Efeitos da terapia com ozônio na regeneração do nervo facial

Efeitos da terapia com ozônio na regeneração do nervo facial

Autores:

Isa Ozbay,
Ilker Ital,
Cuneyt Kucur,
Raziye Akcılar,
Aysenur Deger,
Savas Aktas,
Fatih Oghan

ARTIGO ORIGINAL

Brazilian Journal of Otorhinolaryngology

versão impressa ISSN 1808-8694versão On-line ISSN 1808-8686

Braz. j. otorhinolaryngol. vol.83 no.2 São Paulo mar./abr. 2017

http://dx.doi.org/10.1016/j.bjorl.2016.02.009

Introdução

A paralisia facial periférica é a neuropatia craniana mais frequente e pode surgir de diversos mecanismos de lesão do sétimo nervo craniano. Após a lesão, a regeneração do nervo facial é problemática. Uma lesão do nervo, tal como a peroxidação lipídica das células neurovasculares, pode conduzir a estresse oxidativo, como resultado da produção de radicais livres.1,2 Vários métodos têm sido usados para melhorar a regeneração do nervo periférico.3,4 É bem sabido que os radicais livres de oxigênio influenciam na regeneração dos nervos e, além disso, alguns estudos demonstraram que os antioxidantes reduzem os níveis de radicais livres de oxigênio.5,6

O ozônio (O3), é um poderoso oxidante, não persistente, com uma meia-vida de aproximadamente 20 min a temperaturas normais.7 Decompõe-se e se dispersa facilmente em água e pode conter os fatores celulares inflamatórios, ativar ciclo-oxigenase e diminuir a reação de estresse à oxidação histiocítica, o que aumenta a capacidade histiocítica de resistir à oxidação e radicais livres.7 Também pode eliminar os radicais livres resultantes da inflamação crônica, servir como um analgésico e atuar como anti-inflamatório.8

O conceito do uso de ozônio para melhorar a cicatrização de feridas infectadas, necrosadas ou de tecido mal oxigenado foi explorado em ortopedia, odontologia e com feridas cutâneas.9 No entanto, nenhum estudo anterior relatou sobre o efeito da terapia com ozônio na regeneração do nervo facial. Por isso, investigamos o efeito da terapia com ozônio sobre a regeneração do nervo facial em ratos. Até onde sabemos, este é o primeiro estudo a avaliar a terapia de ozônio nesse contexto.

Método

Desenho de estudo

No total, 14 ratos albinos Wistar com um peso médio (DP) de 250-300 g foram alojados em grupos por sete a 14 dias, sob condições ambientais normais, com livre acesso a comida e água. Os ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos, identificados como controle e de ozônio: o grupo de ozônio (n = 7) recebeu uma dose de ozônio de 1,1 mg/kg/d intraperitoneal (IP) por 30 dias; e o de controle (n = 7) recebeu 1,1 mg/kg/d de solução salina IP, durante 30 dias. Todos os procedimentos com animais foram feitos de acordo com a diretiva de 1986 do Conselho das Comunidades Europeias e com a aprovação obtida pela Comissão de Ética para Animais local (03/02/2015).

Esmagamento do nervo facial

Os ratos foram sedados com injeções IP de cetamina (80 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg). O nervo facial esquerdo foi então exposto em todos os animais. Em resumo, a pele sobre o nervo facial foi raspada e limpa com iodo. O nervo facial esquerdo foi exposto por uma incisão oblíqua inferior à aurícula, com a identificação visual do seu tronco principal (fig. 1). O tronco do nervo facial foi então esmagado por 1 min com uma pinça hemostática mosquito no primeiro nível, sem seccionar o axônio.

Figura 1 Cirurgia de esmagamento do nervo facial. O tronco do nervo facial foi dissecado a partir de tecido adjacente e então colocado entre dois pares de pinças-mosquito hemostáticas. 

Aplicação de ozônio

O ozônio foi produzido com um gerador de ozônio (Humazon® ProMedic Humares-GmbH, Alemanha). A taxa de fluxo de O3 foi mantida constante a 3 L/min, o que representa uma concentração de 50 ug/mL e cerca de 3% da mistura gasosa de O3/O2. Os tubos de polímero Tygon, resistentes ao ozônio e polipropileno tratado com silício de uso único, foram usados durante todo o experimento para garantir a contenção de O3 e a consistência das concentrações. O ozônio fornecido a cada animal foi ajustado para uma dose final de 1,1 mg/kg (1) e foi administrado por via IP uma vez por dia, durante 30 dias.

