Efeito da imunoterapia sublingual sobre a atividade plaquetária em crianças com rinite alérgica

Efeito da imunoterapia sublingual sobre a atividade plaquetária em crianças com rinite alérgica

Autores:

Yanqiu Chen,
Lifeng Zhou,
Yan Yang

ARTIGO ORIGINAL

Brazilian Journal of Otorhinolaryngology

versão impressa ISSN 1808-8694versão On-line ISSN 1808-8686

Braz. j. otorhinolaryngol. vol.83 no.2 São Paulo mar./abr. 2017

http://dx.doi.org/10.1016/j.bjorl.2016.03.006

Introdução

A imunoterapia sublingual (ITSL) é o único tratamento que regula o processo imunológico durante o desenvolvimento da rinite alérgica (RA), e não simplesmente trata os sintomas.1,2 No entanto, os mecanismos subjacentes do processo e os biomarcadores potenciais ainda não estão completamente caracterizados.

A ativação plaquetária ocorre durante as reações das vias aéreas induzidas pelo antígeno em indivíduos alérgicos e asmáticos. Níveis elevados de mediadores derivados das plaquetas, tais como as quimiocinas, beta-tromboglobulina (BTG) e fator 4 plaquetário (F4P), são observados no plasma e no líquido de lavagem broncoalveolar de indivíduos atópicos. Esses mediadores têm a capacidade de ativar os eosinófilos, aumentar a expressão dos receptores de Fc-IgG e Fc-IgE, estimular basófilos para liberar histamina e assim por diante.3-6 Como a ITSL pode inibir significativamente a inflamação alérgica, supomos que a ITSL seja capaz afetar a ativação de plaquetas em crianças com RA.

No presente estudo, buscamos esclarecer o efeito de ITLS na ativação plaquetária de crianças com RA por meio da detecção de mudanças de F4P sérico e concentração de BTG.

Método

Pacientes

Foram recrutadas 42 crianças, entre 6 e 12 anos, com história clínica de RA induzida por ácaros da poeira domiciliar (APD) por pelo menos um ano. O teste cutâneo de hipersensibilidade imediata (TCHI) foi feito para examinar crianças alérgicas a APD. Aquelas com doenças crônicas (p.ex., asma, desnutrição, malformações anatômicas do sistema respiratório, doença pulmonar crônica, doença cardíaca, doença de refluxo gastresofágico, fibrose cística) e aquelas com um histórico de uso crônico de fármacos (p.ex., corticosteroides orais ou nasais, antiepilépticos, imunossupressores) foram excluídas. O estudo foi feito com a aprovação do comitê de ética local e com o consentimento informado por escrito dos pais.

Imunoterapia sublingual e agrupamento

O extrato de alérgeno do APD para ITSL foi fabricado por Wolwopharma Biotecnologia Company (Zhejiang, China) e usado sob a forma de gotas (nº 1, 1 mg/mL; nº 2, 10 mg/mL; nº 3, 100 mg/mL e nº 4, 333 mg/mL). De acordo com as instruções do fabricante, os pacientes foram orientados a tomar doses crescentes (de nº 1 a nº 3) durante as três primeiras semanas da fase de dosagem crescente e depois foram instruídos a tomar 3 gotas de solução nº 4 uma vez por dia, durante a fase de manutenção. Havia instruções para que as gotas fossem mantidas sob a língua por 2 a 3 minutos, antes de ser engolidas. As crianças no grupo do placebo receberam diluentes com 50% glicerol e 50% tampão de solução salina. Todas as crianças foram agrupadas como ITLS (21 crianças) e grupo placebo (21 crianças) aleatoriamente. Os fármacos foram rotulados com números de código dos pacientes, que foram designados pelo pesquisador de maneira randomizada sequencial, com um número de código de estudo. Os frascos individuais do fármaco tiveram a identidade mascarada, para que os pacientes e os pesquisadores não tivessem conhecimento do tratamento atribuído. O mascaramento do estudo foi preservado até que todos os indivíduos completassem o estudo. A adesão ao uso dos medicamentos foi avaliada tanto pelo questionário para os pais como por medição de peso de fármaco administrado a cada duas semanas.

