Introdução

A cardiopatia congênita (CC) é uma malformação comum que afeta aproximadamente seis de 1.000 nascidos vivos. Ela ocorre isoladamente ou em anomalias congênitas múltiplas, dentre as quais a síndrome de deleção 22q11.2 é a mais comum.¹ A CC é a manifestação mais crítica e principal fator de morbimortalidade na síndrome de deleção 22q11.2 (22q11.2DS), afeta entre 74% e 80% dos pacientes. Dentre diversas CCs relatadas, os defeitos conotruncais e/ou do arco aórtico são os mais prevalentes.² A causa da heterogeneidade fenotípica cardíaca não é conhecida, porém não há provas de correlação com sexo, raça, tamanho da deleção 22q11.2 ou origem parental da deleção.³

Recomenda-se que todos os recém-nascidos ou crianças que apresentem CC e dismorfismo ou outras anomalias congênitas sejam examinadas para deleção 22q11.2.⁴ Além disso, desequilíbrios genômicos de outras regiões cromossômicas, inclusive 10p12-p15, 4q21-q35, 8p21-p23, 17p13 e 18q21, podem ser encontrados em pacientes com suspeita clínica de 22q11.2DS e sem deleção 22q11.2.⁵

Atualmente, a aplicação da análise cromossômica por microarray (CMA) no diagnóstico clínico possibilita a identificação de desequilíbrios genômicos submicroscópicos indetectáveis, traz novas informações sobre a gênese dos defeitos congênitos. Investigamos um grupo de indivíduos que apresentam CC com anomalias extracardíacas e exclusão da 22q11.2DS para identificar desequilíbrios genômicos patogênicos.

Pacientes e métodos

Métodos

As análises cromossômicas por microarray foram feitas em todos os 78 pacientes. Os pais dos pacientes não foram testados. Para cada amostra, 250 ng de DNA genômico foram marcados e hibridados no chip CytoScan HD (Affymetrix^®, EUA), de acordo com as recomendações do fabricante. Os parâmetros de controle de qualidade foram avaliados com o pacote de software de sistema de genotipagem Affymetrix^®. Os dados de array foram analisados com o software de análise cromossômica (ChAS Affymetrix^®). Foram aplicados filtros de 25 marcadores genéticos para deleção e 50 para duplicações, conforme recomendado pelo fabricante, e também foi aplicado um comprimento mínimo do segmento de 300 kb para duplicações e deleções (definido como amplas variações no número de cópias (CNVs). Essas CNVs foram confirmadas com o software Nexus Copy Number (BioDiscovery^®, EUA). As CNVs foram ainda comparadas com um conjunto de dados de CNVs para controle interno, inclusive 105 controles da população geral brasileira designada com o Cytoscan HD (Affymetrix^®). Apenas os desequilíbrios genômicos encontrados em todas as abordagens foram selecionados para investigação mais detalhada, com as seguintes bases de dados: Database of Genomic Variants (DGV),⁶Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans (DECIPHER)⁷ e Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM).⁸ As CNVs consideradas relevantes foram transferidas para confirmação por outra plataforma de microarray. Essa confirmação foi feita para 18 pacientes, com o microarray de genoma humano G3 SurePrint 8 × 60 K da Agilent (Agilent Technologies®, EUA). O DNA extraído dos pacientes e os controles de referência (Promega®, EUA) foram medidos para concentração e pureza com o espectrofotômetro Qubit^® (Life Technologies®, EUA). A quantidade de 500 ng de DNA do paciente e um DNA de referência com correspondência sexual foi processada para rotulagem e hibridização de acordo com o protocolo do fabricante (hibridização genômica comparativa (CGH) – array de oligonucleotídeos da Agilent para análise do DNA genômico – protocolo de rotulagem enzimática v7.3). Os slides foram digitalizados em um scanner dual-laser G4900DA (Agilent Technologies®, EUA) e as imagens foram extraídas e analisadas com o software de extração de recursos Agilent (v.11.5.1.1). Os dados de array foram analisados com o software de citogenética (v.3.0.1.1). Um fluxograma com a população de pacientes estudada encontra-se resumido na figura 1.

