Efeitos anti-inflamatórios do oxigênio hiperbárico sobre tecidos laríngeos irradiados
Efeitos anti-inflamatórios do oxigênio hiperbárico sobre tecidos laríngeos irradiados
Autores:
ARTIGO ORIGINAL
Brazilian Journal of Otorhinolaryngology
versão impressa ISSN 1808-8694versão On-line ISSN 1808-8686
Braz. j. otorhinolaryngol. vol.84 no.2 São Paulo mar./abr. 2018
http://dx.doi.org/10.1016/j.bjorl.2017.02.001
Introdução
Neoplasias de cabeça e pescoço são os tipos mais frequentes de câncer em todo o mundo. Em estudos epidemiológicos, eles são classificados em 10° lugar globalmente e sua incidência aumentou consideravelmente nos últimos 10 anos. O tratamento do câncer de cabeça e pescoço é complexo e requer uma abordagem multidisciplinar.1 A radioterapia é usada como uma opção de tratamento primário ou adjuvante para essas condições neoplásicas. A irradiação da região do pescoço pode ser feita na presença de metástases em linfonodos cervicais da laringe, ou neoplasias de qualquer outra região, ou nas diversas fases do câncer de laringe.2 Além da natureza terapêutica, a radioterapia tem efeitos danosos definidos sobre os tecidos circundantes e esses efeitos podem ocorrer nas fases iniciais ou tardias. A boca seca, a mucosite, a radionecrose de tecidos moles (RNTM), a osteorradionecrose (ORN) e a radionecrose laríngea (RNL) são alguns dos exemplos desses efeitos colaterais. 2,3
A radiação causa a liberação de mediadores inflamatórios, marca o início do processo inflamatório, e esses resultam em um aumento da atividade oxidante nos tecidos danificados.4 A radiação não somente provoca danos nos tecidos através das espécies reativas de oxigênio (ROS) e da ionização, mas também através da via da caspase e ativação dos citocromos e, como resultado, a necrose se desenvolve nos tecidos danificados por isquemia e apoptose. 5,6 A célula tenta combater esse efeito prejudicial ao ativar seu sistema de defesa (citocinas anti-inflamatórias, atividade antioxidante).7
Recentemente, vários estudos científicos sobre o manejo dos efeitos colaterais da radioterapia foram feitos e antioxidantes fitoterápicos, vários agentes químicos, vitaminas, moléculas antioxidantes exógenas e oxigênio hiperbárico (HBO2) foram usados nesses estudos. 6,8-11 O HBO2 tem sido amplamente usado para o tratamento de várias doenças durante décadas. O tratamento de feridas diabéticas, necrose de retalho e perda auditiva súbita é um dos exemplos mais significativos. 12-14
No presente estudo, métodos bioquímicos e histopatológicos foram usados para investigar a eficácia do oxigênio hiperbárico contra os efeitos inflamatórios iniciais da radioterapia no tecido laríngeo quando radioterapia e HBO2 são administrados no mesmo dia.
Método
Esse estudo foi revisado e aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais e o Comitê de Ética local. O número de ratos em cada grupo foi restringido pelo comitê de ética.
Desenho experimental
Foram divididos em quatro grupos 32 ratos albinos Wistar. O grupo de controle (n = 8) não recebeu tratamento durante o período de estudo. O grupo de tratamento com HBO2 (HBO2) (n = 8) recebeu apenas HBO2 durante o estudo. O grupo de radioterapia (RT) (n = 8) recebeu apenas RT durante o estudo. O grupo RT mais HBO2 (RT + HBO2) (n = 8) recebeu RT e HBO2 no mesmo dia.
Animais
Ratos albinos Wistar (fêmeas, 230 ± 20 g) foram alojados em condições normais (20 ± 1 °C de temperatura ambiente, 60 ± 10% de umidade e um ciclo de luz/escuro de 12/12 h) em gaiolas regulares e com acesso livre a alimentos e água. Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelo US Public Health Service.
Irradiação da região do pescoço
A radioterapia foi aplicada sob anestesia geral com 10 mg/kg de cetamina e 8 mg/kg de xilazina por via intraperitoneal (i.p.) para imobilizar os ratos antes da exposição à radiação. Os animais foram colocados sobre uma placa de plexiglass e estabilizados na posição supina. A região cervical de cada rato foi definida por simulação e irradiada com 2 Gray (Gy) por minuto, para uma dose total de 18 Gy com feixes de fótons de 6MV (acelerador linear, Siemens, Primus). Usou-se a técnica "distância fonte eixo" e a distância entre o centro da fonte e a laringe foi de 100 cm. Um bolus de 10 mm foi aplicado acima do pescoço para compensar a profundidade da dose. Cada rato foi exposto a uma única dose de radiação. Os animais foram devolvidos às suas gaiolas originais após a irradiação.
