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Efeitos do Treinamento Físico sobre o Miocárdio de Camundongos LDLr Knockout Ovariectomizadas: MMP-2 e -9, Colágeno I/III, Inflamação e Estresse Oxidativo

Efeitos do Treinamento Físico sobre o Miocárdio de Camundongos LDLr Knockout Ovariectomizadas: MMP-2 e -9, Colágeno I/III, Inflamação e Estresse Oxidativo

Autores:

Ledimar Brianezi,
Elisabete Ornelas,
Flávia de Sousa Gehrke,
Fernando Luiz Affonso Fonseca,
Beatriz da Costa Aguiar Alves,
Luiz Vinicius de Alcantara Sousa,
Jessica Souza,
Laura Beatriz Mesiano Maifrino

ARTIGO ORIGINAL

Arquivos Brasileiros de Cardiologia

versão impressa ISSN 0066-782Xversão On-line ISSN 1678-4170

Arq. Bras. Cardiol. vol.114 no.1 São Paulo jan. 2020 Epub 21-Out-2019

https://doi.org/10.5935/abc.20190223

Resumo

Fundamento:

O surgimento da doença cardíaca coronariana aumenta com a menopausa, inatividade física e dislipidemia. Sabe-se que o treinamento físico promove a melhora das funções cardiovasculares

Objectivo:

Investigar os efeitos do treinamento físico aeróbico sobre o ventrículo esquerdo em camundongos LDL knockout ovariectomizadas.

Métodos:

Trinta animais foram divididos em 6 grupos (n = 5): controle sedentário não ovariectomizado, controle sedentário ovariectomizado, controle treinado ovariectomizado, sedentário LDL-knockout não ovariectomizado, sedentário LDL-knockout ovariectomizado e treinado LDL-knockout ovariectomizado. Analisamos os parâmetros médios da densidade de volume de fibras colágenas tipo I e III, e metaloproteinases 2 e 9. Valores de p < 0,05 foram considerados significativos.

Resultados:

Os resultados mostram que o protocolo de exercício proposto alterou o volume de fibras colágenas do tipo I e os parâmetros de remodelamento do colágeno (MMP-2), e ainda reduziu o parâmetro de estresse oxidativo do 8-hidroxi-2’-deoxiganosina (8-OhdG).

Conclusão:

O treinamento aeróbico de intensidade moderada age sobre o volume das fibras colágenas e sobre o remodelamento de colágeno, com redução do estresse oxidativo em ventrículos esquerdos de camundongos ovariectomizados LDLr Knockout.

Palavras-chave: Doença da Artéria Coronária; Exercício; Menopausa; Dislipidemia; Atividade Física; Colágeno; Estresse Oxidativo; Inflamação; Camundongos

Abstract

Background:

The emergence of coronary heart disease is increased with menopause, physical inactivity and with dyslipidemia. Physical training is known to promote the improvement of cardiovascular functions.

Objective:

To investigate the effects of aerobic physical training on the left ventricle in ovariectomized LDL knockout mice.

Methods:

Thirty animals were divided into 6 groups (n = 5): Sedentary non-ovariectomized control; Sedentary ovariectomized control; Trained ovariectomized control; Sedentary non-ovariectomized LDL-knockout, sedentary ovariectomized LDL-knockout and trained ovariectomized LDL-knockout. We analyzed the average parameters of apparent density of collagen fibers types I and III, and metalloproteinase type 2 and type 9, were considered significant p < 0.05.

Results:

The results showed that the proposed exercise protocol altered the volume of type I collagen fibers, altered collagen remodeling parameters (MMP-2), and also reduced the 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8OHdG) oxidative stress parameter.

Conclusion:

Moderate intensity aerobic training acts on collagen fiber volume, on collagen remodeling with the reduction of oxidative stress in the left ventricles of ovariectomized LDL-knockout mice.

