se caracteriza pela semelhança com o epitélio escamoso normal; alto poder de corneificação e atipias celulares muito leves; o moderadamente diferenciado contém pleomorfismo nuclear distinto, atividade mitótica presente, incluindo figuras atípicas. Neste a queratinização é bem menor.^{1 , 2}

No pouco diferenciado predominam células imaturas, com numerosas figuras de mitose e queratinização, praticamente, ausente. Em relação ao nível de invasão, poder estar limitado ao epitélio, respeitando a lâmina basal, denominado in situ. Quando compromete apenas a lâmina própria, é considerado microinvasor ou superficialmente invasivo.²

Já o carcinoma francamente invasivo se manifesta pela destruição da lâmina basal, com extensão notória para os tecidos subjacentes, podendo ser acompanhado de reação estromal. Invasão perineural e angiolinfática são sinais de maior agressividade e mudança do estadiamento, respectivamente.³

Broders propôs um método para graduação do carcinoma de células escamosas.^{11 , 12} A classificação estabelecida em 1920 e, posteriormente, revisada em 1925 baseou-se no princípio fundamental de diferenciação celular, sendo totalmente dissociada da história clinica. Os carcinomas foram divididos em quatro graus, variando de I a IV. Carcinomas grau I apresentavam até 25% de células indiferenciadas. Aqueles de grau II possuíam de 25% a 50% de indiferenciação. Os de grau III apresentavam células indiferenciadas ocupando de 50% a 75% do tumor e naqueles de grau IV, observava-se indiferenciação de 75% a 100% do tumor (tabela 1).^{11 , 12}

A classificação histopatológica de malignidade proposta pela OMS (Organização Mundial da Saúde, 2005) baseou-se no grau de diferenciação celular e permitiu o agrupamento dessa neoplasia maligna em três categorias, em bem, moderadamente e pouco diferenciados (tabela 2).^{2 , 11 - 13}

O bem diferenciado se caracteriza pela semelhança com o epitélio escamoso normal; alto poder de corneificação e atipias celulares muito leves; o moderadamente diferenciado contém pleomorfismo nuclear distinto, atividade mitótica presente, incluindo figuras atípicas. Neste a queratinização é bem menor.²

No pouco diferenciado predominam células imaturas, com numerosas figuras de mitose e queratinização, praticamente, ausente. Em relação ao poder de invasão, poder estar limitado ao epitélio, respeitando a lâmina basal, denominado in situ. Quando compromete apenas a lâmina própria, é considerado microinvasor ou superficialmente invasivo.²

Já o carcinoma francamente invasivo se manifesta pela destruição da lâmina basal, com extensão notória para os tecidos subjacentes, podendo ser acompanhado de reação estromal. Invasão perineural e angiolinfática são sinais de maior agressividade e mudança do estadiamento, respectivamente.³

A mensuração das figuras de mitose, prática comum na avaliação de neoplasias quanto à sua velocidade de crescimento e grau de agressividade, esta longe da sua acurácia desejada, visto que, não é possível saber, através de cortes histológicos de rotina corados pela H&E, quais são exatamente as células que entraram no ciclo de divisão celular. Isto se deve ao fato de que as fases: G1, S e G2, do ciclo celular, não serem identificadas na microscopia óptica (fig. 1).¹²

Figura 1 Fases do ciclo celular. G1, S, G - presença de MKI67. 

