versão impressa ISSN 0066-782Xversão On-line ISSN 1678-4170
Arq. Bras. Cardiol. vol.111 no.4 São Paulo out. 2018 Epub 21-Set-2018
https://doi.org/10.5935/abc.20180163
A reestenose após intervenção coronária percutânea (ICP) após doença coronariana continua um problema não solucionado. Estudos relataram que os níveis de clusterina (CLU), também chamada de apolipoproteína (Apo) J, encontram-se elevados na progressão da reestenose pós-angioplastia e na aterosclerose. Contudo, seu papel na hihperplasia neointimal ainda é controverso.
Elucidar o papel da Apo J na hiperplasia neointimal na artéria carótida utilizando um modelo experimental com ratos in vivo, com e sem intervenção com rosuvastatina.
ratos Wistar machos foram divididos aleatoriamente em três grupos - grupo controle (n = 20), grupo modelo (n = 20), e grupo intervenção com estatina (n = 32). Os ratos no grupo intervenção receberam 10 mg/kg de rosuvastatina. Um cateter Fogarty 2 F foi introduzido para induzir lesão vascular. A formação de neoíntima foi analisada 1, 2, 3 e 4 semanas após lesão com balão. Concentrações de Apo J foram medidas por PCR em tempo real, imuno-histoquímica e western blotting.
A razão área íntima/média (I/M) aumentou após a lesão com balão e atingiu o valor máximo 4 semanas pós-lesão no grupo modelo; observou-se um pequeno aumento na I/M na semana 2, que cessou após a administração de rosuvastatina. Os níveis de mRNA e proteína da Apo J nas artérias carótidas aumentaram significativamente após administração de rosuvastatina em comparação ao grupo modelo, atingindo o máximo na semana 2, mais cedo em comparação ao grupo modelo (semana 3).
A Apo J atuou como reagente de fase aguda após lesão com balão nas artérias carótidas de ratos. A rosuvastatina pode reduzir a formação de neoíntoma por aumento de Apo J. Nossos resultados sugerem que a Apo J exerce um papel protetor na reestenose após lesão com balão em ratos.
Palavras-chave: Doença da Artéria Coronária; Intervenção Coronária Percutânea; Rosuvastatina Cálcica; Apolipoproteína J; Reestenose Coronária; Ratos
Restenosis after percutaneous coronary intervention in coronary heart disease remains an unsolved problem. Clusterin (CLU) (or Apolipoprotein [Apo] J) levels have been reported to be elevated during the progression of postangioplasty restenosis and atherosclerosis. However, its role in neointimal hyperplasia is still controversial.
To elucidate the role Apo J in neointimal hyperplasia in a rat carotid artery model in vivo with or without rosuvastatin administration.
Male Wistar rats were randomly divided into three groups: the control group (n = 20), the model group (n = 20) and the statin intervention group (n = 32). The rats in the intervention group were given 10mg /kg dose of rosuvastatin. A 2F Fogarty catheter was introduced to induce vascular injury. Neointima formation was analyzed 1, 2, 3 and 4 weeks after balloon injury. The level of Apo J was measured by real-time PCR, immunohistochemistry and western blotting.
Intimal/medial area ratio (intimal/medial, I/M) was increased after balloon-injury and reached the maximum value at 4weeks in the model group; I/M was slightly increased at 2 weeks and stopped increasing after rosuvastatin administration. The mRNA and protein levels of Apo J in carotid arteries were significantly upregulated after rosuvastatin administration as compared with the model group, and reached maximum values at 2 weeks, which was earlier than in the model group (3 weeks).
Apo J served as an acute phase reactant after balloon injury in rat carotid arteries. Rosuvastatin may reduce the neointima formation through up-regulation of Apo J. Our results suggest that Apo J exerts a protective role in the restenosis after balloon-injury in rats.
