Efeito Vasodilatador Independente do Endotélio Induzido pela Jabuticaba (M. cauliflora) em Artérias Isoladas

Efeito Vasodilatador Independente do Endotélio Induzido pela Jabuticaba (M. cauliflora) em Artérias Isoladas

Autores:

Daniela Medeiros Lobo de Andrade,
Leonardo Luis Borges,
Ieda Maria Sapateiro Torres,
Edemilson Cardoso da Conceição,
Matheus Lavorenti Rocha

ARTIGO ORIGINAL

Arquivos Brasileiros de Cardiologia

versão impressa ISSN 0066-782Xversão On-line ISSN 1678-4170

Arq. Bras. Cardiol. vol.107 no.3 São Paulo set. 2016 Epub 11-Ago-2016

https://doi.org/10.5935/abc.20160118

Resumo

Fundamentos:

Embora a jabuticaba apresente importantes efeitos biológicos, suas ações sobre o sistema cardiovascular ainda não foram esclarecidas.

Objetivos:

Determinar os efeitos do extrato de jabuticaba (EHJ) sobre o músculo liso vascular (MLV) em artérias isoladas.

Métodos:

Aortas (sem endotélio) de ratos foram montadas em banho de órgãos isolados para registro de tensão isométrica. Foram verificados o efeito relaxante, a influência dos canais de K+ e das fontes de Ca2+ intra- e extracelular sob a resposta estimulada pelo EHJ.

Resultados:

Artérias pré-contraídas com fenilefrina apresentaram relaxamento concentração-dependente (0,380 a 1,92 mg/mL). O tratamento com bloqueadores de canais de K+ (tetraetilamônio, glibenclamida, 4-aminopiridina) prejudicaram o relaxamento pelo EHJ. A contração estimulada com fenilefrina também foi prejudicada pelo tratamento prévio com EHJ. A inibição da Ca2+ATPase do reticulo sarcoplasmático não alterou o relaxamento pelo EHJ. Além disso, o EHJ inibiu a contração causada pelo influxo de Ca2+ estimulado por fenilefrina e KCl (75 mM).

Conclusão:

O EHJ induz vasodilatação independente do endotélio. Ativação dos canais de K+ e inibição do influxo de Ca2+ através da membrana estão envolvidas no efeito relaxante do EHJ.

Palavras-chave: Jabuticaba-Myrciaria Cauliflora; Árvores; Vasodilatação; Canais de Cálcio; Músculo Liso Vascular

Abstract

Background:

Despite the important biological effects of jabuticaba, its actions on the cardiovascular system have not been clarified.

Objectives:

To determine the effects of jabuticaba hydroalcoholic extract (JHE) on vascular smooth muscle (VSM) of isolated arteries.

Methods:

Endothelium-denuded aortic rings of rats were mounted in isolated organ bath to record isometric tension. The relaxant effect of JHE and the influence of K+ channels and Ca2+ intra- and extracellular sources on JHE-stimulated response were assessed.

Results:

Arteries pre-contracted with phenylephrine showed concentration-dependent relaxation (0.380 to 1.92 mg/mL). Treatment with K+ channel blockers (tetraethyl-ammonium, glibenclamide, 4-aminopyridine) hindered relaxation due to JHE. In addition, phenylephrine-stimulated contraction was hindered by previous treatment with JHE. Inhibition of sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase did not change relaxation due to JHE. In addition, JHE inhibited the contraction caused by Ca2+ influx stimulated by phenylephrine and KCl (75 mM).

Conclusion:

JHE induces endothelium-independent vasodilation. Activation of K+ channels and inhibition of Ca2+ influx through the membrane are involved in the JHE relaxant effect.