Avaliação do limiar eletrofisiológico

O limiar de estimulação do nervo facial foi medido com um monitor Nerve Integrity (NIM-2; Medtronic Xomed, Jacksonville, FL). Antes do esmagamento do nervo, o limiar de estimulação do nervo facial foi medido em unidades de miliampère (mA). Após o esmagamento do nervo, o limiar de estimulação do nervo facial foi novamente mensurado e a ferida foi fechada em uma única camada com Vicryl 4-0 (Ethicon, Alemanha). Após 30 dias de terapia com ozônio, os nervos faciais nos ratos foram novamente expostos e os limiares de estimulação do nervo foram medidos. Os resultados foram comparados com aqueles do grupo controle.

Avaliação anátomopatológica

Avaliação por microscopia óptica

O nervo facial esquerdo foi dissecado a partir dos tecidos adjacentes depois de medir limiares de estimulação do nervo e a parte esmagada do nervo facial foi então removida. Todas as amostras foram fixadas em formol a 10% com tamponamento. Após a fixação, os espécimes foram incluídos em blocos de parafina e cortes de 4 mm foram recolhidos. Todos foram corados com hematoxilina-eosina e azul de toluidina e examinados por um patologista com microscopia óptica. Todas as amostras foram investigadas para o grau de macrovacuolização, congestão vascular e espessura da bainha de mielina. A macrovacuolização e congestão vascular foram categorizadas como nenhuma, leve, moderada ou grave. A espessura da bainha de mielina axonal foi classificada como muito fina, fina ou normal.

Avaliação microscópica eletrônica

Os nervos faciais excisados foram fixados em glutaraldeído a 2,5% (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA, EUA), fixados posteriormente em tetróxido de ósmio a 1% (Electron Microscopy Sciences), processados para microscopia eletrônica rotineiramente e embebidos em resina (Electron Microscopy Sciences). Os cortes ultrafinos (50-70 nm) foram feitos com ultramicrótomo (Leica Microsystems GmbH, Viena, Áustria), em contraste com acetato de uranila-citrato de chumbo e examinados com um microscópio eletrônico (JEOL-JEM 1011, Jeol Ltd., Tóquio, Japão). As amostras foram fotografadas com uma câmera digital (Megaview III, Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Münster, Alemanha) acoplada ao microscópio.

Os sistemas de classificação descritos anteriormente foram usados para a avaliação ultraestrutural das bainhas de mielina e lesão dos axônios nas fibras nervosas.10,11 Os axônios mielinizados foram ultraestruturalmente classificados como grau 0 (normal), grau 1 (separação na configuração de mielina), grau 2 (interrupção na configuração de mielina), grau 3 (aparência de favo de mel) ou grau 4 (mielina em colapso formando ovoides). A ultraestrutura axonal foi pontuada de acordo com danos como 0 (nenhum dano), 1+ (dano baixo), 2+ (dano leve) ou 3+ (dano alto). Sete amostras de cada grupo foram analisadas por essa avaliação quantitativa. Durante esses procedimentos de classificação, foram avaliados 50 axônios mielinizados de cada amostra.

Análise estatística

Foi feita com SPSS versão 15.0. O teste dos postos sinalizados não paramétrico de Wilcoxon foi usado para a comparação de dois grupos dependentes. O teste U não paramétrico de Mann-Whitney foi usado para a comparação de grupos independentes. O teste t de Student foi usado para a avaliação de microscopia eletrônica. Foram considerados estatisticamente significativos valores de p < 0,05.

Resultados

Não houve diferença estatisticamente significativa nos limiares de estimulação entre os grupos de ozônio e de solução salina após o esmagamento (p = 1,000). Isso indica que a gravidade da lesão por esmagamento do nervo foi semelhante nos dois grupos. Embora limiares de estimulação tenham sido significativamente inferiores aos limiares pré-esmagamento em ambos os grupos de ozônio e solução salina (p = 0,018 e 0,018) após 30 dias de tratamento, o grupo tratado com ozônio teve limiares de estimulação mais baixos do que o grupo de solução salina, quando comparados com os níveis pós-esmagamento. Embora isso não tenha atingido o nível de significância estatística, indica uma maior melhoria funcional no grupo de ozônio (p = 0,053). A melhoria também foi observada no grupo da solução salina, mas acredita-se que isso seja resultado da recuperação espontânea do nervo facial. Após 30 dias de tratamento, nenhum dos dois grupos atingiu níveis de amplitude pré-esmagamento (tabela 1).