Figura 1 Fluxograma com a população de pacientes e técnicas aplicadas.FISH, fluorescence in situ hybridization; MLPA, multiplexligation probe amplification; CMA, chromosomal microarray; CNVs, copy number variations; ChAS, chromosome analysis suite; DGV,database of genomic variants; DECIPHER, database of chromosomal imbalance and phenotype in humans using ensemble resources;OMIM, Online Mendelian Inheritance In Man. 

Resultados

Foram detectadas 67 CNVs ≥ 300 kb, 33 deleções e 34 duplicações. As CNVs com menos de 100% de sobreposição de casos na DECIPHER e as CNVs com mais de quatro ocorrências na DGV (sobreposição de mais de 50%) não foram consideradas potencialmente relevantes.

Dentre as 67 CNVs ≥ 300 kb, 25 abrangem genes, 11 deleções e 14 duplicações; 18 CNVs foram confirmadas por outra plataforma de microarray e duas foram anteriormente detectadas pelas técnicas de FISH e/ou MLPA (tabela 1). As síndromes de anomalias congênitas múltiplas já foram relatadas na literatura e envolvem oito dessas CNVs: síndrome de deleção 16p11.2 OMIM 611913 (caso 8), síndrome de deleção 17q12 OMIM 614527 (caso 26), síndrome de deleção 5p OMIM 123450 (caso 29), síndrome de duplicação 3q (caso 40), síndrome de deleção 10q22-q23 OMIM 612242 (caso 71), síndrome de deleção 4q (caso 72), síndrome de deleção 8p23.1 (caso 77) e síndrome de deleção 22q13.33 OMIM 606232 (caso 78). Esses pacientes apresentaram características clínicas que sobrepuseram 22q11.2DS (tabela 2).

Portanto, as CNVs patogênicas foram detectadas em oito dos 78 pacientes (10%), com tamanhos de 611 Kb a 17,4 Mb. Os genes que reconhecidamente participam do desenvolvimento cardíaco e que são candidatos a CC são relatados na tabela 3. Além disso, foram identificadas duas CNVs potencialmente relevantes que abrangem genes cardíacos (duplicação de 993 kb em 15q21.1 e duplicação de 706 kb em 2p22.3).

Discussão

Elucidar a contribuição genética de doenças complexas é difícil devido ao grande número, à baixa frequência e ao efeito variável do local de predisposição. As CNVs genômicas foram estabelecidas como uma importante fonte de variação genética humana inerente a várias síndromes de anomalias congênitas múltiplas, inclusive a 22q11.2DS. Para determinar se a CNV contribui ou não para um fenótipo depende de diversos fatores, inclusive do modo de herança, do conteúdo genético, do número de cópias (perda ou ganho), da plataforma de array usada e se ela foi encontrada em grupos de controle da população geral.⁹ Em geral, CNVs mais amplas têm um maior potencial de patogenia, pois é mais possível o envolvimento de um gene sensível à dosagem e/ou que um maior número de genes esteja incluído no desequilíbrio, o que resulta em um fenótipo anormal.¹⁰

A classificação de uma variação no número de cópias CNV não relatada anteriormente, e que não inclui um gene de doença anteriormente conhecida, pode variar entre diferentes populações.¹⁰ Portanto, nossa análise das CNVs foi feita com foco no diagnóstico e de acordo com três abordagens analíticas, pois ainda não há uma base de dados de controle populacional brasileira disponível. Consideramos um tamanho mínimo de 300 kb (definido como CNVs amplas), o número recomendado de marcadores genéticos e apenas CNVs identificadas por todas as três abordagens selecionadas para pesquisa e confirmação.

CNVs patogênicas foram detectadas em oito dos 78 pacientes (10%) e os genes envolvidos, como IRX4, BMPR1A, SORBS2, ID2, ROCK2, E2F6, GATA4 e SOX7, são conhecidos por atuar no desenvolvimento cardíaco e seriam candidatos a CC.^11-18

O caso 8 mostrou uma deleção de 611 kb com sobreposição à região crítica da síndrome de deleção 16p11.2. Os pacientes com essa síndrome normalmente apresentam atraso no desenvolvimento, deficiência intelectual, características de transtornos do espectro autista, convulsões (epilepsia) e obesidade,¹⁹ não apresentados por nossos pacientes. Menos frequentemente, foram observados CC, dismorfismos faciais menores e atraso na fala,¹⁹ em concordância com nosso paciente. Nosso paciente apresentou ToF e arco aórtico interrompido. Essa região excluída não aloca genes candidatos a CC, até o momento.