Keywords: Coronary Artery Dsease; Percutaneous Coronary Intervention; Rosuvastatin Calcium; Apolipoprotein J; Coronary Reestenosis; Rats
A doença coronária é uma das doenças cardiovasculares mais comuns, com alta morbidade e mortalidade. As principais técnicas consideradas eficazes para revascularização do miocárdio são a intervenção coronária percutânea (ICP) e a cirurgia de bypass coronário. A angioplastia coronária transluminal percutânea (ACTP) é um método eficaz para o tratamento da doença coronária, mas seu efeito em longo prazo é influenciado por uma alta taxa de reestenose. Apesar de stents farmacológicos, combinados à terapia antiplaquetária dupla, reduzirem a ocorrência de reestenose, a taxa de incidência ainda excede 10%.1,2 O mecanismo da reestenose após a IPC tem sido amplamente estudado em todo o mundo, porém, alvos moleculares ou celulares eficazes para o tratamento da reestenose após ICP precisam ser identificados urgentemente.
A clusterina (CLU), ou apolipoproteína (Apo) J, é uma glicoproteína heterodimérica composta por subunidades α e β, ligadas por uma ponte dissulfeto.3,4 O gene que codifica a Apo J está localizado no cromossomo 8p21-p12, e codifica duas principais isoformas - CLU secretória (CLUs) e CLU nuclear (CLUn).5 Estudos prévios relataram que a Apo J é induzida durante a progressão da reestenose pós-angioplastia e da aterosclerose.6-9 No entanto, o papel da Apo J na hiperplasia neointimal é ainda controverso. Há estudos relatando que a Apo J pode estimular a proliferação e a migração de células do músculo liso vascular (CMLV) em ratos knockouts para CLU inibindo a expressão de p53 e p21, e promover reestenose.10,11 Por outro lado, Kim et al.12 revelaram que a superexpressão de CLUs pode inibir a migração e a proliferação de CMLV e inibir a apoptose celular. Em vista dos resultados controversos, nosso objetivo foi elucidar o papel da Apo J na hiperplasia neointimal, usando a artéria carótida de ratos in vivo, com ou sem administração de rosuvastatina.
Ratos Wistar machos pesando 350-400g foram divididos aleatoriamente em três grupos - grupo controle (n = 20), grupo modelo (n = 20) e grupo intervenção (estatina) (n = 32). Os ratos de todos os grupos foram então divididos aleatoriamente em 4 grupos conforme momento de avaliação após lesão induzida com balão -1, 2 3 ou 4 semanas. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética do hospital de tórax Tianjin.
Os ratos foram pesados no dia da cirurgia e divididos aleatoriamente em três grupos. No grupo intervenção, os ratos receberam 10mg/kg de rosuvastatina. Um cateter de Fogarty 2F foi introduzido para induzir lesão vascular como descrito anteriormente.13 Em resumo, os ratos foram anestesiados após injeção intraperitoneal de hidrato de cloral 10% na dose 0,3 mL/100 g de peso corporal. Um cateter balão 2F foi inserido na artéria carótida, saída para a aorta. O balão foi então inflado, desinflado, e puxado para trás três vezes para expor o endotélio.
Após 1, 2, 3 ou 4 semanas, os ratos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de hidrato de cloral 10% na dose 0,3 mL/100 g de peso corporal e sacrificados administrando-se 2-3mL de solução de cloreto de potássio via veia subclávia. A artéria carótida direita foi removida; 0,3 cm foi fixada em formalina neutra a 10% para análise patológica, e a outra parte imediatamente congelada em nitrogênio líquido e armazenado a -80ºC para análise futura.
As amostras do vaso foram fixadas em solução de formaldeído por 3-4 horas. Foram realizadas hidratação e inclusão em parafina de rotina. As seções foram cortadas uniformemente em uma espessura de 4 µm. A lesão dos vasos sanguíneos foi analisada em microscópio.
Os níveis de Apo J foram avaliadas por IHQ na artéria carótida do rato. O anticorpo primário (IgG de coelho anti-Apo J humano) foi comprado da empresa Santa Cruz, Inc. (número no catálogo sc-8354). O anticorpo secundário (anticorpo produzido em cabra anti IgG de rato/coelho) foi adquirido da empresa Maixin BioTech (Fuzhou, China). Todas as fotos foram capturadas e salvas usando o sistema ISCapture, e a coleta e análise de dados realizadas pelo programa de processamento de imagens Image Pro Plus 6.
Amostras de sangue venoso foram coletadas e centrifugadas a 3000r/min. O sobrenadante foi coletado usando uma micropipeta e armazenado em geladeira a -20ºC. As amostras foram então descongeladas à temperatura ambiente para serem submetidas ao ELISA, o qual foi realizado usando um kit comercial (Rat Competitive ELISA for Apolipoprotein J A 252 SC) seguindo instruções do fabricante.
