Efeito Protetor do Pré-Condicionamento Isquêmico no Miocárdio Contra Lesão Remota de Tecidos após Isquemia Cerebral Focal Transitória em Ratos Diabéticos

Efeito Protetor do Pré-Condicionamento Isquêmico no Miocárdio Contra Lesão Remota de Tecidos após Isquemia Cerebral Focal Transitória em Ratos Diabéticos

Autores:

Meltem Kumas,
Ozge Altintas,
Ersin Karatas,
Abdurrahim Kocyigit

ARTIGO ORIGINAL

Arquivos Brasileiros de Cardiologia

versão impressa ISSN 0066-782Xversão On-line ISSN 1678-4170

Arq. Bras. Cardiol. vol.109 no.6 São Paulo dez. 2017 Epub 13-Nov-2017

https://doi.org/10.5935/abc.20170164

Resumo

Fundamentos:

O pré-condicionamento isquêmico remoto (IPreC) poderia fornecer efeito protetor de tecido em um local remoto por vias de sinalização anti-inflamatórias, neuronais e humorais.

Objetivos:

O objetivo do estudo foi investigar os possíveis efeitos protetores do IPreC remoto no miocárdio após a oclusão transitória da artéria cerebral média (MCAo) em ratos com diabetes induzida por estreptozotocina (STZ) e ratos não diabéticos.

Métodos:

48 ratos Spraque Dawley machos foram divididos em oito grupos: grupos Sham, STZ, IPreC, MCAo, IPreC + MCAo, STZ + IPreC, STZ + MCAo e STZ + IPreC + MCAo. Induzimos MCAo sete dias após a diabetes induzida por STZ e realizamos IPreC 72 horas antes do MCAo. A lesão miocárdica remota foi investigada histopatologicamente. Os níveis de proteína Bax, Bcl2 e caspase-3 foram medidos pela análise Western Blot. O estado de antioxidante total (TAS), e o estado de oxidação total (TOS) do tecido miocárdico foram medidos por meio de um estudo colorimétrico. O índice de estresse oxidativo (OSI) foi calculado como a relação TOS-TAS. Para todas as análises estatísticas, os valores de p < 0,05 foram considerados significativos.

Resultados:

Observamos danos graves, incluindo necrose, congestão e infiltração de células mononucleares no tecido miocárdico dos grupos diabético e isquêmico. Nesses grupos os níveis de TOS e OSI foram significativamente maiores; os níveis de TAS foram inferiores aos dos grupos relacionados com IPreC (p < 0,05). O IPreC melhorou marcadamente as alterações histopatológicas e aumentou os níveis de TAS em IPreC + MCAo e STZ + IPreC + MCAo em comparação com os grupos MCAo e STZ + MCAo (p < 0,05). Em ratos não diabéticos, MCAo activou a morte celular apoptótica através do aumento da relação Bax / Bcl2 e dos níveis de caspase-3. IPreC reduziu a morte celular apoptótica pela supressão de proteínas pró-apoptóticas. O diabetes aumentou acentuadamente os níveis de proteína apoptótica e o efeito não foi revertido pelo IPreC.

Conclusões:

Podemos sugerir que o IPreC atenua a lesão miocárdica através da melhora dos achados histológicos, ativando mecanismos antioxidantes e induzindo atividade antiapoptótica em ratos diabéticos.

Palavras-chave: Precondicionamento Isquêmico Miocárdico; Artéria Cerebral Média; Ratos; Diabetes Mellitus; Experimental

Abstract

Background:

Remote ischemic preconditioning (IPreC) could provide tissue-protective effect at a remote site by anti-inflammatory, neuronal, and humoral signaling pathways.

Objectives:

The aim of the study was to investigate the possible protective effects of remote IPreC on myocardium after transient middle cerebral artery occlusion (MCAo) in streptozotocin- induced diabetic (STZ) and non-diabetic rats.

Methods:

48 male Spraque Dawley rats were divided into eight groups: Sham, STZ, IPreC, MCAo, IPreC+MCAo, STZ+IPreC, STZ+MCAo and STZ+IPreC+MCAo groups. We induced transient MCAo seven days after STZ-induced diabetes, and performed IPreC 72 hours before transient MCAo. Remote myocardial injury was investigated histopathologically. Bax, Bcl2 and caspase-3 protein levels were measured by Western blot analysis. Total antioxidant status (TAS), total oxidant status (TOS) of myocardial tissue were measured by colorimetric assay. Oxidative stress index(OSI) was calculated as TOS-to-TAS ratio. For all statistical analysis, p values < 0.05 were considered significant.

Results:

We observed serious damage including necrosis, congestion and mononuclear cell infiltration in myocardial tissue of the diabetic and ischemic groups. In these groups TOS and OSI levels were significantly higher; TAS levels were lower than those of IPreC related groups (p < 0.05). IPreC had markedly improved histopathological alterations and increased TAS levels in IPreC+MCAo and STZ+IPreC+MCAo compared to MCAo and STZ+MCAo groups (p < 0.05). In non-diabetic rats, MCAo activated apoptotic cell death via increasing Bax/Bcl2 ratio and caspase-3 levels. IPreC reduced apoptotic cell death by suppressing pro-apoptotic proteins. Diabetes markedly increased apoptotic protein levels and the effect did not reversed by IPreC.

Conclusions:

We could suggest that IPreC attenuates myocardial injury via ameliorating histological findings, activating antioxidant mechanisms, and inducing antiapoptotic activity in diabetic rats.

