INTRODUÇÃO

A citometria de fluxo (CF) é uma ferramenta essencial para o diagnóstico, prognóstico e acompanhamento terapêutico de diversas neoplasias hematológicas, bem como para as imunodeficiências primárias ou adquiridas^(1-3).

A imunofenotipagem por CF quantifica as populações e subpopulações linfocitárias (SPL), avaliando, basicamente, as expressões antigênicas de CD19 e CD20 para linfócitos B; CD2, CD3, CD4 e CD8 para linfócitos T; e CD56 e CD16 para identificação de células natural killer (NK)^(2,4). A quantificação dessas populações auxilia o monitoramento de terapias imunossupressoras e imunomodulatórias e o diagnóstico e monitoramento de imunodeficiências primárias, além de contribuir para a avaliação de populações linfocitárias pós-transplante^(4-6). Além disso, a quantificação de linfócitos T CD4 no sangue periférico de pacientes portadores da síndrome de imunodeficiência adquirida (Aids) é importante para avaliar a progressão e a resposta da doença ao tratamento^(7-9).

O aumento do número de indivíduos portadores do vírus da imunodeficiência humana (HIV) proporcionou um avanço considerável da CF. A busca por serviços equipados com a tecnologia de quantificação de linfócitos T CD4 tornou-se cada vez mais frequente, e a utilização de ferramentas que agregam rapidez, eficiência e qualidade ao diagnóstico e ao monitoramento de imunodeficiências tem sido fundamental na prática clínica^(8,10).

A técnica de CF revolucionou a maneira como as células são caracterizadas e identificadas e, ao longo dos anos, essa plataforma progrediu com diversos avanços em hardware e software que visam melhorar o fluxo de trabalho, resultando em maior produtividade, qualidade e redução de custos. Porém, a CF ainda é uma técnica laboriosa que envolve várias etapas técnicas de lavagem, marcação, aquisição e análise das amostras, o que aumenta significativamente as chances de erro durante o processo⁽¹¹⁾.

O equipamento Aquios CL - Beckman Coulter (BC) é uma ferramenta de automação completa em CF. É denominado Load & Go flow cytometer para quantificação de subpopulações linfocitárias na rotina diagnóstica, representando um avanço real e significativo na área de diagnóstico laboratorial^{(11, 12)}. Este trabalho teve como objetivos validar e comparar a quantificação em frequência e números absolutos das subpopulações linfocitárias realizadas no Aquios CL com os resultados obtidos pela plataforma dupla realizada no Cytomics FC500 (BC) e no analisador automatizado de células Sysmex XE2100 (Sysmex). Ademais, discutiremos os reais benefícios da utilização desse equipamento na rotina diagnóstica.

MATERIAIS E MÉTODOS

RESULTADOS

A comparação entre as diferentes plataformas de quantificação linfocitária levou em consideração os resultados em frequência e números absolutos e a interpretação final dos testes.

A análise das 72 amostras demonstrou correlação estatisticamente aceitável entre os painéis utilizados no Aquios CL e o painel utilizado no Cytomics FC500. Para a identificação percentual da população de linfócitos T CD3, CD4 e CD8, o CCI foi de 0,989, 0,959 e 0,977, respectivamente. O parâmetro da relação CD4/CD8 apresentou correlação aceitável de 0,740, e a interpretação dos resultados foi a mesma em ambas as plataformas.

Na análise percentual da população de linfócitos B, o CCI foi de 0,997, enquanto para as células NK, a correlação obtida foi de 0,98 (Tabela 5).

As estratégias de gates utilizadas para identificar e quantificar a frequência dos linfócitos T, B e NK para o Aquios CL estão representadas nas Figuras 1 e 2; para o Cytomics FC500/software Kaluza, na Figura 3.

FIGURA 1 Estratégia de gate utilizada no Aquios CL com o Tetra Panel 1A população de linfócitos é selecionada por meio dos gates EV-Lin × Side Scatter (A) e SS-Lin × CD45 (B). Essa população é combinada em um gate denominado Lymphs All (C), e dentro da população CD3+, podemos identificar os linfócitos T CD4 e CD8 (D). 

