INTRODUÇÃO

Diabetes mellitus (DM) e hipertensão são as principais causas de doença renal crônica (DRC) e progressão para doença renal terminal¹. A incidência de DRC se eleva com a idade nos países desenvolvidos e em desenvolvimento^2,3. Portanto, novas estratégias para prevenir o desenvolvimento da DRC se fazem necessárias.

Ratos submetidos a injeção única de estreptozotocina em baixa dose são um modelo de DM tipo 2 comumente utilizado em pesquisas⁴. Ratos espontaneamente hipertensos (REH) são um modelo animal frequentemente adotado nos estudos sobre hipertensão essencial (ou primária) geneticamente transmitida⁵. A indução do diabetes em REH⁶ acelera o desenvolvimento da nefropatia diabética e da doença renal crônica (DRC).

Nefropatia diabética (ND) é um forte fator de risco para doenças vasculares comumente presente em pacientes com DM tipo 2. A ND é caracterizada por lesão podocitária, proteinúria, fibrose glomerular e diminuição da filtração glomerular⁷. As manifestações da ND incluem hiperglicemia, inflamação, produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e ativação da endotelina-1 (ET-1) e do sistema renina-angiotensina (SRA)⁸.

Quando não tratada, a nefropatia diabética é a principal causa de doença renal terminal⁹. A DRC é caracterizada por elevações dos marcadores de lesão renal (albumina urinária > 30 mg/24h ou relação albumina/creatinina superior a 30 mg/g), dano tubular, disfunção da excreção iônica, achados histológicos anormais em amostras de biópsia renal e queda da taxa de filtração glomerular (< 60 mL/min/1,73 m²), entre outros¹⁰.

As ERO estão envolvidas na fisiopatologia da DRC, enquanto as NADPH-oxidases são as principais fontes de ERO em muitos tecidos^11-13.

A ET-1 modula o fluxo sanguíneo renal por meio da regulação do tônus vascular¹⁴. A ET-1 é produzida pelas células endoteliais, mas em condições fisiopatológicas pode ser produzida por podócitos e células epiteliais mesangiais e parietais¹⁵. A ET-1 exerce sua função nas células alvo por meio de dois receptores, o ETA e o ETB¹⁵.

A ativação do receptor ETA media a vasoconstrição, proliferação de células vasculares e proteinúria¹⁶. Por outro lado, a ativação do receptor ETB libera substâncias vasodilatadoras tais como o óxido nítrico e a prostaciclina, produzindo primeiramente vasodilatação e, a seguir, vasoconstrição, estimulando a reabsorção de sódio nos dutos coletores e o estabelecimento da proteinúria¹⁷. Os níveis circulantes de ET-1 encontram-se aumentados em pacientes hipertensos¹⁸.

A ET-1 e o SRA interagem nos tecidos renais. A angiotensina II eleva a produção de ET-1 e regula para cima a expressão do receptor ETA nos rins^19,20. Juntos, os dois peptídeos podem produzir vasoconstrição pré e pós-glomerular, contração de células mesangiais, queda da taxa de filtração glomerular, estimulação da produção de matriz extracelular e aumento da reabsorção tubular de sódio²¹. É razoável propor que o bloqueio dos receptores da ET-1 possa ser benéfico na nefropatia diabética.

Ensaios clínicos estudaram os efeitos do antagonista da ET-1 atrasentan sobre a ND²². Atualmente, contudo, o principal uso terapêutico dos antagonistas dos receptores da ET-1 reside no tratamento da fibrose pulmonar idiopática e da hipertensão arterial pulmonar^23,24. O presente estudo é o primeiro a avaliar os efeitos do macitentan, um novo antagonista não-seletivo dos receptores da ET-1 receitado no tratamento da hipertensão pulmonar, sobre a progressão da lesão renal observada em ratos hipertensos e hiperglicêmicos.

MÉTODOS

RESULTADOS

A Tabela 1 exibe o peso corporal médio (g) dos grupos durante o experimento. O peso médio dos animais nos grupos HT-DIAB e HT-DIAB+MAC25 foi significativamente menor do que o dos ratos no grupo CTL aos 30 dias.

Não houve diferença na PAS dos grupos HT-DIAB e HT-DIAB+MAC25 em relação ao grupo HT-CTL dentro de seus respectivos períodos experimentais. Houve aumento da glicemia em todos os grupos experimentais após 30 e 60 dias de estudo em relação aos níveis observados no grupo HT-CTL.