Keywords: Ischemic Preconditioning Myocardial; Middle Cerebral Artery; Rats; Diabetes Mellitus; Experimental

Introdução

O pré-condicionamento isquêmico (IPreC) foi descrito como redutor da lesão de isquemia-reperfusão ao desencadear episódios transientes e breves de isquemia para órgãos alvo. O IPreC pode ser induzido localmente quando o estímulo de pré-condicionamento é aplicado ao mesmo tecido ou pode ser uma proteção em tecidos distantes, um fenômeno conhecido como IPREC remoto (rIPreC).1 O rIPreC pode aplicar-se principalmente a um órgão alvo, mas se uma isquemia breve é ​​induzida em tecido não alvo, confere proteção em um local remoto, como o cérebro, tecido miocárdico adjacente não infartado, pulmão, rim, intestino ou músculo esquelético. O rIPreC produz um grau similar de proteção de tecido como faz o IPreC.1-5 Estudos recentes indicaram que uma isquemia-reperfusão breve induzida em tecido adicional poderia fornecer efeito protetor de tecido em um local remoto por vias de sinalização anti-inflamatórias, neuronais e humorais.1,6

Vários estudos mostraram que a hiperglicemia causa disfunção endotelial nas barreiras sanguíneas e cardiomiopatia diabética.7-9 Estudos clínicos demonstraram que a hiperglicemia aumentou o tamanho da área de infarto isquêmico e causou pobre desfecho clínico após o AVC.10

O estresse oxidativo é um parâmetro principal para avaliação de lesões de isquemia/reperfusão em pacientes com diabetes mellitus.11,12 As células do miocárdio também sofrem morte em resposta a hiperglicemia e lesão de isquemia/reperfusão.13 No presente estudo, postulamos que existe um possível efeito remoto do pré-condicionamento isquêmico cerebral no miocárdio.

O banco de dados atual mostra a conexão entre doença cardíaca e AVC agudo. A arritmia cardíaca, a disfunção miocárdica e a elevação da enzima cardíaca sérica são conhecidas por se desenvolver após o acidente vascular cerebral agudo.14 Os eventos cerebrovasculares isquêmicos agudos podem induzir várias alterações miocárdicas. As lesões cardíacas não são observadas antes de seis horas após o evento cerebral agudo, e não mais de duas semanas, ocorrendo lesão cardíaca como resultado da ativação intensa do sistema nervoso simpático.15

Diabetes é um importante fator de risco modificável para acidentes vasculares cerebrais, especialmente acidentes vasculares cerebrais isquêmicos. Neste estudo, nós hipotetizamos que o pré-condicionamento isquêmico poderia desempenhar um papel crucial na cardio-neuroproteção, que foi desencadeada pela hiperglicemia. Portanto, buscamos avaliar o efeito do pré-condicionamento isquêmico remoto no tecido miocárdico após a lesão transitória intraluminal de reperfusão isquêmica cerebral intra-angina em ratos diabéticos e não-diabéticos.

Métodos

Animais

Todos os animais foram obtidos do Laboratório Experimental de Pesquisa Animal da Bezmialem Vakif University, Istambul, Turquia. Os animais tiveram acesso livre aos alimentos e à água a temperatura ambiente controlada (22-25°C) sob um ciclo 12/12 horas diurno / noturno durante a duração do estudo. Durante os procedimentos cirúrgicos, a temperatura corporal foi monitorada usando um termômetro infravermelho Nimomed®.

Indução de diabetes mellitus experimental por Estreptozotocina em ratos

A estreptozotocina (STZ) induz diabetes em 3 dias, destruindo as células beta pancreáticas.16,17 A solução de estreptozotocina (STZ, Sigma Chemical Corp., Alemanha) foi preparada em tampão de citrato a 0,1 mol/L, pH 4,5, imediatamente antes da utilização. O diabetes foi induzido em ratos por uma única injeção de STZ na dose de 50 mg/kg do peso corporal intraperitonealmente e foram alimentados normalmente a partir de então. A insulina não foi administrada. Os outros grupos de animais receberam um volume igual de solução salina. As concentrações de glicose no sangue foram monitoradas antes da injeção de STZ, na 6ª hora após a injeção de STZ e no 3º dia após a injeção de STZ usando um ACCU-CHEK® (Active Glucometer, Roche Diagnostics GmbH, Alemanha). As amostras de sangue foram coletadas das veias dorsais do pé do rato. Os ratos com uma concentração de glicose superior a 300 mg/dL foram considerados diabéticos.18,19 Todos os ratos tornaram-se diabéticos após a injeção de STZ. De acordo com a pesquisa experimental publicada, cerca de seis horas depois, ocorre hipoglicemia com altos níveis de insulina no sangue.11 Para contra-arrestar a hipoglicemia inicial após a injeção de STZ, incluímos a opção de que os ratos tomassem 10% de dextrose na água fornecida aproximadamente 6 horas após a injeção STZ, além da sua água normal, durante as primeiras 24 horas.

