Desempenho do citômetro de fluxo Aquios CL na quantificação automatizada de subpopulações linfocitárias

Desempenho do citômetro de fluxo Aquios CL na quantificação automatizada de subpopulações linfocitárias

Autores:

Laiz C. Bento,
Rodolfo P. Correia,
Eduardo C. Pedro,
Anderson M. Alexandre,
Andressa C. Vaz,
Daniela Schimidell,
Rodrigo S. Barroso,
Nydia S. Bacal

ARTIGO ORIGINAL

Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial

versão impressa ISSN 1676-2444versão On-line ISSN 1678-4774

J. Bras. Patol. Med. Lab. vol.55 no.4 Rio de Janeiro jul./ago. 2019 Epub 02-Set-2019

http://dx.doi.org/10.5935/1676-2444.20190034

INTRODUÇÃO

A citometria de fluxo (CF) é uma ferramenta essencial para o diagnóstico, prognóstico e acompanhamento terapêutico de diversas neoplasias hematológicas, bem como para as imunodeficiências primárias ou adquiridas(1-3).

A imunofenotipagem por CF quantifica as populações e subpopulações linfocitárias (SPL), avaliando, basicamente, as expressões antigênicas de CD19 e CD20 para linfócitos B; CD2, CD3, CD4 e CD8 para linfócitos T; e CD56 e CD16 para identificação de células natural killer (NK)(2,4). A quantificação dessas populações auxilia o monitoramento de terapias imunossupressoras e imunomodulatórias e o diagnóstico e monitoramento de imunodeficiências primárias, além de contribuir para a avaliação de populações linfocitárias pós-transplante(4-6). Além disso, a quantificação de linfócitos T CD4 no sangue periférico de pacientes portadores da síndrome de imunodeficiência adquirida (Aids) é importante para avaliar a progressão e a resposta da doença ao tratamento(7-9).

O aumento do número de indivíduos portadores do vírus da imunodeficiência humana (HIV) proporcionou um avanço considerável da CF. A busca por serviços equipados com a tecnologia de quantificação de linfócitos T CD4 tornou-se cada vez mais frequente, e a utilização de ferramentas que agregam rapidez, eficiência e qualidade ao diagnóstico e ao monitoramento de imunodeficiências tem sido fundamental na prática clínica(8,10).

A técnica de CF revolucionou a maneira como as células são caracterizadas e identificadas e, ao longo dos anos, essa plataforma progrediu com diversos avanços em hardware e software que visam melhorar o fluxo de trabalho, resultando em maior produtividade, qualidade e redução de custos. Porém, a CF ainda é uma técnica laboriosa que envolve várias etapas técnicas de lavagem, marcação, aquisição e análise das amostras, o que aumenta significativamente as chances de erro durante o processo(11).

O equipamento Aquios CL - Beckman Coulter (BC) é uma ferramenta de automação completa em CF. É denominado Load & Go flow cytometer para quantificação de subpopulações linfocitárias na rotina diagnóstica, representando um avanço real e significativo na área de diagnóstico laboratorial(11, 12). Este trabalho teve como objetivos validar e comparar a quantificação em frequência e números absolutos das subpopulações linfocitárias realizadas no Aquios CL com os resultados obtidos pela plataforma dupla realizada no Cytomics FC500 (BC) e no analisador automatizado de células Sysmex XE2100 (Sysmex). Ademais, discutiremos os reais benefícios da utilização desse equipamento na rotina diagnóstica.

MATERIAIS E MÉTODOS

Amostras

Setenta e duas amostras de sangue periférico foram analisadas. A quantificação de linfócitos T CD3, CD4 e CD8 foi realizada em todas as amostras; e a quantificação de linfócitos B CD19+ e células NK CD16+CD56+, em 28 das 72 amostras. Estas foram coletadas em um tubo que continha o anticoagulante ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) e processadas em até 24 h após a coleta. Os pacientes apresentaram mediana de idade de 47 anos (faixa etária entre 1 e 99 anos); 37 eram do sexo masculino.