Todos os grupos experimentais exibiram aumento na diurese com 30 e 60 dias de estudo em relação ao grupo HT-CTL.

O grupo HT-DIAB apresentou aumento significativo da creatinina e ureia plasmáticas em relação ao grupo HT-CTL aos 60 dias de estudo. Notadamente, a creatinina e a ureia plasmáticas dos ratos do grupo HT-DIAB+MAC25 aos 30 e 60 dias de estudo não foram estatisticamente diferentes dos valores vistos no grupo HT-CTL.

A função tubular renal foi avaliada através da excreção de sódio. Em todos os grupos experimentais observamos aumento na excreção de sódio aos 30 e 60 dias em comparação aos valores observados no grupo HT-CTL. Não houve diferença estatística na excreção de sódio entre os ratos diabéticos tratados ou não com macitentan.

Observamos um aumento significativo na excreção urinária de proteínas no grupo HT-DIAB em comparação ao grupo HT-CTL em todos os períodos experimentais. O grupo HT-DIAB+MAC25 também apresentou elevação na proteinúria aos 30 e 60 dias em relação ao grupo HT-CTL. Contudo, os ratos diabéticos tratados com macitentan exibiram diminuição significativa da proteinúria em comparação ao grupo HT-DIAB aos 60 dias de estudo, sugerindo melhora na função da barreira de filtração renal.

A imunocoloração para ET-1 e NGAL aos 60 dias é exibida na Figura 1. Observamos aumento na marcação de ET-1 e NGAL no grupo HT-DIAB em relação ao grupo HT-CTL e diminuição quando comparamos os grupos HT-DIAB+MAC25 e HT-DIAB. O macitentan atenuou a elevação da ET-1 e da NGAL (marcador de lesão renal), corroborando a hipótese de efeito renal benéfico.

Figura 1 Microscopia óptica de cortes renais imunocorados. A: Lipocalina associada à gelatinase neutrofílica (NGAL 200×), endotelina-1 (ET-1, 200×) e catalase (200×) em ratos geneticamente hipertensos nos grupos controle (HT-CTL), hipertensos e hiperglicêmicos (HT-DIAB) e hipertensos e hiperglicêmicos tratados com macitentan (HT-DIAB+MAC25) após 60 dias de estudo (último dia do experimento). B: Análises quantitativas de cortes renais corados para NGAL, ET-1 e catalase. Os dados são reportados em valores percentuais. O nível de significância para a hipótese nula foi estabelecido em 5%. ^** p < 0,05 comparado ao grupo HT-CTL aos 60 dias e ^¥¥ p < 0,05 comparado ao grupo HT-DIAB aos 60 dias (ANOVA seguida de teste post-hoc de Tukey). N = 10 por grupo. 

A Figura 1 exibe a marcação para catalase aos 60 dias. Observamos que no grupo HT-DIAB não houve estimulação da expressão dessa enzima antioxidante. Contudo, o grupo HT-DIAB+MAC25 exibiu aumento da catalase em relação aos grupos HT-CTL e HT-DIAB, sugerindo a presença de potencial antioxidante para o macitentan.

A Figura 2 analisa o SRA por meio da expressão proteica e suas respectivas quantificações gráficas. Foi observado aumento na produção de angiotensina II no grupo HT-DIAB. O grupo HT-DIAB+MAC25, em que foi notada redução da produção de ET-1, demonstrou aumento nas expressões de renina e angiotensina II.

Figura 2 Análise de renina, angiotensina I (ANG I) e angiotensina II (ANG II). A: Imagem de Western blot do córtex renal de ratos geneticamente hipertensos (REH) nos grupos controle (HT-CTL), hipertensos e hiperglicêmicos (HT-DIAB) e hipertensos e hiperglicêmicos tratados com macitentan (HT-DIAB+MAC25) aos 60 dias (último dia do experimento). B, C e D: análises quantitativas de imagens do immunoblot obtidas pelo software ImageJ. Os dados são relatados como médias ± DP. O nível de significância para a hipótese nula foi estabelecido em 5%. ^** p < 0,05 comparado ao grupo HT-CTL aos 60 dias e ^¥¥ p < 0,05 comparado ao grupo HT-DIAB aos 60 dias (ANOVA seguida de teste post-hoc de Tukey). N = 10 por grupo. 

A Figura 3A exibe os níveis urinários de peroxidação lipídica (TBARS). Houve aumento na peroxidação lipídica no grupo HT-DIAB aos 30 dias em relação ao grupo HT-CTL. Por outro lado, no grupo HT-DIAB+MAC25 a peroxidação lipídica não foi estatisticamente diferente quando comparada ao grupo HT-CTL em todos os períodos experimentais.