Pré-condicionamento isquêmico (IPreC)

O pré-condicionamento isquêmico (IPreC) envolveu três ciclos de 10 minutos de reperfusão e 10 minutos de oclusão da Artéria carótida interna proximal unilateral esquerda.5 O IPreC foi realizada 72 horas antes de MCAo e 4 dias após em ratos diabéticos induzidos por STZ. Os animais foram anestesiados com cetamina (4 mg / 100 g) e xilazina (1,5 mg / 100 g) por injeção intramuscular e colocados em uma placa de operação na posição supina. Suas cabeças e membros foram fixados. Após o barbeado e a esterilização, realizou-se uma incisão medial cervical (3-4 cm de comprimento). A fáscia precervical e os músculos foram isolados com fórceps, e fáscia e músculo no interior do esternocleidomastoideo foram dissociados. Os pulsos arteriais eram visíveis. Os tecidos que rodeavam a artéria foram cuidadosamente dissociados, sem lesão no nervo vago. A artéria carótida comum esquerda e a artéria carótida externa esquerda foram expostas através de uma incisão na linha média do pescoço. Primeiro, a artéria carótida interna esquerda (ACI) foi ocluída por micro clamp. Depois, o micro clamp foi removido para restaurar o fluxo sanguíneo após 10 minutos de reperfusão, seguido de 10 minutos de oclusão. Após a remoção do micro clamp, observamos que a ACI esquerda foi reinjetada de forma anterogradia. Os controles da cirurgia Sham foram operados com os mesmos procedimentos sem oclusão da artéria.

Oclusão da artéria cerebral média (MCAo)

O modelo de AVC mais comum, devido à sua relevância para o acidente vascular cerebral humano, é o MCAo focal.20,21 No presente estudo, induzimos um MCAo proximal transitório de 3 horas seguido de reperfusão de 3 horas para causar lesão remota de isquemia-reperfusão afim de medir o nível de marcadores de estresse oxidativo e verificar se eles estavam associados com danos no tecido miocárdico e também o possível efeito protetor do pré-condicionamento isquêmico. A isquemia cerebral focal foi induzida utilizando uma técnica endovascular de oclusão arterial cerebral média, conforme descrito anteriormente.20,21 A operação sham consistiu na mesma manipulação, mas sem introdução do monofilamento.

Design do estudo

A análise de potência foi utilizada para estimar o tamanho da amostra. O tamanho da amostra foi calculado para ser quarenta e oito com uma margem de erro de 3% em um nível de significância de 0,05 para o valor de potência de 80% (erro Tipo I = 0,05; potência estatística = 0,80). Quarenta e oito ratos machos Sprague-Dawley (450-500 g; 10-12 meses) foram divididos em oito grupos; Grupo operado Sham (n = 6), grupo de ratos diabéticos induzidos por STZ (STZ) (n = 6), grupo MCAo (n = 6), grupo pré-condicionamento isquêmico (IPreC) (n = 6), pré-condicionamento isquêmico (IPreC) + Grupo MCAo (n = 6), Grupo de diabéticos (STZ) pré-condicionamento isquêmico (IPreC) (n = 6), Grupo de Diabéticos (STZ) Grupo MCAo (n = 6) e Diabético (STZ) Pré-condicionamento isquêmico (IPreC) + Grupo MCAo (n = 6).

Um MCAo proximal transitório de 3 horas foi induzido nos grupos experimentais (MCAo, IPreC + MCAo, STZ + MCAo, STZ + IPreC + MCAo). Induzimos MCAo sete dias após a diabetes induzida por STZ e também realizamos IPreC 72 horas antes do MCAo para avaliar se o IPreC poderia ter um efeito protetor no tecido remoto. Todos os animais foram sacrificados na 6ª hora após 3 horas de oclusão seguida de 3 horas de reperfusão. Os volumes totais de infarto hemisférico de cada cérebro de ratos foram avaliados analisando.2,3,5 alterações de coloração do cloreto de trifeniltetrozólio (TTC) nos gânglios basais e córtex, que são as localizações do núcleo isquêmico neste modelo. Além disso, todos os animais foram pesados todos os dias durante o período de estudo usando uma escala digital. As concentrações de glicose no sangue foram monitoradas antes da injeção de STZ, na 6ª hora após a injeção de STZ, no 3º dia após a injeção de STZ e após o sacrifício dos ratos.

Avaliação do volume de infarto

Os volumes de infarto foram calculados usando seções cerebrais tingidas com TTC, conforme descrito anteriormente.5 Após o sacrifício, os cérebros foram removidos imediatamente e cortados em seções coronais de 2 mm. As amostras foram então incubadas durante 30 min numa solução a 2% de TTC a 37°C e fixadas por imersão em 10% de solução de formalina tamponada. Cinco seções cerebrais por animal foram coradas com TTC e depois fotografadas. Os volumes de infarto cerebral foram avaliados utilizando o programa de análise de imagem do Adobe Photoshop CS5 estendido (versão 12.1).

Homogeneização de tecidos

O ventrículo esquerdo foi cortado em pedaços adequadamente pequenos para análise (300 mg) e colocado em tubos de microcentrifugado, lavado 3x com 1 ml de PBS e aspirado. Foram utilizadas pérolas de aço inoxidável (mistura de 1,6 mm) para homogeneização com tampão de lise NP-40 (Tris-Cl 2 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, glicerol a 10% e NP-40 a 0,2% mais um coquetel inibidor de protease). Após a homogeneização, os homogeneizados foram centrifugados a 19,700 x g durante 30 minutos a + 4ºC. O sobrenadante foi usado como amostra de proteína.