Os níveis de mRNA da Apo J foram detectadas por PCR em tempo real na artéria carótida do rato. O RNA foi extraído pelo método de extração em fase única com reagente Trizol, e realizada transcrição reversa. Os primers usados para amplificação da Apo J foram: forward, TAA GGA GAT TCA GAA CGC CG; reverse, ATC CCT GGT GTC ATC TAG AG. Os primers para o controle GAPDH foram: forward, GTG ATG CTG GTG CCG AGT AG; reverse, GGT GGC AGT GAT GGC GTG C. As reações de PCR em tempo real foram preparadas seguindo as instruções do sistema SYBR® Premix Ex Taq™ (Perfect Real Time). Os níveis de mRNA em cada amostra foram calculados como 2-ΔΔCt.
As proteínas foram extraídas de 30mg da artéria carótida de ratos. Em resumo, as proteínas foram separadas por SDS-PAGE com gel de separação a 10% e gel concentrado a 5%. Em seguida, as proteínas separadas foram transferidas para membranas PVDF (fluoreto de polivinilideno). As membranas foram bloqueadas e incubadas com anticorpos. Níveis relativos de Apo J foram analisados pelo programa de análise Image Lab. Beta-actina foi usada como controle. As bandas foram quantificadas pelo programa QUANTITY ONE (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA).
A análise estatística foi realizada usando o programa SPSS 20.0. Dados quantitativos foram expressados por média ± desvio padrão (DP). Diferenças entre os dois grupos foram comparadas pelo teste t para amostras independentes. Comparações entre três grupos foram analisadas pela análise de variância simples (one-way ANOVA). Um p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Entre os 52 ratos do grupo modelo e do grupo intervenção, 2 ratos morreram durante a operação por asfixia, e 2 morreram por hemorragia arterial 12 horas após operação. Portanto, 47 ratos sobreviveram, com uma taxa de sobrevida aproximada de 90%. O exame patológico mostrou hiperplasia e espessamento da camada íntima no grupo experimental, sugerindo que o modelo foi construído com sucesso. O tempo médio de operação foi de 34,19 ± 6,09 min. A taxa de viabilidade e de sucesso do modelo deste modelo pode ter alta reprodutibilidade se os procedimentos cirúrgicos forem realizados adequadamente.
Não houve diferença significativa nos níveis séricos de Apo J antes e após a operação no grupo intervenção (Tabela 1). Não houve diferença significativa nos níveis séricos de Apo J na 1ª, 2ª, 3ª ou 4ª semana antes (F= 1,002, p = 0,408) ou após (F= 0,189, p = 0,903) o procedimento.
Time points | Pré-operação | Pós-operação | t* | p# | ||
---|---|---|---|---|---|---|
n | Apo J | n | Apo J | |||
1 | 7 | 13,498±3,015 | 7 | 10,317±3,567 | 1,802 | 0,097 |
2 | 7 | 14,062±4,538 | 7 | 11,516±1,762 | 1,383 | 0,192 |
3 | 8 | 11,234±2,740 | 8 | 11,117±3,104 | 0,08 | 0,937 |
4 | 8 | 14,143±4,609 | 8 | 11,205±3,579 | 1,424 | 0,176 |
F$ | 1,002 | 0,189 | ||||
P# | 0,408 | 0,903 |
*teste t para comparar diferença entre os dois grupos.
$valor F calculado usando análise de variância simples (one-way ANOVA) para comparar a diferença entre os quatro grupos.
#p < 0.05 considerado estatisticamente significativo.
Os resultados da avaliação patológica mostraram que não foi houve hiperplasia intimal no grupo controle (Figura 1). No grupo modelo e no grupo intervenção, a camada íntima estava ligeiramente espessada 1 semana após a operação, e ainda mais espessada 2 semanas após a operação. Durante 3 semanas após o procedimento, o grau de hiperplasia intimal aumentou no grupo modelo; no entanto, essa mudança não foi tão marcante como a observada na semana 2 após a operação, e as células tornaram-se paralelas gradualmente. Durante 4 semanas após a operação, o grau de hiperplasia intimal agravou-se no grupo modelo, mas não foram observadas mudanças significativas quanto ao grau de hiperplasia intimal em comparação à semana 3 (Figura 2 e 3).
