Introdução

A ototoxicidade é um problema que pode ocorrer após tratamentos intensos de condições graves de saúde.^1-3 Às vezes é inevitável quando o tratamento da doença é uma necessidade, como nos sobreviventes de câncer. Para pacientes com câncer, a cisplatina é um agente antineoplásico comum, foi investigado anteriormente, demonstrou produzir um aumento de radicais livres de nitrogênio e espécies reativas de oxigênio, prejudiciais às células ciliadas, e causar ototoxicidade.^3-8

Existem alguns agentes, inclusive tiossulfato de sódio, amifostina, D-metionina, vitamina E, dexametasona, salicilatos, neurotrofinas, flunarizina, ácido lipoico, ebselen, dietilditiocarbamato e ácido 4-metiltiobenzóico, aos quais se atribui a capacidade de prevenir ototoxicidade.^9-15 A N-acetilcisteína (NAC), que já demonstrou diminuir a ototoxicidade causada por diferentes agentes, é conhecida por ser um potente antioxidante in vitro.^16-18

A ototoxicidade é mediada por espécies reativas de oxigênio, o que resulta em morte celular.^1-3 Em contrapartida, a N-acetilcisteína (NAC) é um antioxidante, originalmente usado como agente mucolítico para o tratamento pulmonar. Entretanto, também é usado para doenças dos pulmões, fígado, coração e rim, com o objetivo de tratar as lesões tóxicas e isquêmicas.¹⁹ Por exemplo, a NAC melhora a hemodinâmica renal em ratos com nefrotoxicidade induzida por cisplatina.²⁰ Provavelmente, além de seu efeito antioxidante, a NAC possa bloquear a cascata onde espécies reativas de oxigênio resultam em apoptose na cóclea.²¹

A ototoxicidade permanente é uma condição incapacitante que pode afastar ainda mais o paciente do ambiente social, além dos efeitos devastadores da doença primária. A detecção dela por meio de emissões otoacústicas (EOAs), potencial evocado auditivo de tronco encefálico (PEATE) e a prevenção de sua persistência, com o uso da NAC, pode ser muito benéfica para o paciente, que já lida com os problemas da doença primária.

O objetivo deste estudo foi avaliar as possíveis propriedades protetoras de um potente antioxidante (NAC) contra a ototoxicidade da cisplatina, que ocorre através dos radicais livres. A NAC poderá contribuir para a literatura sobre prevenção da ototoxicidade na quimioterapia com cisplatina, uma vez que pode ser usada em seres humanos.

Método

O artigo foi aprovado pelo comitê regional de ética em pesquisa animal (nº 16/147). Os experimentos foram feitos em laboratório de animais. Este é um estudo prospectivo e controlado em animais, sobre a ototoxicidade da cisplatina.

Nos experimentos, 21 ratos albinos machos Wistar, com 5 meses de idade e peso médio de 300-350 g, receberam uma dieta-padrão de laboratório. Todos os ratos foram mantidos em jaulas na mesma sala e sob as mesmas condições ambientais, com ciclos claro/escuro de 12/12 horas, a uma temperatura de 22 ±3 ºC e nível de ruído inferior a 50 dB. Os ratos foram alimentados ad libitum.

Inicialmente, cada rato foi anestesiado com cetamina (40 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg) via intraperitoneal (i.p.). Após a anestesia, o meato acústico externo e as membranas timpânicas de cada rato foram submetidos a otomicroscopia, não foi encontrado sinal de doença. As emissões otoacústicas por produto de distorção (EOAPD) e os potenciais evocados auditivos de tronco encefálico (PEATE) foram feitos para ambas as orelhas de cada animal para avaliação basal do limiar auditivo. Durante os experimentos, três ratos que pertenciam ao grupo controle, grupo cisplatina e grupo NAC e dois ratos que pertenciam ao grupo cisplatina + NAC não se recuperaram da anestesia e foram excluídos do estudo; portanto, novos ratos foram incluídos no lugar dos animais mortos no estudo. Como conclusão, 42 orelhas funcionalmente normais de 21 ratos foram incluídas na pesquisa.

Resultados

Resultados histopatológicos

As células ciliadas externas do grupo controle estavam dispostas em forma de U ou V. Houve um aumento gradual no comprimento dos estereocílios localizados na superfície externa, em comparação com aqueles localizados na superfície interna. Os estereocílios na superfície das células do grupo controle estavam dispostos individualmente e de maneira regular, refletiram as funções de absorção e secreção dessas células (fig. 1).

Figura 1 Fileiras de células ciliadas externas (D1 - D2 - D3) e as células de Deiters que dão suporte (Di) e a visão dos estereocílios organizados regularmente (🡗) no grupo de controle (×10.000). 