FIGURA 2 Estratégia de gate utilizada no Aquios CL com o Tetra Panel 2A e D) a população de linfócitos é selecionada por meio do SS-Lin × CD45; B e E) essa população é combinada em um gate denominado Lymphs All; C) dentro da população CD3+, podemos identificar os linfócitos T CD4 e CD8; F) dentro da população CD3, podemos identificar os linfócitos NK CD56+/CD16+ e os linfócitos B CD19+. 

FIGURA 3 Estratégia de gate utilizada no citômetro FC500 e software de análise KaluzaA) seleção da população viável por meio de Side Scatter × Forward Scatter; B) Side Scatter × CD45 com gate na região de linfócitos totais; C, D e E) dentro do gate linfócitos, identificamos as populações de linfócitos T, B e NK; F, G e H) ainda dentro do gate linfócitos, identificamos a população de linfócitos T CD3 e as subpopulações CD4 e CD8. 

DISCUSSÃO

A melhoria no fluxo de trabalho da CF é uma necessidade real nos laboratórios clínicos que buscam melhorar a produtividade, a qualidade e a redução dos custos. O equipamento Aquios CL atende essa demanda, pois proporciona melhorias na padronização técnica; reduz os erros pré-analíticos; evita troca de amostras, uma vez que todas as pipetagens são automatizadas e os reagentes/as amostras são monitorados por códigos de barra; aperfeiçoa o treinamento de funcionários; elimina a subjetividade da análise; monitora o controle de qualidade; e reduz o tempo de liberação dos resultados. Além disso, por ser um sistema fechado, o equipamento fornece ao operador uma manipulação segura da amostra, evitando contaminação biológica.

Nossos resultados demonstram significância estatística ao comparar a quantificação das subpopulações linfocitárias entre Aquios CL e Cytomics FC500, o que corrobora dados já publicados. Gossez et al. (2011)⁽¹¹⁾ evidenciaram que o Aquios CL obteve boa correlação na quantificação de linfócitos T CD4 quando comparado com o FC500. Ademais, ele pode ser utilizado na rotina diagnóstica e também em testes de proficiência.

Grossi et al. (2018)⁽¹²⁾ demonstraram boa correlação entre o Aquios CL em comparação com o bead-based assay do equipamento BD FACSCanto II. Esse estudo também demonstra uma importante diminuição do tempo de atendimento total (TAT) por se tratar de um equipamento automatizado.

Em um trabalho publicado recentemente por Degandt et al. (2018)⁽⁴⁾, o desempenho do Aquios CL em relação à plataforma dupla Sysmex XE-5000 e BD FACSCanto II foi aceitável, entretanto, cerca de um terço das amostras necessitaram de ajuste manual no gate de linfócitos. Uma vantagem do software do Aquios CL é o sistema de flags, que sinaliza a necessidade de revisão de gate.

O sistema Load & Go flow cytometer do Aquios proporciona a preparação da amostra em conjunto com análise de fluorescência; gera resultados de frequência e números absolutos em um único equipamento (plataforma única); e tem a possiblidade de interface dos resultados com os sistemas informatizados dos laboratórios clínicos^(10,11).

A avaliação do custo não fez parte do escopo do nosso estudo, mas sabidamente os reagentes dos Aquios CL são mais caros do que aqueles utilizados na CF convencional. Entretanto, se levarmos em consideração todos os benefícios técnicos já descritos para o Aquios, principalmente a redução significativa da mão de obra técnica devido à automação completa, é possível garantir que esse equipamento gere viabilidade econômica importante para laboratórios clínicos com grande volume de amostras.

A automação em CF acrescenta novas perspectivas para a técnica e proporciona melhoria na qualidade e na produtividade do processo, eliminando as chances de erro quase completamente.

Pela automação do processo de quantificação das células CD4, é possível não depender da formação e expertise de pessoal técnico, tornando o processo mais simplificado e independente de mão de obra especializada em sua realização, mas a interpretação e os níveis de revisão continuam sendo fundamentais no processo pós-analítico para o disparo do alerta na área clínica.

CONCLUSÃO

O equipamento Aquios CL apresentou excelente desempenho na quantificação de subpopulação linfocitária. Por se tratar de um equipamento com automação completa, promoveu padronização, qualidade e redução no tempo do procedimento técnico, tornando-se uma ferramenta adequada e viável em laboratórios clínicos com alto fluxo amostral.