Cytomics FC500 e Sysmex XE2100

A contagem de leucócitos foi realizada no contador automatizado de células Sysmex XE2100 pela técnica de impedância e leitura óptica. O diferencial de leucócitos foi liberado automaticamente pelo equipamento e, quando necessário, um esfregaço sanguíneo era confeccionado para avaliação microscópica e quantificação acurada dos linfócitos totais.

Para a caracterização e a quantificação de subpopulações linfocitárias T CD3, CD4 e CD8, as amostras foram marcadas em um único tubo com os anticorpos monoclonais descritos na Tabela 1. Para identificar a população de células NK e linfócitos B, utilizamos três tubos de marcação com os monoclonais descritos nas Tabelas 1 e 2. Após marcação e incubação de 20 minutos, a lise de células vermelhas e a fixação dos leucócitos foram realizadas pelo sistema automatizado no-wash Coulter TQ-PREP (Beckman Coulter, SN: AV26068). Em seguida, as amostras foram adquiridas no citômetro de fluxo Cytomics FC500, e a análise dos dados foi realizada no software CXP Cytometer 2.2 e no Kaluza (Beckman Coulter).

TABELA 1 Anticorpos monoclonais utilizados para a identificação de subpopulações linfocitárias linfocitárias T CD3/CD4/CD8 e B no Cytomics FC500 

Marcadores Clone
Fluorocromos Subpopulação linfocitária
T CD3/CD4/CD8
Subpopulação
linfocitária B
Subpopulação linfocitária
T CD3/cd4/CD8
Subpopulação
linfocitária B
Fabricante
FITC CD8 CD19 SFCI21Thy2D3 B8 Beckman Coulter
PE CD4 2DC SFCI12T4D11 SFCI3Pt2H9 Beckman Coulter
ECD CD45 CD45 J33 J33 Beckman Coulter
PC5 CD3 CD3 UCHT1 UCHT1 Beckman Coulter

FITC: isotiocianato de fluoresceína; PE: ficoeritrina; ECD: ficoeritrina texas red x.

TABELA 2 Anticorpos monoclonais utilizados para a identificação de subpopulações linfocitárias NK no Cytomics FC500 

Fluorocromos Marcadores Clone Fabricante
FITC CD3 UCHT1 Beckman Coulter
PE CD56/16 N901/3G8 Beckman Coulter
ECD CD45 J33 Beckman Coulter
PC5 CD2 39C1.5 Beckman Coulter

FITC: isotiocianato de fluoresceína; PE: ficoeritrina; ECD: ficoeritrina texas red x.

Aquios CL

O Aquios CL é citômetro de fluxo, um sistema de plataforma única e contador automatizado de células que tem a vantagem de utilizar a impedância para a quantificação absoluta de leucócitos, e não a estratégia convencional da CF por meio de partículas fluorescentes (beads) de concentração conhecida.

Para avaliação e quantificação das subpopulações linfocitárias T CD3, CD3/CD4 e CD3/CD8, foi utilizado o mix de anticorpos monoclonais descrito na Tabela 3, disponível no formato ready-to-use, denominado Tetra Panel 1. Na análise das populações de linfócitos B e células NK, o sistema utiliza o mix de anticorpos monoclonais Tetra Panel 2, descrito na Tabela 4. A utilização do Tetra Panel 1 e 2 para quantificação completa das subpopulações linfocitárias T, B e NK é denominada de Aquios Tetra Combo.

