Introdução

A lesão de isquemia-reperfusão é um dos tipos mais comuns de lesão celular que ocorre em uma variedade de práticas cirúrgicas. A reperfusão de órgãos isquêmicos pode resultar em lesão tecidual, que se manifesta como disfunção celular microvascular e parenquimatosa. Os mecanismos subjacentes à lesão de isquemia-reperfusão já foram descritos; apontou-se que leucócitos polimorfonucleares e metabólitos reativos de oxigênio desempenham um papel fundamental na etiologia.^{( 1 - 3 )}

A isquemia-reperfusão de músculo esquelético resultante de trauma, revascularização de membros, cirurgia ortopédica, reconstrução com retalho livre ou qualquer outra etiologia não só conduz a lesão muscular propriamente dita, mas também provoca lesões com grave destruição de órgãos remotos. Consideráveis avanços têm sido feitos na compreensão dos mecanismos dessa resposta sistêmica no tocante à sequência da isquemia-reperfusão de músculo esquelético. Órgãos remotos com sistemas microcapilares intensos, tais como os pulmões, são propensos a apresentar esse tipo de lesão sistêmica.^{( 3 , 4 )}

Vários investigadores têm demonstrado que a via opioide está envolvida na preservação dos tecidos durante a hipóxia ou isquemia, e essa proteção é mediada pelo receptor opioide delta.^{( 5 , 6 )} O cloridrato de tramadol é um analgésico eficaz usado para condições graves de dor aguda e crônica. Há uma afinidade fraca entre o cloridrato de tramadol e o receptor opioide Î1/4, e aquele inibe a recaptação de monoaminas no sistema nervoso central, ativando assim os sistemas inibitórios descendentes.^{( 7 , 8 )} Um estudo recente revelou que o tramadol diminui a peroxidação lipídica e regula a captação de noradrenalina, e, por conseguinte, essas propriedades terapêuticas são usadas para o manejo da isquemia miocárdica.^{( 9 )}

O objetivo do presente estudo foi investigar o potencial efeito protetor do cloridrato de tramadol na lesão de isquemia-reperfusão pulmonar, induzida pelo modelo do membro posterior, por meio de avaliação histopatológica e determinação das respostas inflamatórias por via da atividade de mieloperoxidase (MPO) e dos níveis de óxido nítrico (NO) no tecido pulmonar de ratos.

Métodos

Todos os animais usados na presente pesquisa foram tratados de maneira apropriada, em conformidade com as normas do Laboratório de Experimentação Animal da Faculdade de Ciências Veterinárias Especializadas da Universidade Azad Islâmica, em Teerã, no Irã. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Departamento de Cirurgia Veterinária da universidade.

Vinte ratos Wistar machos pesando 250-300 g (com 12-15 semanas de idade) foram usados no presente estudo. Todos os ratos foram mantidos em temperatura ambiente constante e condições padronizadas, com água e ração comercial ad libitum, e colocados em gaiolas individuais de plástico com fundo macio. Os animais foram aleatoriamente divididos em dois grupos experimentais de dez animais cada: grupo isquemia-reperfusão (IR) e grupo isquemia-reperfusão + tramadol (IR+T). A anestesia foi induzida com cetamina e xilazina (i.m., 50 mg/kg e 10 mg/kg, respectivamente). Após a indução da anestesia, o membro posterior esquerdo foi completamente comprimido. Após termos comprimido, desinfetado e soltado o membro posterior esquerdo, fizemos uma incisão cutânea em sua superfície medial. A artéria femoral e a veia femoral foram isoladas dos tecidos circundantes, e a artéria femoral foi exposta e pinçada com uma minipinça buldogue. Antes da oclusão da artéria femoral, foram administrados 250 UI de heparina pela veia jugular, a fim de impedir a coagulação. Todos os animais foram submetidos a 2 h de isquemia (por meio da oclusão da artéria femoral com uma pinça vascular) e 24 h de reperfusão. Os animais foram mantidos em decúbito dorsal e permaneceram anestesiados ao longo de todo o período isquêmico. Doses adicionais dos anestésicos foram dadas conforme necessário a fim de manter a anestesia durante o experimento. A temperatura corporal foi mantida com uma almofada de aquecimento, sob anestesia. Os animais do grupo IR+T receberam tramadol i.v. (20 mg/kg)^{( 10 )} imediatamente antes da reperfusão. Após o período isquêmico, a pinça vascular foi removida, e o sítio cirúrgico foi fechado de modo rotineiro. Após a cirurgia, as perdas de fluido foram repostas por meio de administração intraperitoneal de 5 mL de solução salina isotônica morna, e os ratos foram devolvidos a suas gaiolas, com ração comercial e água ad libitum durante o período de reperfusão. Após 24 horas de reperfusão, os ratos foram sacrificados por meio de injeção intraperitoneal de uma superdose de pentobarbital (300 mg/kg), e os pulmões esquerdos foram colhidos e fixados em formaldeído a 10% para exame histopatológico por meio de microscopia de luz. Os pulmões direitos foram removidos e armazenados a –20°C para análise. As amostras de tecido pulmonar homogeneizado e sobrenadante foram preparadas conforme descrito por Yildirim et al.^{( 11 )}