Escores de sintomas

Os sintomas nasais (nariz escorrendo, espirros, nariz entupido, coceira no nariz) foram marcados pelas crianças com a ajuda dos pais. Um escore de 0 foi definido como nenhum sintoma, um escore de 1 foi definido como sintomas leves (que não interferem em qualquer atividade), um escore de 2 foi definido como sintomas moderados (ligeiramente incômodos que pouco interferem na atividade/sono noturno) e um escore de 3 foi definido como sintomas graves (incômodos que interferem na atividade/sono noturno).7,8 Os escores foram registrados a cada manhã, diariamente, por pelo menos 12 semanas e, em seguida, fez-se a média.

Preparação e análise de amostras de sangue

As amostras de sangue de crianças foram coletadas entre 11 e 14 h pelo método de venopunção em condições apropriadas. O soro foi separado após a coagulação do sangue durante 1-2 horas à temperatura ambiente e centrifugado a 3.000 g durante 15 minutos a 4 ºC. As amostras de soro foram armazenadas a -80 ºC e usadas para o ensaio imunoenzimático (Elisa). A concentração total de proteínas foi determinada com ensaios de proteína Bio-Rad, de acordo com Bradford. Os kits de Elisa (Diagnostica Stago, França) foram usados para medir o F4P sérico e as concentrações de BTG.

Análise estatística

Todos os dados foram expressos como média ± DP. As significâncias estatísticas entre os diferentes grupos foram determinadas por meio do teste U não paramétrico de Mann-Whitney. O teste de correlação de Spearman foi usado para analisar a correlação entre o escore de sintomas e a concentração de F4P ou BTG; p < 0,05 foi considerado como diferença significativa.

Resultados

Características demográficas da população do estudo e evolução clínica

Este estudo foi feito com 42 crianças, 21 incluídas no grupo ITSL, entre 72 e 144 meses (idade média: 120,7 ± 44,0 meses, dez do sexo masculino) e 21 incluídas no grupo de placebo, entre 75 e 141 meses (idade média: 123,0 ± 42,3 meses, 11 homens). Idade, sexo, duração da doença e escores de sintomas de base entre dois grupos foram comparáveis, sem significância. O tratamento de ITLS foi eficaz e os escores de sintomas diminuíram significativamente em comparação com os escores do grupo placebo e de sintomas do momento basal (tabela 1).

Tabela 1 Característica demográfica de 42 crianças com RA 

Grupo ITLS Grupo placebo
Número 21 21
Sexo (Masculino/Feminino) 10/11 11/10
Idade (meses) 120,7 ± 44,0 123,0 ± 42,3
Duração da doença (ano) 5,2 ± 2,4 6,1 ± 3,7
IgE Total (kU/L) 465 ± 226 513 ± 316
IgE específico de APD (kU/L) 45 ± 21 35 ± 18
Sintomas basais
Nariz escorrendo 2,5 ± 0,3 2,1 ± 0,2
Espirros 1,9 ± 0,1 1,7 ± 0,1
Nariz entupido 2,1 ± 0,2 1,8 ± 0,3
Prurido no nariz 1,5 ± 0,1 2,0 ± 0,4
Escore total 8,2 ± 0,6 7,9 ± 0,5
Sintomas de ponto final
Nariz escorrendo 1,5 ± 0,2a,b 2,2 ± 0,3
Espirros 1,4 ± 0,3a,b 1,5 ± 0,1
Nariz entupido 1,2 ± 0,1a,b 1,8 ± 0,1
Prurido no nariz 1,1 ± 0,2a,b 2,1 ± 0,2
Escore total 5,2 ± 0,3a,b 7,8 ± 0,2

aComparado com grupo placebo, p < 0,05.

bComparado com sintoma do momento basal, p < 0,05.

Diminuição dos níveis de proteína de F4P e BTG séricos durante o tratamento de ITLS

O F4P sérico e a expressão da proteína BTG durante o tratamento de ITLS foram significativamente menores do que aqueles no grupo placebo após seis meses de tratamento (F4P 3,2 ± 1,1 vs. 4,9 ± 1,2 UI/mL; BTG 17,4 ± 4,3 vs. 23,2 ± 5,1 UI/mL) e essa tendência mantida por pelo menos um ano (F4P 1,3 ± 0,5 vs. 5,3 ± 1,7 UI/mL; BTG 10,5 ± 3,2 vs. 21,6 ± 4,8 UI/mL) (fig. 1 A e B).

Figura 1 Expressão de F4P sérico e da proteína BTG reduzida após ITLS após seis meses em comparação com o grupo controle e nível basal com significância. A diminuição foi mantida pelo menos um ano sem rebote (* p < 0,05, comparação entre os dois grupos e o momento basal; ●, representa grupo placebo; ■ representa grupo ITLS). 