Medição do estado do oxidante total

O nível de TOS do miocárdio foi medido usando um novo método automatizado desenvolvido por Erel.22 Os oxidantes presentes numa amostra oxidam o íon ferroso de um complexo de o-dianisidina para íon férrico. A oxidação é aumentada pelo glicerol, que é abundante no meio de reação, e o íon férrico forma um complexo colorido com laranja xilenol em condições ácidas. A intensidade da cor, que pode ser medida por espectrofotometria, está associada ao nível total de oxidantes presentes. O peróxido de hidrogênio é usado para calibrar o ensaio e os resultados são expressos em termos de micromoles de peróxido de hidrogênio equivalente por litro (mmol H2O2 equiv./l).

Medição do estado antioxidante total

O nível de TAS do miocárdio foi medido usando outro método inovador automatizado desenvolvido por Erel.23 Envolve a produção do radical hidroxilo, que é um potente reagente biológico. Uma solução de íons ferrosos (Reagente 1) é misturada com peróxido de hidrogênio (Reagente 2). Os radicais produzidos pelo radical hidroxilo, incluindo o catião do radical dianisidinilo marrom, também são potentes em termos biológicos. Assim, é possível medir a capacidade antioxidante de uma amostra em termos de inibição de reações de radicais livres iniciadas pela produção do radical hidroxilo. A variação nos dados de ensaio é muito baixa (menos de 3%) e os resultados são expressos como mmol Trolox equiv./l. Os resultados foram dados para 1 mg de proteína total em tecido.

Medição do índice de estresse oxidativo (OSI)

O nível de OSI foi a relação do TOS-miocárdico e o TAS miocárdico, mas os valores de TAS foram alterados para mmol/l. Cada OSI foi calculado da seguinte forma: OSI (unidades arbitrárias) = TOS (mmol H2O2/l) / TAS (mmol Trolox/l).24

Análise histopatológica

O ventrículo esquerdo também foi avaliado para análise histopatológica. As seções foram coradas com os métodos de hematoxilina-eosina e tricromo de Masson. Usamos hematoxilina-eosina para detecção rotineira de alterações patológicas, incluindo necrose, congestionamento e infiltração. O método tricrômico de Masson foi escolhido para determinar a fibrose no miocárdio, se houver. As seções foram examinadas e marcadas por um observador que era cego à identificação dos grupos usando um microscópio Nikon Eclipse i5 com câmera Nikon DS-Fi1c e sistemas de análise de imagem Nikon NIS Elements versão 4.0 (Nikon Instruments Inc., Tóquio, Japão). O dano do miocárdio foi avaliado em termos de necrose, congestionamento e infiltração de células mononucleares. Cada dado foi classificado como: 0: ausente, 1: mínimo, 2: moderado, 3: dano severo.

Western Blot

A proteína de membrana total foi extraída das amostras de tecido homogeneizado do modo seguinte. Os tecidos cardíacos de todos os grupos foram homogeneizados em tampão de lise (Tris-Cl 2 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, glicerol a 10% e coquetel inibidor de protease NP-40 + 0,2%) durante 30 min em gelo. Em seguida, os homogeneizados foram centrifugados (Beckman Coulter, Krefeld, Alemanha) a 19,700 x g durante 10 min a 4° C, e o sobrenadante final foi utilizado como proteína de membrana total. As amostras de gel foram feitas adicionando 100 µl de tampão de amostra de Laemmli contendo 2% de SDS (Santa Cruz, Paso Robles, CA) a uma proteína total de 10 mg. A concentração de proteína foi medida usando o método de Bradford, foram carregados 40 microgramas de proteína total de cada amostra em um gel de electroforese de poliacrilamida de poliéster de sódio a 8% a 12% (PAGE) para separação. A proteína separada foi transferida para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Billerica, MA). Após a incubação em 5% de leite desnatado durante 2 h à temperatura ambiente para bloquear a ligação não específica, a membrana de PVDF foi feita reagir durante 16 h a 4° C. Os anticorpos monoclonais de coelho anti-rato caspase 3, Bax e Bcl-2 foram adquiridos da Sigma -Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Todos os anticorpos foram diluídos 1: 1000 em solução salina tamponada com Tris mais Tween 20 (TBST: Tris HCl 20 mM, NaCl 137 mM e Tween-20 a 0,1%, pH 7,6) contendo% 5 de leite em pó desnatado. A membrana foi então lavada com solução salina tamponada com tris mais Tween (TBST: Tris HCl 20 mM, NaCl 137 mM e Tween-20 a 0,1%, pH 7,6) três vezes durante 10 minutos cada vez e incubadas com peroxidase de rábano (HRP) - Anticorpos de IgG anti-coelho marcados diluídos 1: 5000 em TBS contendo 5% de leite desnatado (Santa Cruz). Finalmente, a membrana de PVDF foi lavada três vezes com TBST por 10 min cada vez, feita reagir com o substrato de transferência Western Pierce ECL (Thermo Scientific) e visualizada utilizando o Fussion Fx7 Imaging System (Vilber Lourmat SA, França). O anticorpo da b-actina (Santa Cruz) foi utilizado como um controle de carga. Para análise semiquantitativa, as escalas de cinza das bandas Caspase-3, Bax, Bcl-2 e b-actina foram medidas usando o software Image J. A proporção de Caspase 3, Bax, Bcl-2 para b-actina foi calculada.