O caso 26 mostrou uma deleção de 1,8 kb com sobreposição à região crítica da síndrome de deleção 17q12. As deleções dessa região, inclusive o gene HNF1β, foram encontradas em pacientes com diabete tipo MODY 5 (MODY5) e em pacientes com doença renal cística, dilatações renais, atrofia pancreática e anormalidades hepáticas,²⁰ não apresentadas por nosso paciente. Recentemente, deficiência intelectual, atraso na fala e dismorfismos faciais foram associados a deleção,²¹ compatível com nosso paciente, porém CC não foi mencionada. Nosso paciente apresentou VAB. Não houve relato de genes candidatos a CC até o momento.

O caso 29 apresentou deleção de 17,4 Mb em 5p15.1-p15.33, abrangeu a síndrome de deleção 5p (síndrome de Cri Du Chat). Os neonatos com essa condição normalmente apresentam grudo agudo que soa como o de um gato, microcefalia, baixo peso ao nascer e hipotonia,²² não relatados pelos pais dos pacientes (avaliado por um ano). Os indivíduos afetados também apresentam deficiência intelectual e atraso no desenvolvimento, características faciais distintivas, inclusive hipertelorismo, orelhas baixas, mandíbula pequena e CC,²² observados em nosso paciente. A baixa resolução do cariótipo anterior [46,XY] prejudicou o diagnóstico desse paciente, que foi aprimorado com hibridação genômica em arrays (aGH). Nosso paciente apresenta PCA. A região excluída aloca um gene com fator de transcrição cardíaco, o IRX4, nas quais as mutações estavam relacionadas a CC.¹¹

O caso 40 apresentou duplicação de 2 Mb em 3q26.2, não abrangeu a região crítica da síndrome de duplicação 3q (definida como 3q26.31-q27.3). Recentemente, casos com duplicações parciais 3q que envolvem a região de nossa CNV foram relatados e associados a essa síndrome.²³ O fenótipo normalmente envolve CC, anomalias cerebrais, microcefalia e dismorfismos faciais atípicos compatíveis com nosso paciente. Nosso paciente apresentou ToF, DAS, atresia pulmonar e persistência da veia cava superior esquerda. Não houve relato de genes candidatos a CC nessa região duplicada até o momento.

O caso 71 mostrou uma deleção de 7,8 Mb em 10q22.3-q23.2 e essa região foi recentemente associada a uma nova síndrome caracterizada por comprometimento comportamental e do desenvolvimento neurológico, inclusive atraso cognitivo, autismo, hiperatividade e doença psiquiátrica.²⁴ Nosso paciente apresentou apenas atraso no desenvolvimento. Além disso, dismorfismos faciais leves e CC foram observados de forma menos frequente na síndrome de deleção 10q22-q23,²⁵ ambos apresentados por nosso paciente. Nosso paciente apresentou ToF. Essa região excluída abrange o gene BMPR1A, sugere um gene candidato a CC devido a seu papel no desenvolvimento embrionário e na formação do coração.¹²

O caso 72 apresentou deleção de 4,5 Mb em 4q35.1-q35.2. As deleções em 4q são raras e associadas a deficiência intelectual, dismorfismos craniofaciais, orelhas baixas, fissura palatina, CC e anomalias do quinto dedo.²⁶ Nosso paciente apresentou a maior parte dessas características, exceto orelhas baixas e fissura palatina. Além disso, esse paciente mostrou uma duplicação de 14,8 Mb em 2p24.3-p25.3 e duplicação de 375 bK em 16p12.2, ambas CNVs sem um fenótipo específico descrito até o momento. Nosso paciente apresentou DSV, DAS, atresia pulmonar e transposição das grandes artérias. A região excluída 4q35.1-q35.2 aloca o gene SORBS2, que é altamente expresso em discos intercalares de tecidos normais do coração.¹³ A região duplicada de + 2p24.3-p25s abrange os genes ID2, ROCK2 e E2F6, que atuam no desenvolvimento do coração e são genes candidatos a CC.^14-16