Tabela 1 Comparação entre limiares de estimulação do nervo facial antes e depois de esmagamento e 30 dias depois 

Antes de esmagamento
(mA)
Após esmagamento
(mA)
30 dias depois
(mA)
Comparação entre antes do esmagamento e 30 dias depois Comparação entre após esmagamento e 30 dias depois
Média (SD) Mediana Média (SD) Mediana Média (SD) Mediana pa pa
Controle 0,068 (0,017) 0,061 0,935 (0,203) 0,903 0,099 (0,038) 0,084 0,176b 0,018b
Ozônio 0,052 (0,.127) 0,053 0,925 (0,127) 0,904 0,067 (0,011) 0,064 0,090b 0,018b
pc 0,165 1,000 0,053

aTeste dos postos sinalizados de Wilcoxon.

bp < 0,05.

cTeste U de Mann-Whitney.

Foram encontradas diferenças significativas na congestão vascular, macrovacuolização e espessura da mielina entre os grupos de ozônio e de controle por microscopia óptica (tabela 2; fig. 2A-D). A degeneração grave em diferentes graus foi observada em quase todos os axônios mielinizados no grupo de controle por microscopia eletrônica. Em axônios mielinizados ligeiramente danificados, embora as bainhas de mielina tivessem delaminação leve, a estrutura citoplasmática dos axônios mielinizados era normal. Em axônios mielinizados gravemente danificados, a delaminação grave e desintegração foram observadas em bainhas de mielina. Edema mitocondrial e perda de cristas e desorganização de microtúbulos e microfilamentos foram observados no citoplasma axonal. Além disso, alguns axônios foram escurecidos e continham corpos ovoides de mielina (figs. 3A e 4A-B).

Tabela 2 Comparação das variações histopatológicas do nervo facial entre grupos tratados com ozônio e com solução salina após 30 dias via microscópio óptico 

Controle (n = 7) Ozônio (n = 7)
n (%) n (%) p
Congestão vascular 0,017a
Nenhuma 0 (0) 3 (42,8)
Leve 2 (28,6) 3 (42,8)
Moderada 2 (28,6) 1 (14,3)
Grave 3 (42,8) 0 (0)
Mediana 2 1
Macrovacuolização 0,002b
Nenhuma 0 (0) 2 (28,6)
Leve 0 (0) 4 (57,1)
Moderada 5 (71,4) 1 (14,3)
Grave 2 (28,6) 0 (0)
Mediana 2 1
Espessura da mielina 0,053
Muito final 6 (85,7) 2 (28,6)
Fina 1 (14,3) 2 (28,6)
Normal 0 (0) 3 (42,8)
Mediana 2 1

Teste U de Mann-Whitney.

ap < 0,05.

bp < 0,01.

Figura 2 Exame da estrutura axonal pós-lesão por microscopia óptica. A, Coloração de azul de toluidina do grupo controle. B, Coloração de azul de toluidina do grupo do ozônio. C, Coloração H&E do grupo controle. D, Coloração H&E do grupo do ozônio. Aumento de 40×; setas indicam bainha de mielina, círculos indicam áreas de congestão vascular e quadrados indicam macrovacuolização. Imagens representativas são mostradas. 

Figura 3 Micrografias eletrônicas de transmissão de axônios mielinizados pós-lesão. A, No grupo controle, delaminação e deformação foram observadas em bainhas de mielina da maioria dos axônios (setas em negrito), além do aparecimento de corpos ovoides de mielina (setas finas) e citoplasma axonal escurecido (pontas de seta). Muito poucos axônios mielinizados normais (asteriscos) foram observados. B, No grupo experimental, inúmeros axônios normalmente mielinizados são observados (asteriscos). Delaminação e deformação em bainhas de mielina (setas em negrito) e corpos de mielina ovoides (seta fina) são mostradas em apenas alguns axônios mielinizados. Ampliação para ambas as imagens: 4000 ×, imagens representativas são mostradas. 

Figura 4 Micrografias eletrônicas de transmissão de citoplasma de axônios mielinizados. A, No grupo controle, mitocôndrias inchadas com estrutura de cristas degeneradas (setas finas) foram observadas no citoplasma. Microtúbulos e microfilamentos estavam heterogeneamente dispersos. Em algumas áreas, a diminuição da quantidade de microtúbulos e microfilamentos foi observada (pontas de setas). B, No grupo controle, foram observadas mitocôndrias inchadas e danificadas (setas finas) e microtúbulos e arranjos de microfilamentos estavam desorganizados e interrompidos (pontas de setas). C, No grupo experimental, a ultraestrutura das mitocôndrias estava normal (setas em negrito). Microtúbulos e microfilamentos estavam homogeneamente dispersos por todo o citoplasma (asteriscos). D, No grupo experimental, os microtúbulos e microfilamentos alinhados longitudinalmente eram normais (pontas de setas) e mitocôndria exibia uma ultraestrutura normal (setas em negrito). Ampliação para todas as imagens: 3000 ×, A e C são incidências em corte transversal, B e D são cortes longitudinais e imagens representativas são mostradas. 