Keywords: Coronary Artery Disease; Exercise; Menopause; Dyslipidemias; Motor Activity; Collagen; Oxidative Stress; Inflammation; Mice

Introdução

Durante o processo de envelhecimento, as mulheres na menopausa têm maior risco de desenvolver condições como dislipidemia, hipertensão, resistência à insulina e mudanças na composição corporal, uma vez que o estilo de vida e o sedentarismo estão associados a maior prevalência de desenvolvimento de doenças cardiovasculares (DC).1,2

O processo de envelhecimento está associado ao aumento do estresse oxidativo, que dá origem a danos em várias macromoléculas celulares, em parte devido à diminuição da capacidade antioxidante, bem como à redução da capacidade de reparação, que acarretam o aumento da susceptibilidade à apoptose.3,4 Especialmente em mulheres na fase da menopausa, as alterações neuroendócrinas afetam a funcionalidade, a capacidade metabólica e a atividade antioxidante de vários órgãos, principalmente em decorrência da falta de estrogênio, que é considerado um antioxidante feminino, causando aumento adicional do estresse oxidativo.5

O metabolismo lipídico também é influenciado por alterações fisiológicas durante a menopausa, resultando em aumento do LDL e diminuição da HDL, o que contribui para o surgimento de doenças cardiovasculares.6,7 Em relação aos homens da mesma idade, as mulheres pós-menopáusicas apresentam maior risco de desenvolver doença cardíaca,8,9 que constitui uma das principais causas de morbidade e mortalidade neste estágio fisiológico.10

A atividade física regular alivia os efeitos do envelhecimento e da menopausa e melhora a aptidão aeróbica, além de manter o índice de peso corporal de gordura visceral, os níveis plasmáticos de lipídios, o aumento da sensibilidade à insulina, o aumento da sensibilidade barorreflexa, a melhora da função endotelial, o estresse de cisalhamento na parede vascular, resultando no aumento do fluxo sanguíneo e estimulando a liberação de óxido nítrico.11-13 Esses fatores promovem uma melhor qualidade de vida relacionada à saúde, prolongam a sobrevivência e podem ser considerados padrões não farmacológicos essenciais para o tratamento dos efeitos da pós-menopausa e de outras condições fisiológicas e patológicas.14,15

O objetivo deste estudo é analisar os efeitos do treinamento físico aeróbico sobre o ventrículo esquerdo de camundongos fêmeas ovariectomizadas selvagens e LDLr knockout, tendo como base os seguintes parâmetros: densidade de volume de fibras colágenas tipo I e III, expressão das metaloproteinases 2 e 9, além da expressão de COX 2 e 8-OhdG.

Métodos

Animais

Foram utilizados trinta camundongos fêmeas, com 10 meses de idade: 15 camundongos fêmeas geneticamente modificados, com nocaute do receptor de lipoproteínas de baixa densidade (LDLr Knockout), e 15 camundongos fêmeas selvagens (C57BL/6J), obtidos no biotério da Universidade de São Paulo. Os animais foram mantidos no biotério da USJT em temperatura (22-24 °C) e iluminação controlada (12 horas de luz e 12 horas de escuridão) recebendo alimentação comercial ((NUVILAB CR1, Nuvital Nutrients LTDA, Curitiba, PR) e água "ad libitum". Os animais foram divididos em 6 grupos (n=5): controle sedentário não-ovariectomizado (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT); LDLr Knockout não sedentário ovariectomizado (LDLr-S), LDLr Knockout ovariectomizado sedentário (LDLr-OS) e LDLr Knockout ovariectomizado treinado (LDLr-OT). Os animais foram categorizados por conveniência.

O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade São Judas Tadeu (CEP-Protocolo: 058/2007) e a pesquisa foi conduzida como indicado pelos Princípios de cuidados com animais de laboratório publicados pelos Institutos Nacionais de Saúde.