O ensaio bioquímico consistiu na determinação da atividade de MPO e dos níveis de NO no tecido pulmonar. A atividade de MPO^{( 12 )} foi analisada espectrofotometricamente, conforme descrito anteriormente, ao passo que os níveis de NO no tecido pulmonar foram medidos por meio da reação de Griess.^{( 13 )}

Todas as amostras de tecido pulmonar esquerdo foram fixadas em solução de formalina a 10% e processadas de modo rotineiro (incluídas em blocos de parafina, com a região anterior do pulmão cortada em seções de 6 µm, e coradas com H E). A gravidade da lesão pulmonar foi determinada por um patologista que não estava ciente do experimento. A lesão pulmonar foi classificada em quatro níveis, a saber: nível 0, sem alteração diagnóstica; nível 1, leve infiltração de neutrófilos e congestão intersticial de leve a moderada; nível 2, moderada infiltração de neutrófilos, formação de edema perivascular e destruição parcial da arquitetura pulmonar; nível 3, densa infiltração de neutrófilos e destruição completa da estrutura pulmonar.^{( 14 )} Quatro lâminas de cada amostra de pulmão foram avaliadas de forma aleatória, e o nível médio foi considerado representativo da amostra.

As análises estatísticas foram realizadas com o programa Statistical Package for the Social Sciences, versão 11.2 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). A distribuição dos grupos foi analisada por meio do teste de Kolmogorov-Smirnov para uma amostra. Os resultados bioquímicos apresentaram distribuição normal, e a ANOVA de fator único foi usada. Os resultados histopatológicos foram analisados por meio do teste de Kruskal-Wallis e do teste U de Mann-Whitney. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.

Resultados

Todos os ratos sobreviveram ao período de estudo.

No tocante aos resultados bioquímicos, os níveis de NO foram significativamente maiores nos pulmões dos ratos do grupo IR que nos dos ratos do grupo IR+T (p = 0,001; Figura 1). Do mesmo modo, a atividade de MPO, um novo indicador de função neutrofílica, foi significativamente maior no grupo IR que no grupo IR+T (p = 0,001; Figura 2).

Figura 1  Níveis de óxido nítrico (NO) no tecido pulmonar entre os grupos estudados (p = 0,001). IR: isquemia-reperfusão; e IR+T: isquemia-reperfusão + tramadol. 

Figura 2  Atividade de mieloperoxidase (MPO) no tecido pulmonar entre os grupos estudados (p = 0,001). IR: isquemia-reperfusão; e IR+T: isquemia-reperfusão + tramadol. 

A Figura 3 mostra uma fotomicrografia representativa do tecido pulmonar dos ratos do grupo IR 24 h após a reperfusão. As alterações histológicas no grupo IR incluíram edema intra-alveolar, hemorragia intra-alveolar, e infiltração de neutrófilos. O nível médio de lesão pulmonar no grupo IR foi de 2,10 ± 0,89. Essas alterações patológicas, particularmente a infiltração de neutrófilos, foram muito menos comuns no grupo IR+T (Figura 4). Um animal do grupo IR+T não apresentou lesão, ao passo que o nível de lesão pulmonar nos outros animais variou de 1 a 2 (média: 1,70 ± 0,23). Histopatologicamente, houve uma diferença significativa entre os dois grupos (p = 0,035).