Ki-67(MKI67) é uma proteína presente no núcleo, cuja função está relacionada com a proliferação celular. Esta proteína somente é expressa no ciclo de divisão celular: na interfase (G1, S, G2); prófase; metáfase; anáfase e telófase, e está ausente na fase G0, quando a célula está quiescente, portanto, é um excelente marcador de divisão celular.^{11 - 14}

Para evidenciar a expressão desta proteína nuclear é utilizado o Anticorpo monoclonal Ki-67. Este anticorpo se liga ao seu antígeno-específico (MKi67) presente nos núcleos das células em proliferação, corando-os e evidenciando todas as células que entraram no ciclo de divisão.^{12 , 13}

Através da microscopia óptica é possível contar o número de células por campo ou áreas hot spots, que estão coradas, e calcular o Índice de proliferação (Ki-67 INDEX). A análise deste índice é o que nos permite caracterizar o grau de proliferação celular tumoral (taxa de crescimento) e, consequentemente, o seu grau de agressividade, maior risco de novos clones tumorais, mutações, o que dificulta a restrição do tumor pelo sistema imunológico.^{12 , 13}

Este estudo tem como objetivos avaliar a expressão do marcador Ki-67 em Carcinoma de células escamosas da laringe glóticos, e correlacionar quanto aos achados anatomopatológicos e proliferação celular.

Materiais e métodos

Trata-se de um estudo clínico experimental realizado com um corte transversal em uma coorte histórica, através de estudo de materiais provenientes de cirurgias de ressecção de carcinoma de células escamosas de glote de pacientes de hospital universitário terciário especializado. Os procedimentos realizados pelos pacientes foram hemi-laringectomias, laringectomias totais, e retirada das cordas vocais com respectivas linfadenectomias.

Para facilitar a análise estatística os tumores glóticos foram divididos em bem diferenciados e moderadamente/pouco diferenciados.

Foram levantados os casos de tumores de carcinoma de células escamosas em gloteno banco de dados do acervo do Departamento de Anatomia Patológica de um hospital universitário terciário, no período de 1994 a 2004. Nesta amostra encontramos 99 casos no total. 85 casos eram de tumores moderadamente/pouco diferenciados, sendo 41 casos produtos de peças cirúrgicas e 44 casos de biópsias que foram tratados de forma não cirúrgica (quimio/radioterapia). 14 casos eram de tumores bem diferenciados, sendo oito casos produtos de peças cirurgias, e seis casos de biopsia que foram tratados de forma não cirúrgica (quimio/radioterapia).

Para o estudo foram utilizados somente casos que eram produtos de peças cirúrgicas, excluídos casos de biópsias, que por se tratar de fragmentos aleatórios do tumor, trariam viés ao estudo. Dos oito casos bem diferenciados produtos de peças cirúrgicas, dois casos não tinham seus blocos de parafina disponíveis para novos cortes.

Desta forma o estudo foi realizado com seis casos de tumores glóticos de laringe do tipo bem diferenciado, e separado 10 casos de tumores glóticos de laringe do tipo moderadamente/pouco diferenciado aleatoriamente para montar o grupo comparativo. Os grupos não tiveram o mesmo número de casos, pois no banco analisado não foram encontrados casos suficientes para completar o grupo que continha tumores bem diferenciados.

Os critérios de inclusão utilizados foram: tumores glóticos de laringe cujos blocos de parafina foram localizados e continham material suficiente para novos cortes. Os dados clínicos e o estadiamento tumoral foram obtidos a partir dos prontuários (tabela 3).

O trabalho foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética da instituição (nº 485/11).

Para os exames imunohistoquímicos foi utilizado método avidina-biotina-peroxidase e utilizou-se o seguinte anticorpo: Ki-67 (Clone MIB-1, IgG1, 1:150, marca Dako, pré tratado com Tris-EDTA).

Foram feitos controles positivos e negativos do marcador, com a finalidade de compará-los com os casos estudados. Como controle positivo utilizou-se tecido linfoide.

A leitura das lâminas foi feita de forma randomizada, por um investigador que não tinha o conhecimento do diagnóstico prévio dado pelo patologista, e nem o conhecimento do status clínico do paciente, de forma comparativa com os controles positivos e negativos. Fotografias digitalizadas em grande aumento (400×) foram feitas das áreas altamente reativas (Hot spots), com a utilização de máquina fotográfica Nikon COOLPIX Câmera 995. Após isso, as imagens foram enviadas ao computador para análise histológica que utilizou o software Imagelab 2000.