No grupo de ozônio, a maioria dos axônios mielinizados era normal em estrutura à microscopia eletrônica. A ultraestrutura mitocondrial e a organização de microtúbulos e microfilamentos em citoplasma axonal eram normais em axônios mielinizados. No entanto, em alguns dos axônios mielinizados, foi observada separação da configuração de mielina e desintegração das bainhas de mielina. Além disso, havia mitocôndrias inchadas com cristas danificadas, microtúbulos desorganizados e microfilamentos e corpos de mielina ovoides no citoplasma do axônio mielinizado (tabela 3; figs. 3B e 4C-D).

Tabela 3 Comparação das variações histopatológicas do nervo facial entre os grupos tratados com ozônio e solução salina após 30 dias via microscopia eletrônica 

Controle
(n = 7)
Ozônio
(n = 7)
Média (DP) Média (DP) pa
Classificação ultraestrutural dos axônios mielinizados
Grau 0 8,71 (3,039) 23,00 (6,856) 0,001b
Grau 1 12,00 (4,041) 13,71 (2,984) 0,386
Grau 2 10,86 (3,078) 5,71 (2,138) 0,004b
Grau 3 10,00 (3,830) 3,29 (2,563) 0,003b
Grau 4 9,00 (1,414) 4,29 (2,215) 0,001b
Lesão à ultraestrutura axonal
0 11,43 (3,309) 24,00 (3,830) 0,000b
1+ 10,71 (4,536) 15,57 (2,149) 0,032c
2+ 13,43 (3,259) 5,57 (1,813) 0,000b
3+ 14,43 (3,735) 4,86 (3,338) 0,000b

aTeste t de Student.

bp < 0,01.

cp < 0,05.

Discussão

Muitos fármacos são usados no tratamento de paralisia facial traumática. O mais comumente usado é o corticosteroide, que diminui a permeabilidade capilar e reduz o edema em torno do nervo facial. Também se acredita que a cortisona diminui a degeneração do axônio e aumenta a regeneração.2,12-14 O efeito da vitamina E sobre a regeneração do nervo após trauma também tem sido investigado.15 A vitamina E é um poderoso antioxidante lipossolúvel, que pode impedir a formação de radicais livres, protege as células contra o estresse oxidativo e a peroxidação lipídica. Taskale et al.15 investigaram os efeitos da vitamina E e vitamina E mais cortisona na cicatrização do nervo facial em ratos. Eles descobriram que a vitamina E teve um efeito positivo sobre a cicatrização do nervo; esse efeito foi aumentado por adição de cortisona. Lieberman et al.16 investigaram os efeitos dos corticosteroides sobre a recuperação funcional e sobrevida neuronal após a lesão do nervo facial em camundongos. Eles descobriram que o tratamento com corticosteroides retarda a recuperação funcional e perturba a sobrevida neuronal após lesão por esmagamento do nervo facial em camundongos adultos. Eles também alegaram que o grau de sobrevida do neurônio motor corresponde ao estado funcional. Em camundongos jovens, a lesão por esmagamento resulta em recuperação funcional geral precária e perda profunda de células no núcleo motor facial. Em outro estudo, Toros et al.17 avaliaram os efeitos do oxigênio hiperbárico (OHB), metilprednisolona e tratamentos combinados de OHB-metilprednisolona sobre a regeneração traumática do nervo facial em ratos. Acredita-se que o OHB diminui o edema relacionado com lesões, reduz a concentração de radicais livres de oxigênio após a isquemia com reperfusão e aumenta os níveis locais de oxigênio no tecido.18 Os autores concluíram que a terapia de combinação com metilprednisolona e OHB pode ser benéfica para o tratamento da isquemia e edema, que resultam da cascata de lesão do nervo facial.