O caso 77 mostrou uma deleção de 3,8 kb que abrangeu a região crítica da síndrome de deleção 8p23.1; a CC é a marca registrada dessa síndrome, principalmente defeitos do septo atrioventricular, defeito do septo atrial e estenose pulmonar,⁵ compatível com os achados de nosso paciente. Além disso, foi observado que microcefalia, dismorfismos faciais, atraso no desenvolvimento e problemas comportamentais estão associados a essa síndrome.⁵ Nosso paciente apresentou DSV, DAS, atresia pulmonar e persistência da veia cava superior esquerda. Essa região excluída abrange os genes GATA4 e SOX7, ambos fatores de transcrição que atuam na embriogênese cardíaca. Eles foram sugeridos como os genes candidatos a CC, com base em modelos animais, mutações relatadas por pacientes e estudos sobre CNVs.^17,18

O caso 78 apresentou uma deleção de 1,1 Mb que abrangeu a região crítica da síndrome de deleção 22q13.33 (síndrome de Phelan-McDermid), caracterizada por atraso no desenvolvimento, retardo ou ausência de fala e características autistas.²⁷ Nosso paciente apresenta atraso no desenvolvimento e na fala. Além disso, e de forma menos frequente, foram observados dismorfismos faciais, infecções recorrentes, CC e dificuldade na alimentação,²⁸ compatível com nosso paciente. Nosso paciente apresentou VAB, ectasia da aorta e seio de valsalva. Essa região excluída não aloca genes candidatos a CC até o momento.

Os estudos sobre CNVs em pacientes com fenótipos semelhantes de doenças bem conhecidas podem contribuir para um melhor conhecimento dos fenótipos e para a identificação dos genes e das vias envolvidas em CCs específicas e outras alterações.²⁹ As CNVs detectadas neste estudo anteriormente descritas em síndromes clinicamente reconhecíveis podem ajuda no manejo clínico e proporcionar aconselhamento genético adequado para esses pacientes e suas famílias. Esses achados também reforçam a importância da CMA para o diagnóstico. Além disso, duas CNVs detectadas aqui possivelmente estão relacionadas a CC.

O caso 35 apresentou duplicação em 15q21.1 (993 kb), inclusive sete genes, dois dos quais podem ser realçados. O gene SEMA6D atua na morfogênese do coração;³⁰ e o gene FBN1 atua no desenvolvimento do coração e as mutações nesse gene são associadas a CC.³¹ Essa CNV é descrita em quatro indivíduos na DECIPHER (286150, 250179, 260222, 278520), que apresentam somente essa variação; contudo, nenhum deles apresentou CC. Essa CNV não foi detectada na DGV. Nosso paciente apresentou ToF, atresia pulmonar e persistência da veia cava superior esquerda.

O caso 52 apresentou duplicação em 2p22.3 (706 kb), inclusive sete genes como LTPB1, que é o maior regulador do gene TGFB1 e atua no desenvolvimento da válvula do coração.³² Essa CNV foi encontrada em dois indivíduos na DECIPHER (249550, 249780), que apresentaram apenas essa variação; contudo, sem CC. Essa CNV foi descrita em quatro estudos na DGV (Variação_8367, Variação_53694, Variação_5203, Variação_5202). Nosso paciente apresentou ToF, atresia pulmonar e DAS.

CNVs clinicamente significativas foram identificadas em 10% dos casos. Isso reforça que a CMA é uma tecnologia confiável para pacientes que apresentam CC com anomalias extracardíacas e exclusão de 22q11.2DS. Há uma sobreposição entre as manifestações clínicas de várias síndromes listadas aqui, apesar de abranger características distintas. O mesmo aplica-se ao fenótipo de nossos indivíduos. Isso reforça os mecanismos complexos envolvidos na embriogênese humana, que implica a correta interação entre os genes. Como vários mecanismos de interação entre os genes não foram completamente elucidados, nosso estudo enfatiza a possível atuação das CNVs na CC.