Todos os parâmetros foram avaliados de forma cega.

A avaliação da taxa de proliferação celular foi feita utilizando-se razão percentual comum, como já é utilizado na literatura.^{8 , 9} Foram selecionadas cinco áreas de maior intensidade de expressão do imunomarcador (hot spots). Contado no mínimo 500 células, e feita a relação do número de células que apresentam seu núcleo positivamente corado com o número total de células contadas. A relação percentual foi estratificada da seguinte maneira: < 5% - baixa taxa de proliferação celular; entre 5% e 10% - leve taxa de proliferação celular; entre 10%-30% - moderada taxa de proliferação celular; > 30% - alta taxa de proliferação celular.

Para simplificação e melhor analisar os dados, estes foram agrupados da seguinte forma:

Índice de proliferação celular:

Baixa e leve proliferação celular

Moderada e alta proliferação celular

Tipo histológico:

Glótico bem diferenciado

Glóticos moderadamente/pouco diferenciados

Análise estatística

Após agrupamento dos dados, foram feitas as análises estatísticas com o software IBM SPSS Statistics^(r) utilizando teste de Qui-Quadrado e Teste Exato de Fisher.

Resultados

Foram avaliados 16 casos no total, sendo seis casos bem diferenciados e 10 casos moderadamente/pouco diferenciados.

Entre os tumores glóticos bem diferenciados (n = 6 casos), quatro casos tiveram baixa/leve proliferação celular e dois casos tiveram moderada/alta proliferação celular. Nos tumores glóticos moderadamente/pouco diferenciados (n = 10 casos), um caso teve baixa/leve proliferação celular e nove casos tiveram moderada/alta proliferação celular

Na análise de correlação de grau de diferenciação celular versus o índice de proliferação celular houve uma significância estatística (p < 0,05) na comparação entre os grupos sendo o teste exato de Fischer bi-caudal com p = 0,036.

Considerando o tipo histológico como padrão ouro para se avaliar a diferenciação celular nos carcinomas de laringe, o índice de proliferação celular apresentou sensibilidade de 0,9; especificidade de 0,67; valor preditivo positivo de 0,82 e valor preditivo negativo de 0,8 (tabela 4).

Discussão

O índice de proliferação celular mostrou correlação positiva com o grau de diferenciação celular, sendo maior nos casos moderadamente/pouco diferenciados. Este achado corrobora a ideia de que quanto mais indiferenciada é a neoplasia, menor é o seu controle do processo de divisão celular e maior é a sua proliferação.⁸ Nesta avaliação houve significância estatística entre a correlação dos tipos tumorais e o índice de proliferação celular (p < 0.05).

Nos estudos de Rodrigues et al., não encontraram correlação entre a imuno expressão do KI67 e valor prognóstico,^{7 , 14 , 15} porém, a super expressão do KI-67 associado a ideia de descontrole mitótico, crescimento e proliferação celular descontrolada não estariam associados a fatores prognósticos e priorização de abordagem destes pacientes?

Fato interessante apontado em estudo retrospectivo canadense, sobre a utilização clínica do Ki-67, evidencia que a super expressão do Ki-67 se correlaciona com um alto risco de recorrência cervical após tratamento com radioterapia, sendo assim, tais casos deveriam ter tratamento em estágios mais precoces e direcionados.¹⁶

Outros sítios tumorais da região de cabeça e pescoço, como a cavidade oral, também têm evidências que a super expressão de marcadores como o p53 e o Ki-67 configuram uma situação de maior risco e pior prognóstico ao esse tipo de carcinoma escamoso.¹⁷

Em estudo com animais expostos a tabaco foi observado apenas o desenvolvimento de lesões benignas e nenhuma evolução para tumores malignos. Na avaliação histológica desses animais foi observada uma ausência de marcação pelo p53, porém foi notada uma positividade do Ki-67 relacionado com a lesão pelo tabaco.¹⁸