TABELA 3 Cocktail de anticorpos monoclonais utilizados para a caracterização de subpopulações de linfocitos T no Aquios CL 

Fluorocromos Tetra 1 - Panel Clone Fabricante
FITC CD45 B3821F4A Beckman Coulter
RD1 4DC SFCI12T4D11 Beckman Coulter
ECD CD8 SFCI21Thy2D3 Beckman Coulter
PC5 CD3 UCHT1 Beckman Coulter

FITC: isotiocianato de fluoresceína; ECD: ficoeritrina texas red x. Aquios CL flow cytometer performance in the automated quantification of lymphocyte subpopulations

TABELA 4 Cocktail de anticorpos monoclonais utilizado para a caracterização de subpopulações de linfócitos B e NK no Aquios CL 

Fluorocromos Tetra 2 - Panel Clone Fabricante
FITC CD45 B3821F4A Beckman Coulter
RD1 CD16/CD56 N901/NKH-1, 3G8 Beckman Coulter
ECD CD19 J3-119 Beckman Coulter
PC5 CD3 UCHT1 Beckman Coulter

FITC: isotiocianato de fluoresceína; ECD: ficoeritrina texas redx.

No Aquios CL, a marcação das amostras foi realizada em microplaca de 96 poços de maneira automatizada; a lise de células vermelhas, por meio da técnica no-wash. A análise dos dados foi realizada pelo próprio equipamento usando a estratégia automática de gate. Entretanto, o software permite que o usuário faça ajustes finos nos gates, quando necessário.

Análise estatística

Os resultados para cada método foram descritos com o uso de média e desvio padrão (DP), e a concordância entre os métodos para cada parâmetro foi verificada com o uso do coeficiente de correlação intraclasse (CCI) e dos intervalos de confiança (IC) com 95%. A diferença entre os métodos foi estimada calculando-se a repetibilidade para cada parâmetro. Realizou-se a análise estatística com o software SPSS, versão 22.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA).

RESULTADOS

A comparação entre as diferentes plataformas de quantificação linfocitária levou em consideração os resultados em frequência e números absolutos e a interpretação final dos testes.

A análise das 72 amostras demonstrou correlação estatisticamente aceitável entre os painéis utilizados no Aquios CL e o painel utilizado no Cytomics FC500. Para a identificação percentual da população de linfócitos T CD3, CD4 e CD8, o CCI foi de 0,989, 0,959 e 0,977, respectivamente. O parâmetro da relação CD4/CD8 apresentou correlação aceitável de 0,740, e a interpretação dos resultados foi a mesma em ambas as plataformas.

Na análise percentual da população de linfócitos B, o CCI foi de 0,997, enquanto para as células NK, a correlação obtida foi de 0,98 (Tabela 5).

TABELA 5 CCI obtido na comparação do FC500 com o Aquios CL 

Variável FC500 Aquios CCI IC (95%) Repetibilidade
Média DP n Média DP n Inferior Superior
CD3 % 72,7 16,8 72 72,1 15,9 72 0,989 0,982 0,993 1,7
CD3/mm3 1.661,1 1.249,3 72 1.397,6 948,7 72 0,883 0,751 0,938 337,7
CD4 % 41,7 14,8 72 41,1 14,5 72 0,959 63,90 0,974 3
CD4/mm3 945,3 962,6 72 799,1 728,1 72 0,91 0,836 0,948 237,5
CD8 % 27,4 13,7 72 28,7 13,1 72 0,977 0,95 0,988 1,8
CD8/mm3 587,5 451,8 72 552 375,8 72 0,874 0,809 0,918 146,5
CD19 % 18,5 21,1 28 19,2 20,5 28 0,997 0,992 0,999 1,1
CD19/mm3 698,04 1.537 28 638,07 1401,9 28 0,99 0,978 0,995 144,1
CelNK % 8,3 8,3 28 9,7 8,1 28 0,98 0,616 0,995 0,7
CelNK/mm3 198,6 134,3 28 213,4 122,6 28 0,865 0,732 0,935 47
Relação CD4/CD8 2 1,5 72 1,8 1 72 0,74 0,603 0,832 0,6

CCI: coeficiente de correlação intraclasse; DP: desvio padrão; IC: intervalo de confiança.