Ovariectomia

Aos nove meses de idade, os animais foram submetidos ao procedimento da ovariectomia. Eles foram anestesiados com uma solução de ketamina e xilazina (120:20 mg/Kg, im) e colocados em posição supina e uma pequena incisão foi feita no terço inferior da região abdominal, paralelamente à linha do corpo. Os ovários, os cornos uterinos e vasos sanguíneos foram localizados, seccionados e removidos. Em seguida, a musculatura e a pele foram suturadas. A confirmação da eficácia da ovariectomia foi determinada através da colpocitologia da secreção vaginal realizada durante quatro dias consecutivos. No último dia de análise, a eutanásia foi realizada nesses animais.16

Protocolo de Treinamento

Teste de treinamento máximo

Um teste de treinamento máximo foi realizado em todos os grupos no início e no final do programa de treinamento de exercícios. O teste consiste em colocar o animal em uma esteira ergométrica a 0,3 km/h por 3 minutos, e essa carga de trabalho era aumentada em 0,3 km/h a cada 3 minutos, até que o animal atingisse o esgotamento. O tempo do teste e a velocidade da última carga de trabalho foram observados e usados para determinar o valor médio da capacidade aeróbica de cada grupo.

Treinamento de exercícios

O treinamento de exercícios começou 7 dias depois da cirurgia de ovariectomia. Os grupos treinados foram submetidos a um protocolo de treinamento físico em uma esteira ergométrica com baixa intensidade moderada (≈50% a 70% de velocidade máxima) durante 1 hora por dia, 5 dias por semana, por 4 semanas, com aumento gradual da velocidade de 0,3 a 1,2 km/h. Os animais foram adaptados à esteira durante 10 minutos nos três dias que precederam o início dos treinamentos.

Eutanásia e preparação dos tecidos

No final do treinamento os animais foram sacrificados por decapitação. Uma toracotomia foi realizada, através da qual o coração e os átrios foram removidos, e os ventrículos direito e esquerdo foram seccionados. Amostras do ventrículo esquerdo foram fixadas em formalina tamponada a 10% durante 24 horas. Em seguida, o tecido foi transferido para uma solução de álcool etílico 70%, desidratado em sequência crescente de etanol, diafanizados em xilóis e embebidos em parafina. Foram realizados cortes não seriados de 5µm de espessura, onde cada lâmina recebeu um total de 6 cortes. As lâminas foram coradas pela técnica de Picrosirius, para a análise das fibras colágenas I e III no ventrículo esquerdo e visualizadas através de microscopia de luz polarizada.

A densidade de volume das fibras colágenas I e III (Vv[fc]) expressa a fração do volume ocupado pelas fibras colágenas em relação ao volume total da imagem avaliada. Para essa análise, foi utilizado o sistema teste com um total de 475 pontos, que corresponde a 100% da imagem, usando o programa Image J. (versão 1.47 - National Intitutes of Health; COLLINS, 2007).

Imunohistoquímica

Para as técnicas de imunohistoquímica, foram feitos cortes com espessura de 3 a 4 micrômetros, que foram montados em lâminas previamente silanizadas a 4%. Depois, as lâminas foram desparafinizadas, utilizando estufa a 57ºC pernoite, sendo então imersas em banhos de xilol com duração de 30 minutos. Em seguida, elas foram hidratadas em álcool etílico nas concentrações decrescentes de 100%, 80% e 70%, cada qual com uma duração de 5 minutos e, depois, lavadas em água corrente. Na etapa seguinte, a recuperação antigênica foi realizada em banho-maria a 90°C. As lâminas foram colocadas em tampão citrato durante 30 minutos e, então, lavadas em água corrente. Foi realizado o bloqueio da peroxidase endógena com H2O2 por 15 minutos, seguindo-se as lavagens em água corrente e destilada e em PBS pH= 7,4. Para cada lâmina, foi utilizado um anticorpo específico (Tabela 1), após o que foram incubadas, em câmara úmida (overnight, a 4ºC). O material foi então lavado com tampão PBS e incubado com anticorpo secundário biotinilado por 30 minutos, lavado de novo com PBS e incubado com um anticorpo streptoavidina-peroxidase por outros 30 minutos. Um substrato cromogênico, solução DAB (33-Diaminobenzidina) na proporção de 1:1, foi utilizado, durante cinco minutos, em temperatura ambiente, para lavar o material com solução PBS e revelar a reação. Ao observar-se a formação de um precipitado castanho escuro, as lâminas foram colocadas em água corrente e, em seguida, contra-coradas com hematoxilina de Harris por 2 minutos. Depois disso, foram submetidas a 3 banhos de xilol para diafinizar e 2 banhos de álcool. As lâminas foram montadas com lamínulas e Entellan®.