Keywords: Jabuticaba (Myrciaria Cauliflora); Trees; Vasodilatation; Calcium Channels; Muscle, Smooth Vascular

Introdução

Doenças cardiovasculares são as maiores causas de morte no mundo e, dentre elas, a hipertensão é responsável por 9,4 milhões de mortes por ano.1 Perto de 1 bilhão de adultos no mundo sofrem de hipertensão e este número aumentará 25% em 10 anos.2

A regulação do tônus vascular é fundamental para o apropriado controle da pressão arterial. A contração e a dilatação dos vasos sanguíneos em resposta às demandas fisiológicas são controladas por mudanças na concentração intracelular de Ca2+ nas células do músculo liso vascular (MLV). O aumento da concentração intracelular de Ca2+ ocorre através do influxo desse íon pela membrana plasmática e por liberação de fontes internas de Ca2+, como o retículo sarcoplasmático.3,4 Fármacos efetivos para controle da pressão arterial como nifedipina, verapamil e diltiazem, os quais atuam como bloqueadores de canais de Ca2+ induzem vasodilatação e reduzem a pressão arterial.5

O uso de produtos naturais como possível alternativa para o tratamento da hipertensão tem sido extensivamente estudado, sendo conhecidos por induzir hipotensão com mínimos efeitos colaterais.6,7 A jabuticaba é um fruto da família Myrtaceae, amplamente distribuído no Brasil. Ela é consumida in natura, na forma de licores, vinhos, geleias e doces, cujo consumo tem aumentado no Brasil e no exterior.8,9 Em adição ao uso da fruta como alimentos e bebidas, a medicina popular usa a jabuticaba para tratar algumas doenças como asma, inflamações, problemas gastrintestinais e distúrbios cardiovasculares.10 Recentes achados mostram a capacidade da jabuticaba em reduzir o processo oxidativo,11 a hiperglicemia associada à resistência a insulina12 e a dislipidemia.13 Além disso, a espécie tem comprovado efeito hipotensor e vasodilatador dependentes do endotélio vascular, efeitos estes mediados pela via do óxido nítrico.14

Considerando que a espécie apresenta importantes efeitos biológicos e suas ações sobre o sistema cardiovascular têm sido muito pouco estudadas, o objetivo deste trabalho foi avaliar a possível ação do extrato de jabuticaba diretamente sobre o MLV, examinando principalmente o efeito da espécie sobre o influxo de Ca2+ através da membrana e ativação de canais de K+.

Métodos

Preparação do extrato de jabuticaba (Myrciaria cauliflora)

As frutas foram doadas pela adega "Jabuticabal" na cidade de Hidrolândia, GO, Brasil. Uma amostra da espécie foi depositada no herbário do departamento de botânica da Universidade Federal de Goiás (UFG) (n. 21140). As frutas sem as sementes foram secas em estufa de ar circulante, pulverizadas em moinho de facas e passadas por um tamis de malha 60 no Laboratório de Pesquisa em Produtos Naturais, Faculdade de Farmácia/UFG. O pó obtido foi estocado em -20°C. Para preparação do extrato, o material seco foi extraído exaustivamente por percolação em solução etanol:água (55:45 v/v) e o extrato obtido foi filtrado e rota-evaporado sob pressão reduzida a 40°C, resultando no extrato hidroalcoólico de jabuticaba (EHJ) isento de etanol. Após este processo, o EHJ foi mantido em freezer (-20°C) protegido da luz. No dia dos experimentos, o EHJ foi solubilizado em água destilada numa concentração de 120 mg/mL.

A caracterização e padronização fitoquímica do EHJ mostrou 17,89% de compostos fenólicos, quantificados por método de Hagerman & Butler, adaptado por Mole e Watermen.15 O EHJ apresentou ácido elágico (marcador fitoquímico, determinado por HPLC-PDA) numa concentração de 0,222%.14 De acordo com Abe et al.,9 o conteúdo total de ácido elágico em frutos de M. cauliflora varia de 0,021% a 0,311%. Portanto, a concentração deste marcador fitoquímico no EHJ está de acordo com o conteúdo das frutas.