Análise estatística

A normalidade de todos os dados foi testada com o teste Kolmogorov-Smirnov D. Uma vez que eles foram normalmente distribuídos (teste Kolmogorov-Smirnov D, p ≥ 0,05), o teste ANOVA paramétrico (post-hoc: HSD de Tukey) foi utilizado para comparações múltiplas. As medidas contínuas são expressas como média e desvio padrão (média ± 2SD) para cada grupo. Os valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Todas as análises estatísticas e gráficos de barras foram realizadas com SPSS 20.0 (IBM, Nova York, EUA), MS Office Excel e Graph Pad Prism 6.

Resultados

Avaliação dos parâmetros de estresse oxidativo

O valor de TAS miocárdico médio mais baixo foi detectado em 0,96 ± 0,15 (média ± 2SD) do grupo STZ + MCAo, enquanto os valores mais altos foram medidos como 1,58 ± 0,56 e 1,57 ± 0,88 nos grupos sham e IPreC + MCAo, respectivamente. A indução de lesão por reperfusão de isquemia diminuiu significativamente o TAS miocárdico em todos os grupos relacionados quando comparado aos grupos sham e IPreC (p = 0,003 e p = 0,042, respectivamente). Além disso, o pré-condicionamento isquêmico aumentou significativamente o valor médio de TAS do miocárdio após lesão de isquemia-reperfusão em ratos não-diabéticos (IPreC + MCAo versus MCAo (1,07 ± 0,30), p = 0,008), enquanto o efeito protetor não apareceu em ratos diabéticos (STZ + MCAo + IPreC (1,13 ± 0,50) versus STZ + MCAo (0,96 ± 0,30), p > 0,05).

Os níveis médios de TOS do miocárdio dos grupos STZ e MCAo foram 12,79 ± 1,12 e 12,74 ± 1,54, respectivamente. Assim, esses níveis de grupos IPreC (11,17 ± 1,26) e sham (11,05 ± 1,56) foram semelhantes. O resultado pode indicar que o pré-condicionamento isquêmico não excede o limiar de danos nos tecidos. Além disso, um estudo clínico relatou que o diabetes pode prevenir o pré-condicionamento isquêmico.25 Em contraste, descobrimos que o pré-condicionamento isquêmico reduziu a capacidade oxidante em ratos diabéticos (STZ vs. IPreC + STZ (11,62 ± 1,74), p = 0,036). Da mesma forma, o IPreC reduziu significativamente o nível médio de TOS miocárdico em ratos diabéticos e não diabéticos submetidos à oclusão da artéria cerebral média (MCAo vs. IPreC + MCAo (10,96 ± 1,72), p < 0,001; STZ + MCAo (12,81 ± 1,46) vs. STZ + MCAo + IPreC (12,33 ± 0,58), p = 0,04).

Em todos os grupos de estudo, o maior valor do OSI, que é determinado com base na relação miocárdica TOS/TAS, foi detectado como 12,15 ± 4,26 e 13,61 ± 5,28 nos grupos MCAo e STZ + MCAo, respectivamente. Tanto os ratos diabéticos como os não diabéticos que foram induzidos por lesão de isquemia-reperfusão, demonstraram significativamente valores inferiores de OSI após IPreC, em comparação com os não relacionados a IPreC (MCAo vs. IPreC + MCAo, p = .005 e STZ + MCAo vs. STZ + IPreC + MCAo, p = 0,037).

Os níveis médios de estado antioxidante total do miocárdio (TAS, Figura 1 A), estado de oxidação total (TOS, Figura 1 B) e índice de estresse oxidativo calculado (OSI: TOS/TAS, Figura 2) para todos os grupos são mostrados em gráficos de barras.

Figura 1 Nível médio de TAS do miocárdio (estado antioxidante total) e TOS (estado do oxidante total) em todos os grupos. (* p <0,05 versus grupo MCAo, np < 0,05 vs. STZ + grupo MCAo, δp < 0,05 vs. grupo STZ. ANOVA unidirecional, teste HSD de Tukey pós-hoc. (STZ, diabéticos induzidos por Estreptozotocina, IPreC, Pré-condicionamento isquêmico, MCAo, oclusão da artéria cerebral média). 

Figura 2 Valores médios de OSI (índice de estresse oxidativo) em todos os grupos. (* p < 0,05 versus grupo MCAo, np < 0,05 vs. STZ + grupo MCAo, δp < 0,05 vs. grupo STZ. ANOVA unidirecional, teste HSD de Tukey pós-hoc. (STZ, diabéticos induzidos por Estreptozotocina, IPreC, Pré-condicionamento isquêmico, MCAo, oclusão da artéria cerebral média). 

Histopatologia do miocárdio

A arquitetura histológica dos tecidos cardíacos do grupo IPreC foi semelhante à do grupo sham (Figura 3 (1)). Os tecidos cardíacos de grupos isquêmicos e diabéticos apresentaram alterações histopatológicas graves, incluindo congestão, necrose e infiltração de células mononucleares. O escore médio de congestão (MCS) do tecido miocárdico foi semelhante entre STZ e MCAo (p > 0,05, 2,00 ± 1,42, 2,00 ± 1,26, respectivamente). O valor médio de congestionamento miocárdico mais alto foi avaliado no grupo STZ + MCAo (2,50 ± 1,10). O IPreC remoto diminuiu o escore de congestão miocárdica nos grupos IPreC + MCAo (1,85 ± 0,76) (Figure 3 (2a)) e STZ + IPreC + MCAo (1,87 ± 1,78) (Figure 3 (2b)) quando comparados aos grupos MCAo e STZ + MCAo, respectivamente. Essas diferenças não foram encontradas estatisticamente significativas entre os grupos (p > 0,05).