Relação entre os escores dos sintomas e F4P sérica e níveis de proteína BTG

Para explorar o efeito da ativação plaquetária no escore de sintomas, analisamos a relação entre os escores dos sintomas e F4P sérico e níveis de proteína BTG no grupo de ITLS. Após um ano de tratamento, a melhoria dos escores de sintomas foi positivamente relacionada com a redução do F4P sérico e dos níveis de proteína BTG (p = 0,65; p = 0,001; p = 0,51; p = 0,002) (fig. 2).

Figura 2 Relação positiva entre melhoria dos escores dos sintomas e redução de níveis séricos de F4P de proteínas de BTG após um ano de ITLS grupo de tratamento ativo (A e B). 

Discussão

As plaquetas podem desempenhar um papel importante no processo inflamatório alérgico, porque são fonte rica de materiais biologicamente ativos, capazes de induzir ou aumentar as respostas inflamatórias alérgicas.9-12,3 Foi demonstrado que esses materiais estão armazenados em grânulos alfa e que são quimiocinas, tais como F4P e BTG. No entanto, o papel de ativação de plaquetas em ITSL não era claro, especialmente em crianças.

Nossos resultados mostraram que F4P e nível BTG diminuíram significativamente após seis meses de ITLS e a melhoria foi mantida por pelo menos um ano. Apesar de a redução do nível de F4P e BTG ter sido observada após três meses de tratamento, nenhuma diferença estatística foi encontrada. Além disso, os escores de melhoria dos sintomas após um ano de ITLS foram positivamente relacionados com a diminuição do nível de F4P e BTG. Esses resultados sugeriram que a ITLS possa modificar processos alérgicos por inibição da função das plaquetas, pelo menos parcialmente.

Compatível com nossos resultados, Kowal13 observou um aumento da ativação plaquetária intravascular em pacientes com asma alérgicos a APD e submetidos a provocação alergênica brônquica. A relação entre as mudanças de marcadores de ativação de plaquetas e o desenvolvimento de resposta asmática tardia sugere que a ativação de plaquetas dentro da circulação é crucial para o desenvolvimento da inflamação alérgica crônica. Além disso, Knauer14 demonstrou mudanças significativas no nível de F4P de pacientes com asma induzida pelo pólen após provocação brônquica ao extrato de ervas.

No estudo de Alicja,15 verificou-se que o nível plasmático de F4P no paciente fora da estação de pólen foi significativamente menor em comparação com a estação e não diferiu de maneira significativa em comparação com indivíduos saudáveis. Por outro lado, em seus outros dois estudos,16,17 os resultados sugeriram que os níveis de F4P e BTG não foram significativamente diferentes entre os pacientes e indivíduos saudáveis após imunoterapia. Notavelmente, a imunoterapia em seus dois estudos dura apenas seis meses e uma amostra de sangue foi coletada imediatamente após a injeção de dose máxima. No nosso estudo, o tratamento com ITSL durou pelo menos um ano e o soro foi amostrado em pontos de tempo diferentes. Observamos que a diminuição de F4P sérica e o nível de BTG duraram pelo menos um ano. A diferença entre o nosso estudo e o de Alicja sugere a importância do período de manutenção em imunoterapia. No entanto, o pequeno número de pacientes é uma das limitações do nosso estudo. São necessários estudos futuros com grande amostra para esclarecer o papel do F4P e da BTG na ITLS. Além disso, a mudança de F4P e BTG no lavado nasal antes e depois de ITLS deve ser discutida futuramente, para explorar o efeito local da ativação plaquetária no mecanismo da RA e ITLS.

Conclusão

Nosso estudo foi o primeiro a mostrar as mudanças na atividade plaquetária in vivo em crianças com RA durante ITLS. Os nossos resultados podem indicar que a inibição da ativação de plaquetas dentro da circulação sistêmica é um mecanismo importante durante ITLS. A ITLS pode melhorar sintomas e inibir parcialmente a ativação plaquetária.

Padrões éticos

Os autores afirmam que todos os procedimentos que contribuíram para este trabalho estão em conformidade com os padrões éticos das diretrizes nacionais e institucionais relevantes sobre experimentação humana e com a Declaração de Helsinque de 1975, revisada em 2008.

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