Animais e preparação das artérias isoladas

Ratos Wistar machos (200-230 g) cedidos pelo biotério central da UFG foram usados neste estudo. Todos os protocolos experimentais foram realizados em conformidade com o Comitê de Ética em Pesquisa Animal da UFG, Goiânia, GO, Brasil (protocolo: 015/2014). Esta investigação está em conformidade com a diretiva da União Europeia para o Cuidado e Uso de Animais de Experimentação (2010/63/UE).

Os ratos foram sacrificados por deslocamento cervical sob anestesia inalatória. A aorta torácica foi isolada, limpa dos tecidos conjuntivos e gordurosos e cortada em anéis (± 4 mm), que foram montados entre dois ganchos de metal, sendo um deles conectado a um transdutor de força para registro da tensão isométrica (DATAQ Instruments, Akron, OH, EUA) e o outro fixo à cuba para órgão isolado. Os anéis foram colocados em câmaras para órgãos isolados contendo solução de Krebs modificada com a seguinte composição (em mM): NaCl 130,0; KCl 4,7; KH2PO4 1,2; CaCl2 1,6; MgSO4 1,2; NaHCO3 14,9; glicose 5,5; em pH 7,4 sob gaseificação com mistura carbogênica (95% O2 e 5% CO2), a 37°C, e mantidas a uma tensão basal de 1 g (tensão de repouso ideal, previamente padronizada em nosso laboratório). Para evitar influência dos fatores derivados do endotélio vascular, as células endoteliais foram removidas mecanicamente pelo atrito da luz do vaso com uma haste fina de metal e a efetividade da remoção foi demonstrada pela ausência de relaxamento à acetilcolina (ACh, 1 µM) em anéis de aorta pré-contraídas com a EC50 da fenilefrina (0,1 µM).

Protocolos experimentais

Após 60 min de estabilização em tensão basal (1 g), as artérias foram pré-contraídas com fenilefrina (0,1 µM) e curvas de efeito de relaxamento-concentração cumulativas foram realizadas para o EHJ (0 a 1,92 mg/mL) e para o verapamil, usado como controle interno (10 nM a 100 µM).

Para verificar as vias celulares responsáveis pelo efeito relaxante do EHJ, anéis de aortas foram pré-contraídos com fenilefrina (0,1 µM) 20 min após a incubação com os seguintes agentes: 1) inibidor da Ca2+ ATPase do retículo sarcoplasmático, ácido ciclopiazônico (CPA, 10 µM); 2) bloqueador não seletivo dos canais de K+, tetraetilamônio (TEA, 1 mM); 3) bloqueador seletivo dos canais de K+ ativados por voltagem (Kv), 4-aminopiridina (4-AP, 1 mM); 4) bloqueador seletivo dos canais de K+ dependentes de ATP (KATP), glibenclamida (3 µM); 5) bloqueador dos canais de K+ ativados pelo Ca2+ (KCa), clotrimazol (5 µM).

Para avaliar a influência do EHJ na contração induzida por agonista adrenérgico contrátil, foram realizadas curvas concentração-efeito para fenilefrina (agonista α1-adrenérgico seletivo, 0,1 nM até 10 µM) na presença (20 min) ou ausência do EHJ na concentração inibitória 50% (CI50, 0,5 mg/mL) ou 100% (CI100, 1,92 mg/mL). O efeito inibitório do bloqueador de canal de Ca2+, verapamil (CI50, 0,3 µM), também foi analisado como controle interno.

Em outra série de experimentos, a ação do EHJ sobre o influxo de Ca2+ estimulado por dois diferentes estímulos foi analisada. Para isto, as preparações foram inicialmente contraídas com solução de KCl (75 mM) para produção da contração máxima de cada preparação (100% de contração) e então enxaguadas com solução de Krebs sem Ca2+ até o relaxamento total. Para esgotamento dos estoques intracelulares de Ca2+, as preparações foram estimuladas para contrair com fenilefrina em solução de Krebs sem Ca2+ até o desaparecimento de qualquer resposta contrátil (aproximadamente 5 ou 6 vezes, por 30-50 min). Após isto, as preparações foram enxaguadas varias vezes com Krebs sem Ca2+ e então incubadas 20 min com EHJ nas concentrações inibitória 50% (CI50, 0,51 mg/mL) ou 100% (CI100, 1,92 mg/mL). O efeito inibitório do bloqueador de canal de Ca2+ verapamil (CI50, 0,3 µM) também foi analisado como controle interno. Após incubação, o estímulo contrátil foi aplicado (fenilefrina 0,1 µM ou KCL 75 mM) e então realizadas curvas concentração-efeito para CaCl2 (0 a 3,0 mM).