Figure 3 (1) Normal histological view of cardiac myofibrils in IPreC group. (Longitudinal section, Masson Trichrome stain, Magnification: 40X). (2) Congestion in IPreC+ MCAo (A) and STZ+ IPreC+ MCAo (B) groups. Overview of myofibril is nearly normal appearance. (Longitudinal section, A. H-E stain, B. Masson Trichrome stain, Magnification: 20X). (3) Eosinophilic stained areas show necrotic myofibrils that are lack of nuclei (arrow-heads) in STZ group. Arrows indicate that spaces between cardiac myofibrils. These spaces indicate necrotic area, and probably interstitial edema. (STZ, Streptozotocin-induced diabetic; IPreC, ischemic preconditioning; MCAo, middle cerebral artery occlusion, Transverse section, H-E stain, Magnification: 20X). 

As fibrilas necróticas raramente apareceram no tecido miocárdico de grupos IPreC e sham. O escore de necrose média (MNS) do miocárdio no grupo IPreC foi registrado como 2,00 ± 1,26. Esse escore não foi encontrada significativamente diferente da do grupo sham (p > 0,05). Diabetes e isquemia causaram necrose coagulativa extensa ao longo do parênquima cardíaco, em comparação com o grupo sham (p = 0,001, p < 0,001, respectivamente). Após a lesão de isquemia-reperfusão em ratos diabéticos, as fibrilas miocárdicas e os núcleos de miócitos tornaram-se pouco visíveis e quase desapareceram (Figura 3 (3)) e os espaços entre fibrilas miocárdicas se tornaram maiores, provavelmente indicando edema intersticial (Figura 4 (b)). O MNS mais alto foi detectado como 2,66 ± 1,04 no grupo STZ + MCAo. Mais uma vez, existem diferenças consistentes entre os grupos IPreC + MCAo e STZ + IPreC + MCAo e os grupos MCAo e STZ + MCAo quanto ao escore de necrose média (p < 0,001, para ambos).

Figure 4 (a) Congestion (arrows) destroyed myofibrils in STZ+ MCAo group. Cardiac myofibrils are separated from each other along with congestive area. These areas probably seem to be necrotic areas accompanied by interstitial edema. (Transverse section, H-E stain, Magnification: 20X). (b) Mononuclear cell infiltration, congestion and interstitial edema in necrotic areas (arrows) destroyed cardiac myofibrils in STZ+ MCAo group (STZ, Streptozotocin-induced diabetic; IPreC, ischemic preconditioning; MCAo, middle cerebral artery occlusion, Longitudinal section, H-E stain, Magnification: 20X). 

A infiltração de células mononucleares foi observada principalmente em torno das áreas necróticas acompanhadas de edema intersticial em grupos isquêmicos, incluindo MCAo e STZ + MCAo (Figura 4 (b)). Os valores médios de infiltração mais altos (MIS) foram registrados no grupo MCAo e STZ + MCAo. A infiltração destruiu severamente as miofibrilas e degenerou o miocárdio nos grupos MCAo (Figura 5A) e STZ + MCAo (Figura 5B). O pré-condicionamento isquêmico remoto reduziu a infiltração de células mononucleares no parênquima miocárdico após MCAo em ratos diabéticos e não-diabéticos em comparação com controles não pré-condicionados (MCAo (2,16 ± 1,5) vs. IPreC + MCAo (0,57 ± 0,46), p = 0,013 e STZ + MCAo (2,83 ± 0,82) vs. STZ + IPreC + MCAo (1,57 ± 1,06), p < 0,001). Entre os grupos STZ, IPreC e STZ + IPreC, não houve diferença significativa em relação ao MIS (p > 0,05). Como resultado, induzir estímulos de pré-condicionamento isquêmico remoto abaixo do limiar de dano, poderia reprimir a resposta inflamatória e oxidativa celular a lesões isquêmicas e diabetes, o que poderia prevenir lesões cardíacas remotas.

Figure 5 A) Degenerated myocardium caused by mononuclear cell infiltration (arrows) in MCAo group. B) Severely myodegeneration with interstitial edema, necrosis (arrows) and congestion (arrow-heads), in STZ+ MCAo group. (STZ, Streptozotocin-induced diabetic; IPreC, ischemic preconditioning; MCAo, middle cerebral artery occlusion, Longitudinal section, H-E stain, Magnification: 10X). 

Os escores de lesões do miocárdio como escore médio de congestão, escore de necrose média e escore médio de infiltração de células mononucleares para todos os grupos de estudo são mostrados na Figura 6 (a), 6 (b) e 6 (c), respectivamente.

Figure 6 A) Mean congestion scores in all groups. (*p < 0.05 vs. MCAo group, #p < 0.05 vs. STZ+ MCAo group, δp < 0.05 vs. STZ group. B) Mean necrosis scores in all groups. (*p < 0.05 vs. MCAo group, #p < 0.05 vs. STZ+ MCAo group. C) Mean mononuclear cell infiltration scores in all groups. (*p < 0.05 vs. MCAo group, #p < 0.05 vs. STZ+ MCAo group (One-way ANOVA, post-hoc Tukey’s HSD test. STZ, Streptozotocin-induced diabetic; IPreC, ischemic preconditioning; MCAo, middle cerebral artery occlusion). 