Tabela 1 Anticorpos utilizados para detecção de proteínas 

Anticorpo Diluição Marcação Função Fabricante
MMP2/72KDa 1:250 Citoplasma Remodelamento do colágeno sc-10736, Santa Cruz®
MMP9/KDa 1:300 Citoplasma Remodelamento do colágeno sc-6840, Santa Cruz®
COX 2 1:100 Citoplasma Inflamação sc-1745 P, Santa Cruz®
8-OHdG 1:100 Citoplasma Estresse oxidativo sc-66036, Santa Cruz®

Em todas as técnicas, observando-se a presença de um precipitado castanho escuro, a amostra foi visualizada utilizando-se microscópio de luz. A análise quantitativa das imagens foi realizada através do programa ImageLab 2000, por meio do qual foram selecionadas as marcações em marrom e contabilizadas a intensidade da imunoexpressão, como demonstrado na figura 1.

Figura 1 Imunoexpressão de proteínas. CS: controle sedentário não-ovariectomizado; COS: controle ovariectomizado sedentário; COT: controle ovariectomizado treinado; LDLr-S: LDLr Knockout não sedentário ovariectomizado; LDLr-OS: LDLr Knockout ovariectomizado sedentário; LDLr-OT: LDLr Knockout ovariectomizado treinado. 

Análise estatística

Valores absolutos e relativos foram utilizados para descrever as variáveis qualitativas. Para as análises quantitativas com distribuição normal (Shapiro-Wilk > 0,05), utilizou-se média, desvio padrão, mínimo e máximo e, para as variáveis sem distribuição normal (Shapiro-Wil < 0,05), mediana e percentis. Para estudar as diferenças entre variáveis clínicas com os grupos, os testes de Kruskal-Wallis e Anova foram utilizados, complementados pelo teste de Dunn ou Bonferroni. Para todas as análises, um nível de confiança de 95% foi usado. Para a análise estatística, o programa STATA (versão 11.0) foi utilizado.

Resultados

Nossos dados mostraram redução significativa da densidade de volume de fibras colágenas do tipo I no grupo dislipidêmico ovariectomizados (LDLr-OS) (-51%). O grupo LDLr-OT apresentou uma diminuição de 100% quando comparado com o grupo COS e uma diferença significativa em relação aos grupos COT e LDLr-S. A tabela 2 mostra a associação das variáveis expressão de COX-2 e MMP 9 e densidade de volume de fibras colágenas tipo I, em relação aos grupos de animais estudados.

Tabela 2 Comparação da ciclo-oxigenase-2, densidade de volume das fibras colágenas I e metaloproteinase tipo 9, com os grupos estudados 

Variáveis CS COS COT LDL-S LDL-OS LDL-OT p*
COX-2 35,0 (23,9; 46,3) 46,5 (44,2; 79,7) 46,1 (31,3; 47,7) 47,7 (45,8; 63,1) 87,8 (42,5; 92,4) 49,4 (49,1; 50,9) 0,232
Vv [fc I] 0,21 (0,21; 0,43) 0,43 (0,21; 0,43) - - 0,21 (0,0; 0,41)A,B,C 0,0 (0,0; 0,21)A,B,C < 0,001
MMP9 44,7 (40,1; 44,8) 40,9 (39,8; 45,6) 53,9 (48,6; 66,2) 53,0 (38,3; 58,1) 42,2 (27,3; 53,7) 64,1 (45,5; 93,9) 0,169

*Kruskal-Wallis. Dados expressos em mediana e percentis 25% e 75%. COX-2: ciclo-oxigenase-2; Vv [fc I]: densidade de volume das fibras de colágeno I; MMP 9: Metaloproteinase tipo 9; CS: controle não-ovariectomizado sedentário; COS: controle ovariectomizado sedentário; COT: controle ovariectomizado treinado; LDL-S: nocaute LDL ovariectomizado não sedentário; LDL-OS: nocaute sedimentar ovariectomizado de LDL; LDL-OT: nocaute LDL ovariectomizado treinado.