Análise estatística

Os resultados de tensão isométrica foram expressos como a média ± erro padrão da média (EPM) de pelo menos cinco experimentos (n = 5-8), obtidos de diferentes animais. Os gráficos foram feitos e analisados pelo programa GraphPad Prism (GraphPad Software Corporation, versão 5.0) por ANOVA mais pós-teste de Bonferroni. Foi adotado nível de significância de 5% (p < 0,05) para que as diferenças sejam consideradas estatisticamente significativas.

Resultados

Efeito relaxante do EHJ em artérias isoladas

O EHJ causou relaxamento em preparações de artérias sem endotélio de modo dependente da concentração, iniciando o relaxamento na concentração de 0,38 mg/mL e alcançando um efeito máximo (Emax) de 98,3% ± 0,4% (n = 6) numa concentração de 1,92 mg/mL (CI100) (Figura 1A). A concentração de EHJ que induziu 50% do relaxamento (CI50) foi de 0,51 mg/mL. Da mesma forma, o verapamil (usado como controle positivo) induziu relaxamento concentração-dependente, com Emax de 99,8% ± 1,8% (n = 5) e CI50 de 0,3 µM.

Figura 1 Curvas concentração-resposta cumulativas do extrato hidroalcoólico de jabuticaba (EHJ) (A) e do verapamil (B) em artérias isoladas sem endotélio. Os pontos representam a média ± EPM do efeito relaxante expressos em % de relaxamento. 

Efeito do EHJ sobre a contração induzida por fenilefrina

O valor de Emax para fenilefrina (142,1% ± 7,1%, n = 6) foi significantemente (p < 0,001) reduzido para 88,7% ± 6,2% (n = 5), 66,1% ± 5,1% (n = 6) e 79,9% ± 5,5% (n = 5) após incubação com a CI50 e a CI100 do EHJ ou verapamil, respectivamente. A adição do EHJ com a CI50 e a CI100 do EHJ ou verapamil significantemente aumentou os valores de pD2 (-log da EC50) da fenilefrina de 6,24 ± 0,09 para 5,35 ± 0,04, 5,14 ± 0,09 e 5,68 ± 0,07, respectivamente (Figura 2).

Figura 2 Efeito do extrato hidroalcoólico de jabuticaba (EHJ) e do verapamil sobre a contração induzida por fenilefrina em artérias isoladas sem endotélio. As curvas concentração-resposta cumulativas foram realizadas em condições controle ou após incubação (20 min) com EHJ (CI50: 0,51 ou CI100: 1,92 mg/mL) ou verapamil (CI50: 0,3 µM). Os pontos representam a média ± EPM do efeito contrátil expresso em % de contração em relação à contração total induzida por KCl (75 mM). Diferença significativa: *** p<0,001 vs. Controle. 

Efeito do EHJ sobre a contração induzida por influxo de Ca2+ em preparações estimuladas com fenilefrina ou KCl

A contração induzida por influxo de Ca2+ estimulada por fenilefrina, a pré-incubação com EHJ (CI50 ou CI100) reduziu significativamente (p < 0,001) os valores de Emax de 106,8% ± 7,5% (n = 5) para 58,8% ± 4,9% (n = 6) e 34,5% ± 3,2% (n = 6), respectivamente. O tratamento com verapamil também reduziu significantemente (p < 0,001) a contração para 7,1% ± 1,1% (n = 5) (Figura 3A).