Tratamento com HBO2
Os animais foram tratados com HBO2 na sala de pressão dos animais de pesquisa na Unidade de Cuidados e Investigação Animal. Os ratos receberam HBO2 uma vez por dia, seis dias por semana, durante quatro semanas. Os ratos foram levados para a sala de pressão dentro de suas gaiolas e, após ventilação com oxigênio a 100%, a pressão da cabine foi regulada para 2,4 atmosferas absolutas durante 10 minutos. A ventilação foi fornecida em intervalos durante todos os 90 minutos de tratamento. A saída da sala de pressão levou 10 minutos. Os ratos no grupo RT + HBO2 iniciaram o tratamento com HBO2 antes da radioterapia, no mesmo dia em que a RT foi administrada.
Protocolo de eutanásia
Quatro semanas após a administração de RT, todos os ratos foram colocados sob anestesia geral com 10 mg/kg de cetamina e 8 mg/kg de xilazina i.p. Os corações dos ratos foram perfurados e o sangue retirado. Posteriormente, foram imediatamente decapitados e seus tecidos laríngeos removidos cirurgicamente.
Avaliação histopatológica e imuno-histoquímica
Fez-se fixação tecidual em formaldeído a 10% por 24 horas e, em seguida, os tecidos foram incorporados a blocos de parafina. Os tecidos processados foram então cortados com um micrótomo. Cortes transversais de 5 mícrons de espessura de todos os blocos foram colocados sobre lâminas revestidas com lisina. Um corte transversal de cada bloco foi separado para coloração com hematoxilina e eosina (H + E); uma corte transversal foi corado com o método de coloração imuno-histoquímica para mostrar a presença do anticorpo CD45 (Leukocyte Common Antigen - LCA). Usou-se o kit Thermo AntiLCA policlonal (PA5-23528, EUA) para demonstrar a presença de LCA. Todas as preparações foram analisadas com um microscópio óptico Olympus BX51 pelo mesmo patologista cegado para esses grupos. Uma avaliação geral da cartilagem foi feita com coloração H + E e o nível de inflamação foi avaliado com coloração imuno-histoquímica para LCA.
Os níveis de inflamação e metaplasia foram calculados como a seguir: 0 - sem inflamação, 1 - inflamação leve, 2 - inflamação moderada, 3 - inflamação grave, 0 - sem metaplasia, 1 - com metaplasia.
Avaliação bioquímica
Foi feita a medida de citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias e os valores de oxidantes no plasma dos ratos foram determinados. As amostras de sangue foram transferidas para tubos com K3-EDTA e centrifugadas a 1000 g durante 10 minutos a +4° C. As amostras de plasma foram separadas e armazenadas a 0 °C. As amostras de plasma foram posteriormente descongeladas para uso. Os níveis de TNF-α (Biolegend, San Diego, Califórnia, EUA), IL1-β e IL-10 (Boster Biological Technology, Califórnia, EUA) foram medidos em amostras homogeneizadas por ensaio imunoenzimático (Elisa) com kits comerciais, como recomendado pelos fabricantes.
Análise estatística
Os dados foram analisados com o programa de software SPSS 23.0 (EUA). Para comparação entre os grupos, usou-se a análise de variância de Kruskal-Wallis. Para determinar as diferenças significativas entre os grupos, usou-se o teste U de Mann-Whitney com correção de Bonferroni. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados
Achados histopatológicos e imuno-histoquímicos
As variações histopatológicas e suas distribuições nos espécimes em todos os grupos são mostradas na tabela 1 e na figura 1. A inflamação e a metaplasia observadas no tecido laríngeo não foram estatisticamente significativas entre os grupos controle e HBO2 (p > 0,05). A taxa de inflamação e metaplasia no tecido cartilaginoso foi significativamente maior no grupo RT, comparado com os grupos controle, HBO2 e RT + HBO2 (p < 0,05). O tecido cartilaginoso dos ratos no grupo RT + HBO2 apresentou uma taxa significativamente mais elevada de inflamação e nível de metaplasia escamosa do que os grupos controle e HBO2.