As estratégias de gates utilizadas para identificar e quantificar a frequência dos linfócitos T, B e NK para o Aquios CL estão representadas nas Figuras 1 e 2; para o Cytomics FC500/software Kaluza, na Figura 3.

FIGURA 1 Estratégia de gate utilizada no Aquios CL com o Tetra Panel 1A população de linfócitos é selecionada por meio dos gates EV-Lin × Side Scatter (A) e SS-Lin × CD45 (B). Essa população é combinada em um gate denominado Lymphs All (C), e dentro da população CD3+, podemos identificar os linfócitos T CD4 e CD8 (D). 

FIGURA 2 Estratégia de gate utilizada no Aquios CL com o Tetra Panel 2A e D) a população de linfócitos é selecionada por meio do SS-Lin × CD45; B e E) essa população é combinada em um gate denominado Lymphs All; C) dentro da população CD3+, podemos identificar os linfócitos T CD4 e CD8; F) dentro da população CD3, podemos identificar os linfócitos NK CD56+/CD16+ e os linfócitos B CD19+. 

FIGURA 3 Estratégia de gate utilizada no citômetro FC500 e software de análise KaluzaA) seleção da população viável por meio de Side Scatter × Forward Scatter; B) Side Scatter × CD45 com gate na região de linfócitos totais; C, D e E) dentro do gate linfócitos, identificamos as populações de linfócitos T, B e NK; F, G e H) ainda dentro do gate linfócitos, identificamos a população de linfócitos T CD3 e as subpopulações CD4 e CD8. 

DISCUSSÃO

A melhoria no fluxo de trabalho da CF é uma necessidade real nos laboratórios clínicos que buscam melhorar a produtividade, a qualidade e a redução dos custos. O equipamento Aquios CL atende essa demanda, pois proporciona melhorias na padronização técnica; reduz os erros pré-analíticos; evita troca de amostras, uma vez que todas as pipetagens são automatizadas e os reagentes/as amostras são monitorados por códigos de barra; aperfeiçoa o treinamento de funcionários; elimina a subjetividade da análise; monitora o controle de qualidade; e reduz o tempo de liberação dos resultados. Além disso, por ser um sistema fechado, o equipamento fornece ao operador uma manipulação segura da amostra, evitando contaminação biológica.

Nossos resultados demonstram significância estatística ao comparar a quantificação das subpopulações linfocitárias entre Aquios CL e Cytomics FC500, o que corrobora dados já publicados. Gossez et al. (2011)(11) evidenciaram que o Aquios CL obteve boa correlação na quantificação de linfócitos T CD4 quando comparado com o FC500. Ademais, ele pode ser utilizado na rotina diagnóstica e também em testes de proficiência.

Grossi et al. (2018)(12) demonstraram boa correlação entre o Aquios CL em comparação com o bead-based assay do equipamento BD FACSCanto II. Esse estudo também demonstra uma importante diminuição do tempo de atendimento total (TAT) por se tratar de um equipamento automatizado.

Em um trabalho publicado recentemente por Degandt et al. (2018)(4), o desempenho do Aquios CL em relação à plataforma dupla Sysmex XE-5000 e BD FACSCanto II foi aceitável, entretanto, cerca de um terço das amostras necessitaram de ajuste manual no gate de linfócitos. Uma vantagem do software do Aquios CL é o sistema de flags, que sinaliza a necessidade de revisão de gate.

O sistema Load & Go flow cytometer do Aquios proporciona a preparação da amostra em conjunto com análise de fluorescência; gera resultados de frequência e números absolutos em um único equipamento (plataforma única); e tem a possiblidade de interface dos resultados com os sistemas informatizados dos laboratórios clínicos(10,11).