Como mostrado na Figura 3B, a contração induzida por influxo de Ca2+ estimulada por KCl 75 mM, a pré-incubação com EHJ (CI50 ou CI100) reduziu significativamente (p < 0,001) os valores de Emax de 108,8% ± 4,3% (n = 5) para 63,8% ± 6,1% (n = 6) e 14,6% ± 1,9% (n = 6), respectivamente. O tratamento com verapamil também reduziu significativamente (p < 0,001) a contração para 15,5% ± 1,1% (n = 6).

Figura 3 Efeito do extrato hidroalcoólico de jabuticaba (EHJ) e do verapamil sobre a resposta contrátil em artérias isoladas sem endotélio. As curvas concentração-resposta cumulativas para CaCl2 foram estimuladas por fenilefrina (0,1 µM) (A) ou KCl 75 mM (B) em condições controle ou após incubação (20 min) com EHJ (CI50: 0,51 ou CI100: 1,92 mg/mL) ou verapamil (CI50: 0,3 µM). Os pontos representam a média ± EPM do efeito contrátil expresso em % de contração em relação à contração total induzida por KCl (75 mM). Diferença significativa: *** p < 0,001 vs. Controle. 

Efeito do inibidor da Ca2+ATPase reticular, CPA, e dos bloqueadores de canais de K+ sobre o relaxamento induzido pelo EHJ

O tratamento com CPA não alterou o relaxamento estimulado pelo EHJ (93,8% ± 4,6%, n = 6) em artérias isoladas (Figura 4). Dessa forma, o EHJ não altera a captação interna de Ca2+ pelo retículo sarcoplasmático para induzir o relaxamento vascular.

Figura 4 Efeito relaxante máximo induzido pelo extrato hidroalcoólico de jabuticaba (EHJ) em artérias isoladas pré-contraídas com fenilefrina (0,1 µM) na ausência ou presença (20 min) do inibidor da Ca2+ ATPase reticular, ácido ciclopiazônico (CPA - 10 µM). As barras representam a média ± EPM do efeito relaxante máximo expresso em % de relaxamento. 

Como mostrado na Figura 5, com exceção do clotrimazol (94,1% ± 4,5%, n = 5), os bloqueadores de canais de K+ alteraram o relaxamento induzido pelo EHJ. O relaxamento induzido pelo EHJ (Emax: 98,3% ± 0,4%, n = 6) foi significativamente (p < 0,05) reduzido por TEA (Emax: 87,6% ± 5,7%, n=5), glibenclamida (Emax: 61,6% ± 5,8%, n=6) e 4-AP (Emax: 81,6% ± 5,9%, n=5). Os resultados mostram que o relaxamento induzido pelo EHJ depende do efluxo de íons K+ através da membrana.

Figura 5 Efeitos dos bloqueadores de canais de K+ sobre o relaxamento induzido pelo extrato hidroalcoólico de jabuticaba (EHJ) em artérias isoladas pré-contraídas com fenilefrina (0,1 µM) na ausência ou presença (20 min) dos bloqueadores tetraetilamônio (TEA, 1 mM), glibenclamida (Glib, 3 µM), clotrimazol (5 µM) e 4-aminopiridina (4-AP, 1 mM). Os pontos representam a média ± EPM do efeito relaxante expresso em % de relaxamento. Diferença significativa: *p < 0,05; *** p < 0,001 vs. Controle. 

Discussão

O maior achado deste trabalho é que o EHJ, além de apresentar efeito hipotensor e induzir relaxamento vascular por via do óxido nítrico endotelial, como já mostrado por nós anteriormente,14 age diretamente sobre o MLV e leva ao relaxamento independente do endotélio. Dessa forma, fica claro que a jabuticaba exerce efeitos cardiovasculares através de múltiplas vias dependentes e independentes do endotélio vascular. Cabe notar que a concentração do EHJ capaz de induzir 100% de relaxamento vascular por via endotelial é aproximadamente 16 vezes menor (0,12 mg/mL)14 que a concentração necessária para induzir 100% de relaxamento agindo diretamente sobre o MLV (1,92 mg/mL).