Figura 3 Análise da formação de espécies reativas de oxigênio e espécies reativas de nitrogênio. A: Análises quantitativas de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). B: O hidroperóxido urinário foi determinado pelo método da oxidação do ferro pelo laranja de xilenol versão 2 (FOX-2). C: Óxido nítrico (NO) em ratos geneticamente hipertensos nos grupos controle (HT-CTL), hipertensos e hiperglicêmicos (HT-DIAB) e hipertensos tratados com macitentan (HT-DIAB+MAC25) no início e aos 30 e 60 dias de estudo. Os dados são relatados como médias ± DP. O nível de significância para a hipótese nula foi estabelecido em 5%. ^* p < 0,05 comparado ao grupo HT-CTL aos 30 dias; ^¥ p < 0,05 comparado ao grupo HT-DIAB aos 30 dias, ^** p < 0,05 comparado ao grupo HT-CTL aos 60 dias e ^¥¥ p < 0,05 comparado ao grupo HT-DIAB aos 60 dias (ANOVA seguida de teste post-hoc de Tukey). N = 10 por grupo. 

Houve aumento nos hidroperóxidos urinários (Figura 3B) avaliados por FOX-2 no grupo HT-DIAB aos 30 e 60 dias, mas no grupo HT-DIAB+MAC25 tal elevação foi observada apenas aos 30 dias. Além disso, aos 60 dias o grupo HT-DIAB+MAC25 exibiu níveis menores do que o grupo controle. Tal resultado sugere, novamente, o potencial efeito antioxidante do macitentan.

A Figura 3C analisa os níveis urinários de NO. Apesar da tendência indicativa de aumento, os níveis urinários de NO identificados no grupo HT-DIAB não foram estatisticamente diferentes dos níveis encontrados no grupo HT-CTL aos 30 e 60 dias. Contudo, o grupo tratado com macitentan apresentou aumento significativo da concentração urinária de NO em relação ao grupo HT-CTL aos 30 e 60 dias. Uma vez que a lesão renal determinada pela NGAL (Figura 1) diminuiu no grupo tratado com 25 mg/kg de macitentan, o NO produzido pelo rim pode contribuir para a melhoria da insuficiência renal.

DISCUSSÃO

Nosso modelo experimental utilizou ratos espontaneamente hipertensos com hiperglicemia induzida por estreptozotocina. Esse modelo foi escolhido porque a coexistência de DM e hipertensão arterial sistêmica (HAS) eleva o risco para insuficiência renal crônica. Nosso modelo experimental possui características muito semelhantes à nefropatia diabética em humanos.

Observamos sinais de diabetes, incluindo glicemia elevada, poliúria (devido à diurese osmótica induzida pela hiperglicemia) e diminuição do peso corporal. Juntamente com a elevação da pressão arterial sistólica, esses parâmetros levam a perda progressiva da função renal. Identificamos proteinúria, aumento da excreção de sódio e aumento de creatinina e ureia nos ratos hipertensos e hiperglicêmicos.

A NGAL é um biomarcador diagnóstico e prognóstico confiável para insuficiência renal aguda (IRA), pois seus níveis se elevam 2h após a lesão renal. Além disso, estudos demonstraram que os níveis de NGAL nos grupos com IRA e DRC estável são superiores aos dos grupos controle^34-36, o que corrobora nossos resultados, uma vez que houve aumento da NGAL nos ratos hipertensos e hiperglicêmicos aos 60 dias.

Estudos recentes demonstraram o papel da ET-1 na fase inicial da ND. Mais especificamente, a expressão dos receptores da ET-1 pode ser estimulada pela hiperglicemia³⁷. Os rins são um local essencial em sua produção. A ET-1 causa aumento da resistência vascular renal, redução do fluxo sanguíneo renal e da taxa de filtração glomerular, além de inibição da reabsorção de sais e água³⁷.

Ao mesmo tempo, o SRA também tem papel ativo na gênese e progressão da ND. Evidências indicam a existência de uma interação entre a ET-1 e outras substâncias vasoativas, como a angiotensina II³⁸.

Nossos resultados demonstram que os rins de ratos hipertensos e hiperglicêmicos apresentaram estimulação por angiotensina II e ET-1, confirmando a participação dos respectivos mediadores de inflamação e disfunção endotelial.