Figura 3  Fotomicrografia por microscopia de luz. Tecido pulmonar de um rato do grupo isquemia-reperfusão mostrando hemorragia intra-alveolar extensa (HE; aumento, 40Ã-). 

Figura 4  Fotomicrografia por microscopia de luz. Tecido pulmonar de um rato do grupo isquemia-reperfusão + tramadol mostrando menos alterações histológicas e estruturas mais bem preservadas, praticamente normais (HE; aumento, 40Ã-). 

Discussão

O pulmão é um dos órgãos-alvo mais importantes na síndrome de disfunção de múltiplos órgãos ou falência de múltiplos órgãos e sistemas causada por lesão grave. Os pulmões podem ser danificados por lesões indiretas causadas pela reperfusão do intestino, fígado e músculo esquelético, bem como por choque circulatório.^{( 15 , 16 )} O mecanismo de insuficiência respiratória após a lesão de isquemia-reperfusão é um processo complexo, que está associado à ativação de mediadores inflamatórios sistêmicos, incluindo toxinas bacterianas, imunocitocinas, e mediadores inflamatórios, tais como TNF e interleucinas.^{( 17 , 18 )} Tanto o TNF como o NO são determinantes importantes do processo de lesão pulmonar, que é causado por isquemia-reperfusão de membros inferiores,^{( 19 , 20 )} ao passo que a MPO é um índice para a acumulação de leucócitos ativados em tecidos e está associada à superprodução de espécies reativas de oxigênio (ERO); por conseguinte, a acumulação de leucócitos, a grande atividade de MPO e a produção excessiva de ERO coexistem no processo inflamatório. A superprodução de ERO resulta em rápida depleção da capacidade antioxidante do corpo, o que consequentemente leva à lesão de órgãos-alvo.^{( 21 , 22 )}

Estudos com animais mostraram que os opioides podem agir como um gatilho para ambas as fases do pré-condicionamento isquêmico,^{( 23 )} e a serotonina aumenta^{( 24 )} ou atenua^{( 25 )} esse fenômeno, dependendo da concentração. Mayfield et al.^{( 6 )} e Chien et al.^{( 5 )} demonstraram que a via opioide está envolvida na preservação dos tecidos durante a hipóxia ou isquemia. Provou-se que a morfina tem efeitos cardioprotetores durante a isquemia-reperfusão.^{( 26 , 27 )} Fatores como a depressão respiratória e a liberação de histamina são as desvantagens do uso de morfina no pós-operatório.^{( 28 )} O tramadol é um analgésico de ação central com ação depressora respiratória insignificante, tolerância muito baixa e tendência a dependência física. O tramadol (10 e 20 mg/kg) teve efeito protetor contra isquemia transitória do prosencéfalo em ratos.^{( 10 )} No presente estudo, testamos a hipótese de que 20 mg/kg de tramadol poderiam proteger os pulmões de lesões de órgãos remotos após a isquemia-reperfusão de músculo esquelético. Doses maiores de tramadol devem ser investigadas a fim de determinar se teriam um efeito protetor maior.

O presente estudo, em conformidade com estudos anteriores,^{( 29 - 31 )} confirmou que a isquemia-reperfusão de membros inferiores pode induzir lesão pulmonar aguda em ratos. Nós demonstramos que a lesão pulmonar aguda induzida por isquemia-reperfusão de membro inferior pode ser atenuada pelo tramadol. Nossos dados demonstram que o tramadol reduz significativamente a gravidade da lesão pulmonar aguda, a infiltração de macrófagos e leucócitos polimorfonucleares nos pulmões, a permeabilidade vascular pulmonar e a hemorragia intra-alveolar, além de inibir a apoptose celular nos pulmões após a lesão de isquemia-reperfusão de músculo esquelético. Esses resultados sugerem a possibilidade de aplicação clínica do tramadol na lesão de isquemia-reperfusão do pulmão. Estudos futuros devem investigar doses diferentes, protocolos de tempo alternativos e formas de administração do tramadol para lesão pulmonar induzida por isquemia-reperfusão de músculo esquelético.