No exame de microscopia eletrônica da morfologia da superfície do órgão de Corti nos grupos NAC, os estereocílios nas células ciliadas externas eram semelhantes às do grupo controle e seus formatos em U ou V estavam preservados. No entanto, as seções apicais dos estereocílios dessas células estavam firmemente aderidas umas às outras. Não foi possível diferenciar cada estereocílio devido a essas aderências. Além disso, foram observadas irregularidades estruturais e rupturas nos estereocílios. Semelhantemente ao grupo controle, as células ciliadas externas preservaram sua organização de três camadas. No entanto, havia aderência e união entre estereocílios em formato de U ou V no grupo NAC, embora não houvesse aderência entre os estereocílios localizados nas seções superiores das células ciliadas externas e os estereocílios das células ciliadas externas adjacentes no grupo controle. Houve perda parcial de estereocílios e perda total de células em células ciliadas externas sucessivamente (fig. 2).

Figura 2 Imagem de microscopia eletrônica de varredura (MEV) das estruturas das células ciliadas externas (D1-D2-D3) cercadas por células de Deiters (Di) no grupo NAC. Imagem das áreas de aderências na seção apical dos estereocílios (🡫) e as áreas de perda na célula ciliada externa (➪) PI, células pilares internas (× 10.000). 

Havia dissociação, irregularidades e ondulações entre os estereocílios no exame da morfologia da superfície do órgão de Corti no grupo cisplatina. Além disso, rupturas foram observadas no arranjo em U ou V das células ciliadas externas. Em particular, houve perda total ou parcial de estereocílios e áreas de degeneração nos três arranjos das células ciliadas externas. Havia também uma ampla gama de áreas de deformação celular nas células ciliadas internas (fig. 3). Protrusões semelhantes a balões na estrutura das células ciliadas externas, adjacentes às células de Hensen, também foram observadas (fig. 4).

Figura 3 Imagem dos estereocílios irregulares (D1 - D2 - D3) das células ciliadas externas (⇇) no grupo cisplatina (×10.000). 

Figura 4 Área de perda parcial (⇦) nos estereocílios das células ciliadas internas (İ) e perda total (⇇) nas células ciliadas externas (D1-D2-D3) no grupo cisplatina. Visualização de protrusões em forma de balão (🡅) nas células ciliadas externas adjacentes às células de Deiters (Di). Pİ, células pilares internas; H, célula de Hensen (x 3.000). 

No grupo cisplatina mais NAC, as células ciliadas externas eram semelhantes às do grupo controle e preservaram seus formatos em U ou V. No entanto, havia aderências, embora não tão graves como no grupo NAC, nos estereocílios localizados na parte superior das células ciliadas externas. Houve perda total ou parcial de estereocílios entre as células ciliadas externas organizadas em três camadas. Além disso, havia áreas de degeneração nos estereocílios (fig. 5).

Figura 5 Imagem dos estereocílios irregulares e aderidos (⇇) das células ciliadas externas (E1-E2-E3) no grupo cisplatina + NAC (× 10.000). 

Discussão

Diferentes aspectos da ototoxicidade e agentes preventivos foram estudados anteriormente.^9-15 Embora existam outros métodos para a detecção da ototoxicidade, inclusive a histopatologia pós-morte, o rastreamento com EOAs e PEATE é uma maneira confiável. O decréscimo nas EOAs produzidas pelas células ciliadas externas é a evidência de ototoxicidade estudada anteriormente.^5,7,17

O NAC diminui o peróxido de hidrogênio e aumenta a glutationa celular, assim conhecida por reduzir a ototoxicidade da cisplatina.^22,23 A NAC pode exercer atividade osteogênica através do aumento da síntese de glutationa.²⁴ Nenhuma osteogênese foi observada após o uso de NAC neste estudo. Mas discute-se se a NAC também poderia diminuir o efeito antitumoral, uma vez que se sabe que ela interage com a molécula de cisplatina. Para evitar essa atenuação no efeito antitumoral, a NAC foi introduzida através de uma via totalmente diferente, ou seja, transtimpânica, o que garantiu que as duas moléculas não interagissem.²⁵ A introdução transtimpânica de diferentes moléculas protetoras, por exemplo, o tiossulfato de sódio, também foi tentado por outros autores.²⁶ Para resolver o problema de interação, Muldoon et al.²⁷ introduziram a NAC 4 horas após a quimioterapia e alegaram que a quimioproteção da NAC não alterava a terapia com cisplatina, se adiada em até 4 horas (h) após a quimioterapia. Eles também alegaram que esse tipo de protocolo evita a ototoxicidade. Para testar isso em nosso estudo atual, também introduzimos a NAC protetora 4 horas após a injeção de cisplatina, o que acabou reduzindo o efeito ototóxico da cisplatina. Enquanto as EOAs e PEATE estivessem diminuídos no grupo cisplatina, a NAC administrada 4 horas após a cisplatina não alterou as EOAs e o PEATE. Fomos capazes de detectar claramente a ototoxicidade com essas medidas in vivo. O grupo cisplatina revelou os piores resultados nos testes de EOAs e PEATE. As EOA e o PEATE não estavam alterados no grupo que recebeu NAC, significou que a NAC não afetou a audição por si só. Low et al.¹⁸ avaliaram a NAC administrada 72 h após a radiação e afirmaram ter observado menos radicais de oxigênio no ouvido interno, o que resultou em menos apoptose da cóclea. Isso é semelhante à ideia que testamos no presente estudo. Em estudos de fertilidade animal, nenhum efeito adverso foi relatado em doses de até 250 mg/kg de NAC e nenhum efeito teratogênico foi observado em doses de até 2000 mg/kg de NAC.²⁸ Duan et al.²⁹ observaram que uma dose cumulativa de NAC (1750 mg/kg), administrada antes e após o trauma causado por ruídos de impulso resultou em um maior desvio permanente do limiar e maior perda de células ciliadas internas em comparação aos animais controle. Em vez disso, uma dose cumulativa de 1.050 mg/kg, durante 5 dias resultou em uma proteção significativa contra o ruído de impulso. Em outro experimento, dois grupos de animais foram tratados com duas doses cumulativas diferentes e não foram expostos a trauma acústico: estes animais não apresentaram qualquer mudança no limiar. Assim, embora a NAC não seja tóxica para a cóclea isoladamente, a dosagem do fármaco é crítica para induzir seu efeito protetor. Fetoni et al.³⁰ usaram uma dose de 500 mg/kg i.p. administrada imediatamente após a exposição ao ruído e, em seguida, durante os dois dias seguintes (dose cumulativa de 1500 mg/kg). Então, usamos uma dose de 500 mg/kg i.p. de NAC. Não observamos o efeito tóxico da NAC.