O estresse oxidativo e nitrosativo desempenha um papel importante na progressão do diabetes^39,40. Os ratos hipertensos e hiperglicêmicos de nosso estudo exibiram aumento nos níveis de peroxidação lipídica renal, peróxidos urinários e NO.

Uma vez que a ET-1 desempenha um importante papel na progressão do diabetes, o presente estudo teve como objetivo testar as possíveis contribuições do macitentan, um antagonista não-seletivo dos receptores ETA e ETB aprovado pelo FDA em 2014. Contudo, outros antagonistas seletivos da ET-1 têm sido utilizados na prevenção da nefropatia diabética, mesmo em ensaios clínicos²². O macitentan foi estudado na lesão renal induzida por hiperglicemia em modelos de ratos com diabetes tipo 2⁴¹, mas dado que hipertensão e diabetes são fatores de risco de peso para doença renal crônica, nosso estudo avaliou o efeito do antagonista da ET-1 sobre a função renal de ratos concomitantemente hipertensos e diabéticos.

A dose de macitentan utilizada em nosso estudo é compatível com os regimes adotados em outros estudos^41,42. Inicialmente, observamos que os ratos hipertensos e hiperglicêmicos tratados com 25 mg/kg de macitentan não exibiram elevação significativa da concentração de creatinina e ureia plasmáticas e tampouco aumento na excreção de proteínas. Tais resultados, juntamente com a diminuição da expressão de NGAL, sugerem melhora da função renal.

A ET-1 promove a natriurese agindo nas células dos dutos coletores via receptores ETB⁴³. No entanto, não observamos diminuição significativa da excreção de sódio nos ratos hipertensos e hiperglicêmicos tratados com macitentan. Uma possível explicação é a seletividade aproximadamente 50 vezes maior do macitentan para o receptor ETA⁴², o que faria com que os efeitos da ET-1 mediados pelo receptor ETB, como a natriurese, fossem pelo menos em parte preservados.

Para confirmar o efeito do macitentan sobre os rins, analisamos a marcação para ET-1 e confirmamos que houve diminuição da marcação no tecido renal dos ratos hipertensos e hiperglicêmicos tratados com macitentan. Este resultado demonstrou que o bloqueio dos receptores da ET-1 reduziu a produção do agente vasoconstritor.

A ET-1 reduz a taxa de filtração glomerular ao promover a contração das arteríolas aferentes e eferentes. Portanto, o bloqueio da ET-1 pode parcialmente explicar a melhora da função renal. Contudo, em nossas condições experimentais observamos que o bloqueio dos receptores da ET-1 elevou a produção de angiotensina II no tecido renal, o que poderia neutralizar o bloqueio dos receptores da ET-1 por meio da ação sobre seu receptor AT1, promovendo vasoconstrição arteriolar.

Outra hipótese é que o NO pode atuar como um antagonista funcional da angiotensina II, inibindo a vasoconstrição nas arteríolas glomerulares^44,45. A administração de macitentan em ratos hipertensos e hiperglicêmicos aumentou ainda mais a excreção urinária de NO (165%). Esse aumento na produção de NO pode explicar, pelo menos parcialmente, o aprimoramento da função renal indicado pela melhora do fluxo sanguíneo renal por meio do efeito vasodilatador do NO. Estudos em rins de coelhos demonstraram que a ET-1 estimula a produção de NO através da ativação dos receptores ETB⁴⁶. Dado que o macitentan é mais seletivo para o receptor ETA, o aumento na diurese e na excreção pode se dever à ação do receptor ETB^42,43.

Curiosamente, o macitentan estimulou a expressão da catalase, uma importante enzima antioxidante. O aumento da peroxidação lipídica e dos hidroperóxidos urinários foi evitado pelo tratamento com MAC, sugerindo que o hidroperóxido foi degradado pela enzima catalase em água e oxigênio⁴⁷.

CONCLUSÃO

Observamos que o macitentan (25 mg/kg) inibiu a progressão da lesão renal induzida por hiperglicemia e hipertensão em ratos, possivelmente por potencializar as defesas antioxidantes e evitar o aumento do estresse oxidativo. Uma limitação do nosso trabalho é a falta de marcadores mais específicos de função renal. Contudo, os marcadores utilizados no presente estudo são os mesmos atualmente utilizados na prática clínica. Em conclusão, o bloqueio dos receptores da ET-1 com macitentan pode ser uma alternativa viável na prevenção da ND em ratos hiperglicêmicos e hipertensos. A intervenção com o macitentan deve ser confirmada em ensaios clínicos com humanos.