A contração e o relaxamento dos vasos sanguíneos em resposta às demandas fisiológicas são controlados por mudanças na concentração de Ca2+ intracelular do MLV. O Ca2+ usado para contração inclui fontes intracelulares, extracelulares ou ambas. O retículo sarcoplasmático é a principal fonte de Ca2+ intracelular.16 Nossos experimentos demonstram que o EHJ não altera a captação de Ca2+ pelo retículo sarcoplasmático, uma vez que seu inibidor seletivo CPA não alterou o perfil do relaxamento.

Canais de Ca2+ voltagem-dependente (CCVD), também conhecidos como canais de Ca2+ do tipo L, e os canais de Ca2+ operados por receptor (CCOR) localizados na membrana plasmática das células do MLV desempenham um papel fundamental no controle do influxo de Ca2+.17,18 A contração induzida pela fenilefrina é mediada por aumento no influxo de Ca2+ via CCDV e CCOR.19,20 Porém, a contração induzida pela despolarização de membrana, como ocorre em altas concentrações de KCl, ativa preferencialmente CCVD.21 Os presentes resultados mostram que o tratamento das artérias com EHJ inibe a contração vascular induzida pelo estimulo adrenérgico com fenilefrina, o que sugere que o EHJ bloqueia o influxo de Ca2+ por interferir com CCVD e/ou CCOR.

Na tentativa de esclarecer o mecanismo celular pelo qual EHJ induz o relaxamento vascular, experimentos foram feitos em solução sem Ca2+. Foram usados dois estímulos diferentes para induzir o influxo de Ca2+, fenilefrina e KCl (75 mM). O EHJ, assim como o verapamil, usado como controle positivo, inibiu a contração induzida pelo influxo de Ca2+ mediado por ambos os estímulos. Como a despolarização de membrana com altas concentrações de K+ ativa especificamente CCDV, sugerimos que o EHJ direta ou indiretamente atue bloqueando o influxo de Ca2+ através da membrana plasmática, agindo preferencialmente no CCVD.

Produtos naturais têm constantemente demonstrado o envolvimento de canais de K+ no seu mecanismo de vasodilatação.22 Vários tipos de canais de K+ estão presentes no MLV, incluindo canais de K+ sensíveis ao ATP (KATP), canais de K+ ativados por Ca2+ (Kca) e dependentes da voltagem (Kv).23,24 Esses canais podem ser bloqueados por glibenclamida, clotrimazol e 4-AP, respectivamente.24,25 O TEA é um bloqueador não seletivo desses canais. Quando são ativados, esses canais permitem o efluxo de K+, hiperpolarizando a membrana plasmática do MLV. Isso reduz o influxo de Ca2+ atravéz dos CCVD e induz vasodilatação.26,27 O presente estudo mostra que o relaxamento induzido pelo EHJ em artérias sem endotélio é prejudicado após o bloqueio dos canais de K+. Exceto o clotrimazol, os outros bloqueadores prejudicaram o relaxamento vascular, o que permite relacionar sua ativação ao efeito do EHJ.

Nossos resultados apontam um novo efeito biológico da jabuticaba, espécie nativa do Brasil e que apresenta importantes efeitos biológicos já relatados sobre o sistema cardiovascular como hipoglicemiante,12 antilipidêmico13 e hipotensor.14 Portanto, os efeitos biológicos induzidos pela jabuticaba mostrados em nosso trabalho contribuirão para o conhecimento sobre compostos derivados dessa espécie e seu uso como planta medicinal ou alimento funcional aliado à prevenção de problemas cardiovasculares.

Conclusão

O presente estudo demonstra que o EHJ induz vasodilatação de forma independente do endotélio vascular. As principais vias celulares utilizadas pelo EHJ para causar o relaxamento vascular são a inibição do influxo de Ca2+ através da membrana plasmática além da ativação de canais de K+ das células do MLV.

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