Análise Western Blot

No grupo MCAo, a relação Bax/Bcl2 foi de 1,18 ± 0,26, e essa proporção foi encontrada como 0,72 ± 0,3 no grupo IPreC (p = 0,026) e 0,09 ± 0,06 no grupo sham (p < 0,001). Relação Bax/Bcl2 marcadamente reduzida no grupo IPreC + MCAo em comparação com o grupo MCAo (p < 0,001).

O nível de Caspase 3 foi maior no grupo MCAo (1,29 ± 0,12) em comparação com os grupos sham (0,35 ± 0,06) e IPreC (0,82 ± 0,30) (p < 0,001). Portanto, esse nível foi menor no grupo IPreC + MCAo (0,52 ± 0,02, p < 0,001). IPreC suprimiu o progresso da apoptose em ratos isquêmicos não-diabéticos.

A apoptose do miocárdio foi severamente induzida pela diabetes em todos os grupos de estudo com diabetes, incluindo os grupos STZ, STZ + IPreC, STZ + MCAo e STZ + IPreC + MCAo. A maior relação de Bax/Bcl2 e os níveis de proteína da caspase 3 foram detectados nesses grupos. A diabetes isolada principalmente induziu a morte das células apoptóticas através de proteínas ativadas Bax e Caspase-3 e suprimiu a atividade de Bcl-2. O pré-condicionamento não mostrou nenhum efeito protetor contra a apoptose em grupos diabéticos. A análise de Western blots e a razão média de Bax/Bcl-2 e os níveis de caspase 3 de todos os grupos são mostrados na Figura 7 e 8, respectivamente.

Figure 7 A) Western blot analysis of Bax and Bcl 2 proteins in cardiac tissues of all groups. B) Mean ratio of Bax/Bcl 2 levels in all groups. (*p < 0.05 vs. MCAo group, #p < 0.05 vs. STZ+ MCAo group, δp < 0.05 vs. STZ group. One way ANOVA, post-hoc Tukey’s HSD test. (STZ, Streptozotocin-induced diabetic; IPreC, ischemic preconditioning; MCAo, middle cerebral artery occlusion). 

Figure 8 A. Western blot analysis of Caspase 3 protein in cardiac tissues of all groups. B. Mean Caspase 3 levels in all groups. (*p < 0.05 vs. MCAo group, #p < 0.05 vs. STZ+ MCAo group, δp < 0.05 vs. STZ group. One-way ANOVA, post-hoc Tukey’s HSD test. (STZ, Streptozotocin-induced diabetic; IPreC, ischemic preconditioning; MCAo, middle cerebral artery occlusion) 

Pré-condicionamento isquêmico reduz o volume total de infarto

Não observamos nenhuma área de infarto nas seções cerebrais tingidas com TTC dos grupos STZ, Sham, IPreC e STZ + IPreC. O pré-condicionamento isquêmico antes da isquemia cerebral reduziu significativamente o tamanho do infarto em comparação com os demais grupos [IPreC + MCAo (27,26 ± 20,04 mm3) vs. MCAo (109,07 ± 30,56 mm3) p < 0,001; STZ + IPreC + MCAo (38,70 ± 19,18 mm3) vs. STZ + MCAo (165,87 ± 82 mm3) p < 0,001, respectivamente]. Além disso, detectamos que o pré-condicionamento isquêmico poderia melhorar a lesão isquêmica em diabetes [STZ + IPreC + MCAo vs. MCAo p < 0,001].

Discussão

Distúrbios cardiovasculares, incluindo hipertensão, arritmias cardíacas, liberação de biomarcadores de lesão cardíaca e disfunção ventricular esquerda são observados principalmente após vários tipos de lesão cerebral, como trauma, acidente vascular cerebral isquêmico e hemorragia subaracnóidea.14,26,27 A lesão cardíaca neurogênica aumenta o risco de mortalidade e morbidade.>28,29 A lesão neurológica afeta o tecido cardíaco através da inflamação e da liberação da catecolamina. Ambas causam morte de células cardíacas.30 Diabetes é um importante fator de risco modificável para acidentes vasculares cerebrais, especialmente acidentes vasculares cerebrais isquêmicos. Foi afirmado em estudos anteriores que a hiperglicemia também causou cardiomiopatia e resultou em similares complicações cardiovasculares com isquemia.7,8,12

A resposta precoce das células do miocárdio contra a hiperglicemia é a morte de células cardíacas.13 Dois tipos de morte celular, incluindo necrose e apoptose, são detectados em cardiomiócitos de animais diabéticos.31 A necrose é uma morte celular descontrolada em resposta ao estresse oxidativo. Isso provoca depleção de ATP e muda rapidamente a integridade da membrana plasmática, que acompanha a inflamação e danifica seriamente não apenas as células relacionadas, mas também células vizinhas.32,33 No presente estudo, tentamos avaliar lesões cardíacas remotas após oclusão cerebral média em ratos diabéticos. Observamos extensas áreas necróticas no miocárdio de grupos STZ e MCAo, especialmente em grupos STZ + MCAo. Além disso, inflamação e edema foram vistos em torno das áreas necróticas desses grupos. O maior escore necrótico médio foi detectado no grupo STZ + MCAo em comparação com outros grupos (p < 0,05). O IPREC é eficaz na redução do dano cardíaco induzido por MCAo por supressão da morte celular necrótica. Os escores mais baixos foram registrados em grupos pré-condicionados isquêmicos remotos. No entanto, os escores médios de necrose dos grupos STZ e STZ + IPreC foram quase similares entre si. Podemos relatar que o pré-condicionamento isquêmico remoto diminui a taxa de necrose induzida pela isquemia, mesmo que induzir a diabetes suprima o efeito protetor.