As áreas da membrana íntima e média foram medidas usando o Image Pro Plus 6, e a razão área íntima/média (íntima/média, I/M) foi usada para indicar o grau de hiperplasia intimal. Como mostrado na Tabela 2, a I/M foi próxima a 0 no grupo controle e foi significativamente diferente da I/M no grupo modelo e no grupo intervenção em todos os tempos (1, 2, 3 e 4 semanas). Não houve diferenças significativas da I/M entre os diferentes tempos no grupo modelo, e a I/M alcançou o valor máximo na quarta semana. Não foi observada diferença de I/M no grupo intervenção entre as semanas 2, 3 e 4 pós-cirurgia no grupo intervenção, e I/M no grupo intervenção foi significativamente mais baixa que aquela no grupo modelo (Tabela 2). Nossos resultados, como um todo, sugerem que a intervenção com rosuvastatina poderia inibir de maneira significativa a hiperplasia intimal em ratos.
Tempos | Grupo controle | Grupo modelo | Grupo intervenção | t* | p# | |||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
n | I/M | n | I/M | n | I/M | |||
1 | 5 | 0,04 ± 0,07 | 5 | 0,63 ± 0,40γ | 5 | 0,42 ± 0,04γ | 10,066 | < 0,001 |
2 | 5 | 0,01 ± 0,02 | 4 | 1,08 ± 0,29▲ | 4 | 1,29 ± 0,31∆▲ | 39,639 | < 0,001 |
3 | 5 | 0,03 ± 0,03 | 4 | 1,81 ± 0,11aβ | 4 | 1,47 ± 0,54∆β | 37,142 | < 0,001 |
4 | 5 | 0,05 ± 0,04 | 4 | 2,61 ± 1,12abθ | 4 | 1,50 ± 0,26∆θc | 20,287 | < 0,001 |
F$ | 0,741 | 9,432 | 21,393 | |||||
P# | 0,543 | < 0,001 | < 0,001 |
*teste t para comparar diferença entre os dois grupos.
$valor F calculado usando análise de variância simples (one-way ANOVA) para comparar a diferença entre os quatro grupos.
#p < 0.05 considerado estatisticamente significativo.
Os níveis de mRNA de Apo J foram medidos por PCR em tempo real. Os resultados mostraram que o nível de mRNA de Apo J sofreu um grande aumentou 2 semanas após a cirurgia, atingiu o pico na terceira semana, e diminuiu na quarta semana pós-cirurgia no grupo modelo. No grupo intervenção, o nível de mRNA de Apo J sofreu um grande aumentou e atingiu o pico na semana 2, diminuindo nas semanas 3 e 4 pós-cirurgia no grupo intervenção. Além disso, o nível de mRNA de Apo J foi maior no grupo intervenção que no grupo modelo na primeira semana pós-operação. Na segunda semana pós-cirurgia, o nível de mRNA de Apo J aumentou consideravelmente em ambos os grupos, e foi significativamente mais alto no grupo intervenção que no grupo modelo (Tabela 3). Resultados similares foram observados nos níveis de proteína de Apo J como mostrado na Figura 4. Nossos resultados mostraram que a rosuvastatina pode aumentar de maneira significativa a expressão de Apo J nas artérias carótidas de ratos lesionadas com balão.
Tempos | Grupo controle | Grupo modelo | Grupo intervenção | t* | p# | |||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
n | 2-ΔΔCt | n | 2-ΔΔCt | n | 2-ΔΔCt | |||
1 | 5 | 0,958 ± 0,251 | 5 | 0,641 ± 0,296 | 6 | 1,275 ± 0,468a | 4,212 | 0,039 |
2 | 5 | 0,948 ± 0,090 | 4 | 7,804 ± 1,328a▲ | 6 | 10,040 ± 2,086∆b | 52,279 | < 0,001 |
3 | 5 | 1,004 ± 0,196 | 4 | 8,011 ± 2,306aβ | 6 | 7,327 ± 2,869∆*β | 15,31 | < 0,001 |
4 | 5 | 1,048 ± 0,349 | 4 | 3,429 ± 1,119abcθ | 6 | 2,413 ± 0,492* #θ | 14,212 | 0,001 |
F$ | 0,182 | 29,266 | 31,336 | |||||
P# | 0,907 | < 0,001 | < 0,001 |
*teste t para comparar diferença entre os dois grupos.