A regeneração espontânea do nervo com boa melhoria funcional pode ser encontrada após lesão por esmagamento do nervo periférico.19 Esse tipo de lesão do nervo é tratado com agentes farmacológicos, em vez de cirurgia. O processo de cicatrização após lesão por esmagamento é largamente prejudicado, devido ao aumento da produção de radicais livres, em vez de neuroinflamação e edema.20 Os materiais antioxidantes eliminam os radicais livres e contribuem para a regeneração do nervo. As enzimas antioxidantes, como a superóxido dismutase e catalase, protegem as células dos efeitos tóxicos de radicais livres. Os radicais livres induzem dano celular traumático e causam morte celular. A lesão por esmagamento de nervos leva ao estresse oxidativo, como peroxidação lipídica das células neurovasculares, por meio da criação de radicais livres.21,22

Alguns antioxidantes foram examinados quanto à sua capacidade para melhorar a regeneração dos nervos periféricos. Jang et al.23 investigaram o efeito do extrato de ginkgo biloba sobre a recuperação após lesão por esmagamento do nervo facial em ratos. Eles descobriram que a injeção intraperitoneal do extrato de ginkgo biloba foi eficaz na promoção da regeneração do nervo em um modelo experimental em ratos com esmagamento do nervo. Outro antioxidante que tem sido estudado como apoio na regeneração do nervo facial esmagado é a coenzima Q.24 Também foi observado que a coenzima Q é eficaz na promoção da regeneração do nervo facial em um modelo de rato experimental de esmagamento do nervo.

O ozônio pode promover um estresse oxidativo moderado que, por sua vez, aumenta os sistemas antioxidantes endógenos.25,26 O mecanismo de proteção mediado pelo ozônio pode envolver a síntese de proteínas. O aumento das espécies de oxigênio reativas pode induzir a expressão do gene antioxidante em muitas células. Um importante mecanismo de homeostase redox é a indução mediada por espécies de oxigênio reativo de cascatas de sinalização que aumentam a expressão de antioxidantes.27 Por conseguinte, como a camada de ozônio aumenta os níveis de antioxidantes, e leva a uma diminuição nos radicais livres, investigamos o efeito da terapia com ozônio sobre a regeneração dos nervos faciais esmagados.

No estudo atual, a regeneração do nervo facial foi avaliada por meio da avaliação dos limiares eletrofisiológicos e pelo exame histopatológico. Há alguns dispositivos de monitoramento da integridade do nervo disponíveis para identificar e evitar danos persistentes nos nervos.28,29 Nesse estudo, foi usada a técnica da eletromiografia facial com Monitor de Integridade do Nervo descrita por Delgado et al.29 e usada em estudos anteriores15,24 para registrar a contração dos músculos faciais. No presente estudo, embora não se atingisse significância estatística, houve melhoria da função do nervo facial no grupo de ozônio quando avaliado por níveis de limiar. Existem vários estudos na literatura que relatam a avaliação histopatológica do grau de macrovacuolização, congestão vascular e espessura da bainha de mielina para avaliar os danos do nervo.17,24 No presente estudo, foram usados parâmetros semelhantes para avaliar a estrutura do nervo; foram encontradas diferenças significativas na congestão vascular, macrovacuolização e espessura da mielina entre os grupos de ozônio e de controle.

O ponto forte do nosso estudo estava na avaliação do grau de regeneração do nervo facial, não só pela microscopia óptica, mas também por microscopia eletrônica. Um grande número de axônios mielinizados de cada amostra (n = 50) e 350 axônios mielinizados de cada grupo de tratamento foram avaliados por microscopia eletrônica. Neste estudo, a microscopia eletrônica confirmou os achados da microscopia óptica. Uma limitação do nosso estudo foi a curta duração de acompanhamento após os tratamentos. Exploramos nervos faciais um mês após o tratamento. Esse tempo deveria ter sido maior, para que a recuperação funcional fosse observada. Essa pode ser uma das razões pelas quais os nossos achados não alcançaram significância estatística. Portanto, são necessários mais estudos, com maior tempo de acompanhamento após o tratamento. Esperamos que este estudo preliminar incentive outros estudos maiores a serem feitos.

Conclusão

Em conclusão, nosso estudo é o primeiro que conhecemos a investigar os efeitos da terapia com ozônio sobre a regeneração dos nervos faciais esmagados. Os nossos dados sugerem que a terapia com ozônio pode ter efeitos benéficos sobre a regeneração de nervos faciais esmagados. Seus efeitos positivos foram observados especialmente na avaliação patológica. A microscopia eletrônica confirmou os resultados da microscopia óptica. Portanto, conclui-se que a terapia com ozônio pode ser um caminho promissor para explorar o tratamento da paralisia facial aguda e a regeneração do nervo periférico. Outros estudos são necessários para confirmar nossos achados.

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