Tabela 1 Metaplasia escamosa e níveis de inflamação dos grupos de ratos
| Alterações histopatológicas | Controle (n = 8) | HBO2 (n = 8) | RT (n = 8) | RT + HBO2 (n = 8) |
|---|---|---|---|---|
| Metaplasia escamosa | ||||
| Metaplasia + | 0 | 0 | 7 | 2 |
| Metaplasia - | 8 | 8 | 1 | 6 |
| Inflamação | ||||
| Sem inflamação | 8 | 7 | 0 | 0 |
| Inflamação leve | 0 | 1 | 1 | 4 |
| Inflamação moderada | 0 | 0 | 3 | 3 |
| Inflamação grave | 0 | 0 | 4 | 1 |
Figura 1 Fotomicrografias representativas da histologia da cartilagem nos grupos de controle, HBO2, RT e RT + HBO2. Grupo de controle: A, aparência geral da coloração H&E (×20); B, LCA na imuno-histoquímica (×20). Grupo RT: C, H&E (×100), seta negra: metaplasia escamosa; seta azul: epitélio colunar. D, LCA na imuno-histoquímica (×40), seta amarela: linfócitos LCA positivos. Grupo HBO2: E, H&E (×20) aparência geral; F, LCA na imuno-histoquímica (×20). Grupo RT + HBO2: G, H&E (×100), seta negra: metaplasia escamosa; seta azul: epitélio colunar; H, LCA na imuno-histoquímica (×100); linfócitos LCA positivos.
Achados bioquímicos
Os resultados dos parâmetros bioquímicos de todos os grupos são apresentados na tabela 2. Não houve diferenças estatisticamente significativas nos valores de TNF-α, IL1-β e IL-10 entre os grupos controle e HBO2 (p > 0,05). Os valores de TNF-α e IL1-β foram significativamente mais elevados no grupo RT quando comparado com o grupo controle (p < 0,05), enquanto IL-10 foi maior no grupo controle (p < 0,05). Os valores de TNF-α e IL1-β foram significativamente maiores no grupo RT do que no grupo RT + HBO2 (p < 0,05), enquanto IL-10 foi maior no grupo RT + HBO2 (p < 0,05). Os valores de IL1-β foram significativamente maiores no grupo RT + HBO2 do que no grupo HBO2 (p < 0,05), enquanto que IL-10 foi maior no grupo HBO2 (p < 0,05). Não houve diferença significativa nos valores de TNF-α entre esses dois grupos (p > 0,05). TNF-α e IL1-β foram significativamente maiores no grupo RT + HBO2 do que no grupo controle (p < 0,05). Não houve diferença estatisticamente significativa nos valores de IL-10 entre esses dois grupos (p > 0,05) (tabela 2 e tabela 3).
Tabela 2 Valores de citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias dos grupos
| Grupos | IL-1 β (Média/DP) pg/mL pg/ml | IL-10 (Média/DP) pg/mL pg/ml | TNF-α (Média/DP) pg/mL pg/ml |
|---|---|---|---|
| Controle | 22 ± 2,06 | 42 ± 6,8 | 17 ± 2,27 |
| HBO2 | 23 ± 2,69 | 43 ± 6,7 | 19 ± 3,46 |
| RT | 55 ± 6,89 | 21 ± 1,89 | 31 ± 3,58 |
| RT + HBO2 | 44 ± 2,85 | 32 ± 5,99 | 24 ± 2,62 |
DP, desvio padrão.
Tabela 3 p-valores que mostram comparações entre os grupos importantes
| Comparação de grupo | Controle vs. HBO2 p-valor | Controle vs. RT p-valor | Controle vs. RT + HBO2 p-valor | RT vs. RT + HBO2 p-valor | HBO2 vs. RT p-valor | HBO2 vs. RT + HBO2 p-valor |
|---|---|---|---|---|---|---|
| IL-1β | 0,462 | 0,006a | 0,006a | 0,03a | 0,03a | 0,006a |
| TNF-α | 0,093 | 0,006a | 0,006a | 0,012a | 0,006a | 0,21 |
| IL-10 | 0,754 | 0,006a | 0,116 | 0,006a | 0,006a | 0,036a |
aValores estatisticamente significantes.
Discussão
Os sinais e sintomas após a conclusão do tratamento com RT são descritos como iniciais se ocorrem nos primeiros três meses e tardios se ocorrem após os primeiros seis meses. Os efeitos iniciais e tardios da RT no tecido normal são diferentes no que se refere à fisiopatologia e apresentação clínica. As alterações relacionadas com os efeitos iniciais da RT são um resultado do aumento da morte celular por lesão ao DNA ou formação de ROS, enquanto que as alterações tardias relacionadas à RT são o resultado de lesão vascular e fibrose. Essas alterações são geralmente progressivas. 15-17 Em neoplasias de cabeça e pescoço, a radioterapia é administrada em doses mais baixas e sessões repetidas. O objetivo da administração de uma dose única elevada de radioterapia em nosso estudo foi induzir com sucesso a lesão por radiação e a dose de radiação que administramos foi decidida considerando estudos anteriores semelhantes.7 Em nosso estudo, o tratamento com HBO2 foi iniciado no mesmo dia que a radioterapia, porque o tratamento com HBO2 foi dado para exercer um efeito protetor, não para o tratamento do tecido danificado.