$valor F calculado usando análise de variância simples (one-way ANOVA) para comparar a diferença entre os quatro grupos.
#p < 0.05 considerado estatisticamente significativo.
No presente estudo, encontramos que a I/M aumentou após a lesão com balão e atingiu o valor máximo na quarta semana no grupo modelo; além disso, I/M estava aumentada na semana 2 e tal aumento cessou após administração de rosuvastatina. Nossos resultados sugerem que a rosuvastatina pode reduzir significativamente o grau de hiperplasia intimal nas artérias carótida lesionadas com balão em ratos. Os níveis de mRNA e de proteína de Apo J nas artérias carótidas foram aumentados pela rosuvastatina quando comparados ao grupo modelo, atingindo o máximo na segunda semana, mais cedo que no grupo modelo. Nossos resultados sugerem que a rosuvastatina pode inibir a hiperplasia intimal pelo aumento de Apo J após lesão com balão em ratos.
Estudos relataram que a Apo J está intimamente relacionada a doenças cardiovasculares, tais como aterosclerose e reestenose após angioplastia.14,15 Ishikawa et al.7 apresentaram a distribuição de Apo J na matriz extracelular da camada íntima da aorta aterosclerótica de humanos, e seu potencial papel protetor na aterosclerose por meio do transporte de colesterol da parede aórtica para o fígado. A Apo J está aumentada na lesão tissular e estresse celular e tem uma função vital na proteção contra estresse oxidativo, lise celular e morte celular apoptótica.16-21 Além disso, observou-se Apo J na remodelagem ativa do tecido. Esses achados indicam que a Apo J pode atuar como um reagente de fase aguda. No presente estudo, observamos um espessamento marcante da camada neoíntima duas semanas após a cirurgia, com proliferação e migração de CMLV identificadas por coloração de HE no grupo modelo. A proliferação e a migração de CMLV foram mais ativas na terceira semana após cirurgia, e diminuíram na quarta semana. Ao mesmo tempo, os níveis de mRNA e de proteína da Apo J aumentaram significativamente na semana 2, alcançou um pico na terceira semana após operação, e diminuiu na quarta semana. Os resultados mostraram alta expressão de Apo J na fase de proliferação ativa e migração de CMLV. Consistente com outros estudos, nossos resultados sugerem que a Apo J pode ser um reagente de fase aguda após lesão com balão nas artérias carótidas de ratos.
Reestenose de stent após procedimentos intervencionistas tornou-se um dos problemas mais urgentes a serem resolvidos em todo o mundo. A rosuvastatina, um potente inibidor da enzima HMG-CoA (hidroximetilglutaril-CoA) redutase, parece reduzir o espessamento neointimal após lesão endotelial vascular em ratos. No presente estudo, os ratos do grupo intervenção receberam administração intragástrica de rosuvastatina (10 mg/kg/d). De acordo com outros estudos,22-24 encontramos que a rosuvastatina reduziu significativamente a formação de neoíntima.
Estudos prévios relataram que a isoforma secretada da Apo J (CLUs) pode inibir a proliferação e a migração de CMLV.12,25 Kim et al.12 também relataram que a Apo J poderia inibir significativamente a hiperplasia neointimal por meio da superexpressão de Apo J mediada por adenovírus em ratos. Em nosso estudo, observamos que níveis de mRNA e proteína da Apo J nas artérias carótidas aumentaram após a administração de rosuvastatina em comparação ao grupo controle. Ainda, a Apo J atingiu o máximo na segunda semana após a administração de rosuvastatina, e tal fato ocorreu mais cedo em comparação ao grupo modelo (terceira semana). Esses resultados sugerem que a rosuvastatina pode aumentar os níveis de Apo J nas artérias carótidas com lesões induzidas por balão, o que indiretamente indica que a Apo J exerce função protetora contra reestenose após lesão por balão em ratos.
Nossos resultados mostraram que a Apo J serviu como um reagente de fase aguda após lesão nas artérias carótidas de ratos induzida por balão. A rosuvastatina pode reduzir a formação de neoíntima pelo aumento nos níveis de Apo J. Nossos resultados sugerem que a Apo J exerce papel protetor contra reestenose após lesão por balão em ratos.