A possível explicação para o resultado pode ser a ativação do sistema de defesa antioxidante. O estresse oxidativo é um determinante primário de lesões cerebrais e miocárdicas durante a reperfusão/isquemia cerebral e miocárdica em pacientes com diabetes mellitus.11,12 Os diabéticos e os modelos animais experimentais induzidos por STZ apresentam alto estresse oxidativo devido à disfunção de células b resultante em toxicidade de glicose; por isso a atividade do sistema de defesa antioxidante é danificada pelo diabetes.11,34 TAS, TOS e OSI são amplamente utilizados em estudos para determinar a atividade de estresse oxidativo. TOS indica a concentração de todos os radicais oxidantes livres causados por diabetes e isquemia contra dano oxidativo. Por outro lado, o TAS é um marcador importante para determinar as atividades do sistema de defesa antioxidante contra danos celulares.5 No presente estudo, os níveis de TOS foram bem maiores em grupos induzidos por MCAo e STZ comparados com grupos sham e IPreC, enquanto que os níveis TAS mais baixos foram detectados nesses grupos (p < 0,001). Observamos que a OSI foi mais alta em grupos diabéticos e isquêmicos em comparação com os grupos IPreC (p < 0,001). O IPreC inibiu o estresse oxidativo em ratos diabéticos e não diabéticos. O TAS miocárdico foi notadamente ativado pelo pré-condicionamento em grupos diabéticos e isquêmicos.

Os escores histopatológicos de outros parâmetros, incluindo congestão e infiltração celular também diminuíram nos grupos IPreC + MCAo e STZ + IPreC + MCAo. IPreC melhorou as alterações histopatológicas em grupos diabéticos e isquêmicos.

Em contraste com a necrose, a apoptose é uma morte celular programada fisiologicamente, remove apenas células danificadas sem provocar inflamação e danificar outras células vizinhas.33,35 Estudos experimentais e baseados em humanos mostraram que a apoptose do miocárdio aumenta o diabetes e o diabetes induzido por STZ.36-38 Assim, os miócitos cardíacos do miocárdio diabético são mais vulneráveis à apoptose do que os não diabéticos.37-39 A apoptose dos miócitos cardíacos é comumente vista em várias doenças cardiovasculares, incluindo cardiomiopatia diabética, infarto do miocárdio, lesão por isquemia/reperfusão.36 O pré-condicionamento é um mecanismo protetor contra a lesão orgânica induzida por isquemia/reperfusão. O pré-condicionamento isquêmico reduz acentuadamente a fragmentação do DNA e a morte celular apoptótica em miócitos.31 O equilíbrio nas proteínas pró-apoptóticas Bax e anti-apoptóticas Bcl-2 regulam a via de morte celular mitocondrial.39-41 Bcl-2 é importante na sobrevivência celular através da supressão da morte celular apoptótica e protege os miócitos cardíacos contra vários fatores de estresse. Por outro lado, o Bax é ativado pelo estresse oxidativo e a superexpressão da proteína Bax provoca a morte celular apoptótica.42 Caspase-3 desempenha um papel fundamental na execução da apoptose, a ativação da caspase-3 sozinha foi suficiente para causar morte celular no músculo cardíaco.43 A ativação da Caspase-3 está principalmente envolvida na morte celular apoptótica induzida pela hiperglicemia no miocárdio.11 O IPreC inibe a apoptose alterando o equilíbrio entre as proteínas pró-apoptóticas e anti-apoptóticas e inibindo a atividade da caspase.44,45 Em nosso estudo, descobrimos que o pré-condicionamento isquêmico remoto diminuiu a relação Bax/Bcl2 e a atividade da caspase 3 após lesão por isquemia-reperfusão (Grupo IPreC + MCAo vs. MCAo, p < 0,001). Por isso, o índice de lesão miocárdica em ratos diabéticos induzidos por STZ foi detectado tão alto como nos ratos MCAo. Ao contrário dos ratos não-diabéticos, a IPreC remota não desempenhou um papel na inibição da morte celular apoptótica em ratos diabéticos.

Conclusão

Como conclusão, o pré-condicionamento isquêmico cerebral atenua a lesão miocárdica através da melhora dos achados histológicos e ativando o mecanismo antioxidante e induzindo atividade anti-apoptótica em ratos diabéticos. O pré-condicionamento também tem efeito anti-apoptótico em ratos não-diabéticos, enquanto que não tem o mesmo efeito em ratos diabéticos. Podemos sugerir que a razão é que o processo de pré-condicionamento foi aplicado após a injeção de Estreptozotocina, portanto a apoptose já foi induzida pelo diabetes antes do processo de pré-condicionamento. Como resultado, poderíamos assumir que o IPreC remoto pode não ter mostrado efeito protetor contra a apoptose em ratos diabéticos. Mais estudos experimentais poderiam ser feitos para determinar possíveis mecanismos que possam explicar a perda de pré-condicionamento isquêmico em corações diabéticos; as alterações vasculares e bioquímicas no miocárdio associadas à hiperglicemia induzida por STZ poderiam ser avaliadas em diferentes intervalos de tempo após pré-condicionamento isquêmico remoto.

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