Como Okur et al.²² revelaram que a ototoxicidade da carboplatina aumentou os níveis de óxido nítrico e a N-acetilcisteína evitou a produção de NO, pode haver mecanismos diferentes de ototoxicidade e prevenção.

Com relação à otopreservação em presença de drogas antineoplásicas, particularmente a cisplatina, Church et al.³¹ encontraram preservação do potencial encefálico eletrofisiológica induzido em hamsters com tiossulfato de sódio e dietildimetiltiocarbamato e não observaram proteção significante contra a amifostina e a fosfomicina. Kaltenbach et al.³² investigaram os mesmos fármacos, agora associados à avaliação estrutural por microscopia eletrônica e potencial evocado auditivo do tronco encefálico. Eles determinaram 91% de renovação das células ciliadas externas com tiossulfato de sódio, 68% com dietildimetiltiocarbamato, 52% com fosfomicina e 45% com amifostina.

Fetoni et al.³⁰ revelaram que as células ciliadas externas desapareceram e feixes desorganizados de estereocílios das células ciliadas externas foram observados. Em contraste, aqueles expostos ao ruído e a NAC mostraram apenas uma perda moderada de células ciliadas externas nas mesmas regiões e os estereocílios estavam normais.

Que seja de nosso conhecimento, os achados audiológicos e histopatológicos combinados em relação à ototoxicidade por cisplatina e a proteção por N-acetilcisteína não foram relatados anteriormente. Mostramos que os valores de PEATE e EOAs e o número de células danificadas não se alteraram acentuadamente no grupo que recebeu cisplatina e NAC, enquanto aqueles que receberam somente cisplatina mostraram alteração marcante. Os achados histopatológicos na cóclea também foram semelhantes aos achados audiológicos. A microscopia eletrônica mostrou perda de células ciliadas externas na ototoxicidade por cisplatina. Concluímos que a ototoxicidade por cisplatina pode ser evitada com o uso de NAC em ratos.

Em conclusão, houve aumento do comprimento das células ciliadas da base ao ápice na estrutura coclear. Com base nesses achados, o comprimento das células ciliadas internas e externas não pôde ser comparado entre o grupo experimental e o grupo controle. Portanto, concluímos que a deficiência auditiva pode se desenvolver como resultado de problemas no fluxo de K⁺ causados por irregularidades em junções apertadas e desmossomos em estereocílios ou bloqueio de canais por cisplatina, considerando o fato de que a informação sensorial é transportada das células ciliadas externas para a canais auditivos.

Considerando a sua dose efetiva, tempo e modo de administração, a NAC pode servir como um agente antioxidante valioso para minimizar a ototoxicidade não apenas da cisplatina, mas também de outras substâncias. Outros estudos semelhantes também são necessários para apoiar a introdução tardia do agente protetor.

Conclusão

A NAC não exerce efeito adverso na orelha interna quando usada isoladamente. Em nosso modelo experimental, a cisplatina desencadeou a ototoxicidade com sucesso, o que é evidente com base nos decréscimos nos resultados das EOAPD e PEATE e dos achados morfológicos; a NAC mostra sinais evidentes de proteção contra a ototoxicidade causada pela cisplatina no sétimo dia após a aplicação. A administração da NAC 4 horas após a injeção de cisplatina foi um fator protetor contra os achados histopatológicos negativos e a atenuação dos limiares das EOAs e PEATE causados pela cisplatina.