HBO2 é geralmente usado para tratar os efeitos tardios da radiação após a radioterapia. Narozny et al.18 relataram que de 548 pacientes que receberam RT para tratar neoplasias de cabeça e pescoço, condroradionecrose de grau 3 e 4 desenvolveram-se em seis pacientes e todos tiveram remissão de sintomas após tratamento convencional seguido de HBO2. Em outra revisão retrospectiva, foi relatado que nenhum dos cinco pacientes com condroradionecrose tratados com HBO2 necessitou de laringectomia e dois dos quatro pacientes desse grupo que eram dependentes de traqueotomia foram decanulados.16 Filntisis et al.17 administraram tratamento adjuvante com HBO2 em 18 pacientes com radionecrose de grau 3 e 4 e 13 (72,2%) desses pacientes apresentaram maior recuperação após tratamento com HBO2; cinco (27,8%) pacientes necessitaram de laringectomia total devido ao insucesso do tratamento. Filntisis relatou que o tratamento com HBO2 é uma maneira segura e fácil de usar tratamento adjuvante na radionecrose da laringe resistente aos tratamentos conservadores. Além disso, em um estudo de Roh et al.,19 de seis pacientes diagnosticados com condroradionecrose e tratados com desbridamento inicial e HBO2, a recuperação foi observada em cinco pacientes, enquanto que um paciente teve de ser submetido à laringectomia total devido ao insucesso do tratamento. Em um estudo de Niezgoda et al.20 HBO2 foi usado no tratamento de várias lesões teciduais causadas por radiação e a recuperação foi obtida em casos de laringoradionecrose combinada com várias outras lesões teciduais.
Em todos os estudos acima mencionados, HBO2 foi administrado como tratamento após a lesão ter ocorrido, o que envolvia principalmente lesões tardias por radiação. Em nosso estudo, HBO2 foi usado ao mesmo tempo em que a radioterapia, para determinar os seus efeitos sobre a inflamação do tecido e a proteção do tecido contra a inflamação. Consequentemente, o uso de HBO2 reduziu consideravelmente a inflamação. Quando os ratos foram decapitados na quarta semana, a inflamação que ocorreu devido à radioterapia foi um efeito inicial e até certo ponto o HBO2 tinha suprimido a inflamação que poderia causar lesões nos tecidos. São necessários seis meses para que os efeitos tardios sejam observados.
Estudos têm pesquisado o efeito anti-inflamatório de HBO2. Em um estudo de Chen et al.,21 a artéria cerebelar média dos ratos foi ocluída, tornou o cérebro hipóxico. HBO2 foi usado no tratamento e foi demonstrado que houve diminuição das citocinas inflamatórias e aumento da atividade antioxidante. Em nosso estudo, HBO2 diminuiu as citocinas inflamatórias e inflamação do tecido, mas aumentou a citocina anti-inflamatória. Em outro estudo, a lesão do cólon foi induzida em ratos pela administração de dextrano sulfato de sódio e, em seguida, HBO2 foi aplicado.22 HBO2 reduziu as citocinas pró-inflamatórias e suprimiu a inflamação. Arslan et al.23 induziram um trauma acústico, tratado com dexametasona e HBO2, e então compararam esses dois agentes em seu estudo. Eles relataram que quando HBO2 é aplicado, especialmente nas primeiras 24 horas, pode ser tão eficaz quanto a dexametasona como agente anti-inflamatório. O efeito anti-inflamatório de HBO2 é um fator comum nesses estudos e seus resultados são semelhantes aos nossos.
Nosso estudo tem algumas limitações. Em primeiro lugar, o efeito anti-inflamatório do HBO2 foi avaliado no início do período após a lesão por radiação, mas esse efeito anti-inflamatório sobre os efeitos tardios da radiação, tais como necrose de tecido mole, não foi avaliado. Além disso, o efeito anti-inflamatório de HBO2 sobre os efeitos antitumorais da radioterapia não é conhecido. A outra limitação é que os efeitos das múltiplas doses de baixa radiação não puderam ser previstos porque uma única e grande dose foi usada nesse estudo.
Conclusão
HBO2 desempenha um papel anti-inflamatório no período inicial após a lesão causada pela radioterapia no tecido quando administrado no mesmo dia que a radioterapia. São necessários mais estudos para demonstrar os efeitos tardios quando os dois agentes são administrados no mesmo dia, bem como os efeitos no tecido tumoral.
Considerações éticas
O estudo foi conduzido no Experimental Animals Research and Application Center da Faculdade de Medicina. A aprovação do conselho ético foi obtida (número 2015-008).