Adiferença estatisticamente significante entre o grupo estudado e o grupo COS;

Bdiferença estatisticamente significante entre o grupo estudado e o grupo TOC; C: diferença estatisticamente significante entre o grupo estudado e o grupo LDL-S.

Cdiferença estatisticamente significante entre o grupo estudado e o grupo LDL-S.

Em relação à expressão da metaloproteinase tipo 2, no grupo controle (CS), houve aumento significativo de 24% no grupo ovariectomizado (COS). Quando realizado o treinamento físico (COT), houve um aumento de 72% e, na presença de dislipidemia (LDL-S), o aumento foi de 92%. No grupo dislipidêmico (LDL-OS), com a ovariectomia, os valores caíram 27% em relação do grupo LDLr-S e 18% em relação ao grupo COT, mas os valores ainda permaneceram acima daqueles observados nos grupos controle (42% em relação ao grupo CS e 14% em relação ao grupo COS). Quando realizado o treinamento no grupo dislipidêmico ovariectomizado LDLr-OT, os resultados obtidos demonstraram um aumento de 15% na comparação com o grupo ovariectomizado sedentário LDLr-OS e uma diminuição de 15% em relação ao grupo LDLr-S. Quando comparados com o grupo controle, houve um aumento de 64% em relação ao grupo CS, de 32% em relação ao grupo COS e uma diminuição de 5% em relação ao grupo COT.

Quando os dados do estresse oxidativo foram analisados, em relação à expressão de 8OHDG, houve uma diminuição dos índices para o grupo controle (CS); diminuição de 33% no grupo submetido à ovariectomia (COT) e diminuição de 39% no grupo submetido ao treinamento. Com a presença de dislipidemia (LDLr-S), houve uma diminuição de 51% em relação ao grupo CS, e no grupo dislipidêmico ovariectomizado (LDLrOS), houve diminuição de 85% em relação ao grupo CS, 78% no grupo COS, 76% em relação ao grupo COT e 70% em relação ao grupo LDLr-S.

Quando realizado o treinamento no grupo dislipidêmico ovariectomizado (LDLr-OT), os dados apresentaram um aumento de 152% em relação ao grupo LDLr-OS e uma diminuição nos grupos controle, com 63% para o grupo CS, 45% para o grupo COS e 40% para o grupo COT. Para os parâmetros relacionados à densidade de volume de fibras colágenas do tipo III, metaloproteinase 9 e inflamação (COX2), os valores obtidos para os grupos controles e dislipidêmicos não mostraram diferenças significativas em nenhum parâmetro (Tabela 3).

Tabela 3 Comparação das variáveis Metaloproteinase tipo 2, Anti-8-Hydroxydeoxyguanosine e Densidade de Volume das fibras colágenas III (Vv [fc III]), com os grupos estudados 

Variáveis CS COS COT LDL-S LDL-OS LDL-OT p*
MMP 2 28,5 (4,0) 35,3 (9,1)A 49,0 (3,8)A 54,8 (52,0)A 40,5 (9,6)A,B,C,D 46,8 (31,0)A,B,C,E < 0,001
8-OHDg 105,2 (7,6) 70,0 (10,8)A 64,9 (4,7)A 51,7 (0,5)A 15,3 (7,5)A,B,C,D 38,7 (8,4)A,B,C,E < 0,001
Vv[fc III] 0,007 (0,037) 0,003 (0,024) 0,016 (0,067) 0,015 (0,057) 0,013 (0,062) 0,009 (0,043) 0,649

*ANOVA. Dados expressos em média e desvio padrão.