Na avaliação do prognóstico clínico de pacientes com carcinomas epidermoides de laringe, foi observado que o marcador Ki67 associado ao Ki-S11 é uma ferramenta importante de auxílio na abordagem clínica e na análise do prognóstico. Os pacientes com baixa taxa de proliferação celular avaliada por esses marcadores tiverem uma menor taxa de recorrências, com significância estatística (p < 0,05) e com uma melhor sobrevida em 5 anos comparado ao grupo com alta taxa de proliferação celular.¹⁹

Para aplicação clínica do Ki-67 ainda foi demonstrado que o grupo de pacientes com sua expressão considerada positiva teve maior taxa de recorrência local, mesmo após a radioterapia. É sugerido que esses pacientes tenham um protocolo de seguimento personalizado e mais por menorizado.¹⁶ Porém em outro grupo de pacientes avaliados, foi identificado que tumores glóticos que acometem a comissura anterior e que apresentam super expressão do Ki-67 tiveram um desempenho melhor e tiverem seus tumores considerados como radio sensíveis, com relevância significativa dos resultados.²⁰

A literatura também aponta a metodologia empregada na avaliação anatomopatológica de carcinomas epidermóides de laringe avançado. No estudo citado foi demonstrada uma heterogeneidade na expressão do Ki-67 em áreas de atividade tumoral celular, portanto uma metodologia da avaliação deve ser bem estabelecida e a variabilidade de estudos prévios que correlacionam a expressão dos imunomarcadores com fatores prognósticos pode ser explicada por tal característica.²¹

A avaliação de lesões precursoras de carcinomas (hiperplasias, carcinoma in situ) também foram estudos com os imunomarcadores como o Ki-67 e o p-16. Destas lesões o carcinoma in situ tende a ter maior positividade do que as hiperplasias isoladas.²²

Apesar de termos encontrado correlação significativa entre o índice de proliferação celular e o grau diferenciação histológica do tumor, houve dois casos (18%) em que o índice de proliferação celular foi moderado/alto mesmo em tumores bem diferenciados. Considerando que mesmos alguns tumores bem diferenciados apresentaram alto índice de proliferação celular, possivelmente estes tumores apresentam comportamento mais agressivo, pois como aumento populacional de células tumorais é grande a chance de haver descontrole mitótica é maior. Novos clones que podem ser mais agressivos por mutações, e dificuldade de restrição pelo sistema imunológico, podem ter melhor resposta a quimioterapia e radioterapia. Consideramos que futuros trabalhos para avaliar o comportamento de tumores bem diferenciados com alto índice de proliferação celular poderão auxiliar no manejo destes pacientes.

Vale ressaltar que apesar de nosso estudo ter tido um n de 16 pacientes, limitado por dificuldade da obtenção de material cirúrgico de casos glóticos bem diferenciados, enfatizou o estudo nesta região específica da laringe, diferente de outros estudos com n maiores que envolveram pacientes com carcinoma de qualquer região da laringe. Portanto nosso estudo corrobora a correlação da expressão maior do Ki-67 em tumores mais indiferenciados,⁸ e demonstra que esta correlação também se aplica especificamente para os tumores glóticos de laringe.

Acreditamos que a relação entre a expressão do Ki-67 com critérios clínicos e prognósticos ainda não é clara. Essa relação ainda apresenta bastantes controvérsias na literatura médica mundial, tanto em estudos clínicos quanto experimentais. A relevância da utilização de imunomarcadores é evidente, porém outros estudos são necessários para definir melhor em quais pacientes os imunomarcadores devem ser utilizados na prática clínica.

Conclusão

Este estudo demonstrou que o índice de proliferação celular, medido pelo Ki-67 pode ser útil na caracterização do grau histológico em tumores glóticos de células escamosas da laringe. Outros estudos são necessários para avaliar o comportamento de tumores bem diferenciados com alto índice de proliferação celular para definir a melhor conduta terapêutica nestes pacientes. Outros fatores devem estar implicados quanto à patogênese e progressão tumoral desta doença na glote.