A avaliação do custo não fez parte do escopo do nosso estudo, mas sabidamente os reagentes dos Aquios CL são mais caros do que aqueles utilizados na CF convencional. Entretanto, se levarmos em consideração todos os benefícios técnicos já descritos para o Aquios, principalmente a redução significativa da mão de obra técnica devido à automação completa, é possível garantir que esse equipamento gere viabilidade econômica importante para laboratórios clínicos com grande volume de amostras.

A automação em CF acrescenta novas perspectivas para a técnica e proporciona melhoria na qualidade e na produtividade do processo, eliminando as chances de erro quase completamente.

Pela automação do processo de quantificação das células CD4, é possível não depender da formação e expertise de pessoal técnico, tornando o processo mais simplificado e independente de mão de obra especializada em sua realização, mas a interpretação e os níveis de revisão continuam sendo fundamentais no processo pós-analítico para o disparo do alerta na área clínica.

CONCLUSÃO

O equipamento Aquios CL apresentou excelente desempenho na quantificação de subpopulação linfocitária. Por se tratar de um equipamento com automação completa, promoveu padronização, qualidade e redução no tempo do procedimento técnico, tornando-se uma ferramenta adequada e viável em laboratórios clínicos com alto fluxo amostral.

REFERÊNCIAS

1 Sales MM, Vasconcelos DM. Citometria de fluxo. Aplicações no laboratório clínico e de pesquisa. São Paulo: Editora Atheneu; 2013. ISBN 978-85-388-0422-2.
2 Illoh OC. Current applications of flow cytometry in the diagnosis of primary immunodeficiency diseases. Arch Pathol Lab Med. 2004; 128: 23-31.
3 O’Gorman MRG. Role of flow cytometry in the diagnosis and monitoring of primary immunodeficiency disease. Clin Lab Med. 2007; 27: 591-626.
4 Degandt S, Peeters B, Jughmans S, Boeckx N, Bossuyt X. Analytical performance of an automated volumetric flow cytometer for quantitation of T, B and natural killer lymphocytes. Clin Chem Lab Med. 2018; 56(8): 1277-88.
5 Fleisher TA, Madkaikar M, Rosenzweig SD. Application of flow cytometry in the evaluation of primary immunodeficiencies. Indian J Pediatr. 2016; 83(5): 444-9.
6 Picard C, Al-Herz W, Bousfiha A, et al. Primary immunodeficiency diseases: an update on the classification from the International Union of Immunological Societies Expert Committee for Primary Immunodeficiency 2015. J Clin Immunol 2015; 35: 696-726.
7 Peeling RW, Sollis KA, Glover S, et al. CD4 enumeration technologies: a systematic review of test performance for determining eligibility for antiretroviral therapy. PLoS One. 2015; 10(3): e0115019.
8 Dieye TN, Vereecken C, Diallo AA, et al. Absolute CD4 T-cell counting in resource-poor settings: direct volumetric measurements versus beadbased clinical flow cytometry instruments. J Acquir Immune Defic Syndr. 2005; 39(1): 32-7.
9 WHO. Consolidated guidelines on the use of antiretroviral drugs for treating and preventing HIV infection: recommendations for a public health approach. 2 ed; 2016.
10 Mandy FF, Nicholson JK, McDougal JS; CDC. Guidelines for performing single-platform absolute CD4+ T-cell determinations with CD45 gating for persons infected with human immunodeficiency virus. Centers for Disease Control and Prevention. MMWR Recomm Rep. 2003; 52(RR-2): 1-13.
11 Gossez M, Malcus C, Demaret J, Frater J, Poitevin-Later F, Monneret G. Evaluation of a novel automated volumetric flow cytometer for absolute CD4+ T lymphocyte quantitation. Cytometry B Clin Cytom. 2017; 92(6): 456-64.
12 Grossi V, Infantino M, Meacci F, et al. Comparison of methods and TAT assessment: volumetric AQUIOS CL and bead-based FACS CANTO II cytometers. Cytometry B Clin Cytom. 2018; 94(4): 674-8.
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