Adiferença estatisticamente significante entre o grupo estudado e o grupo CS;

Bdiferença estatisticamente significante entre o grupo estudado e o grupo COS;

Cdiferença estatisticamente significante entre o grupo estudado e o grupo TOC;

Ddiferença estatisticamente significante entre o grupo estudado e o grupo LDL-S;

Ediferença estatisticamente significante entre o grupo estudado e o grupo LDL-OS.

MMP2: Metaloproteinase tipo 2; 8OHdG: Anti-8-hidroxi-desoxi-guanosina; Vv [fc III]: densidade de volume das fibras de colágeno III; CS: controle não-ovariectomizado sedentário; COS: controle ovariectomizado sedentário; COT: controle ovariectomizado treinado; LDL-S: nocaute LDL ovariectomizado não sedentário; LDL-OS: nocaute sedimentar ovariectomizado de LDL; LDL-OT: nocaute LDL ovariectomizado treinado.

Discussão

A atividade física é reconhecida como importante tratamento não farmacológico para várias doenças e condições, inclusive para a dislipidemia e a menopausa. Estudos apontam que as fibras colágenas estão presentes no processo de remodelamento do miocárdio, que ocorre devido ao envelhecimento e a outros fatores.17,18

Nossos dados mostram que, no miocárdio, a expressão das fibras colágenas de tipo III não apresentaram diferenças entre os grupos e parâmetros. Em relação ao colágeno tipo I, a ovariectomia e o treinamento trouxeram uma diminuição dos níveis apresentados em relação ao grupo controle ovariectomizado sedentário. Resultados similares aos encontrados neste estudo verificaram a mesma variável em animais após um período de obesidade induzida por uma dieta rica em gordura insaturada.19 Curiosamente, os achados relatados neste artigo possuem resultados semelhantes apenas mediante à atividade física proposta. Outro estudo no qual o infarto agudo do miocárdio foi induzido em ratos, observou-se o aumento gradativo do colágeno tipos I e III no perído de 4 semanas. A cinética do aumento do colágeno I/III, em combinação com a diminuição das fibras elásticas na área infartada após o IAM, ofereceu evidências de que a função cardíaca pejudicada após o IAM foi decorrente da cura ou do processo de cicatrização pós-infarto, com aumento da rigidez e menor flexibilidade do coração.20

Nossos resultados sugerem que o período de envelhecimento neste estudo parece não interferir no aumento da expressão de fibras colágenas apresentadas em outros estudos.21,22 Entretanto, quando os grupos LDLr-OT foram avaliados, houve nítida redução do volume das fibras colágenas tipo I. Essa verificação ocorreu quando da utilização do treinamento proposto (intensidade ou duração).23,24

As metaloproteinases do tipo 2 e 9 também participam do processo de remodelamento do tecido cardíaco, e estão presentes em várias patologias, como as doenças inflamatórias e cardiovasculares, dentre outras lesões.24-29 A expressão da metalloproteinase tipo 9 não apresentou diferenças entre os grupos e parâmetros. Em relação à metalloproteinase tipo 2, um aumento foi observado no grupo controle, com a ovariectomia e com o treinamento físico, até mesmo na presença da dislipidemia. Esse processo explica o fato de os índices de colágeno não estarem elevados, porque a degradação do colágeno e da matriz extracelular é feita através da atuação das metalloproteinases.25,30-32 A elevação das MMPs em pacientes com dislipidemias, encontrada em alguns estudos, sugere a participação das mesmas no processo de degradação da matriz em placas ateroscleróticas e nas suas rupturas, que fazem com que o núcleo fique exposto.17,33 Além disso, as MMPs são preditoras independentes para a progressão de doença renal e estão associadas independentemente com o aumento do risco de mortalidade.34

A expresão de COX2, neste estudo, não apresentou significância estatística, o que indica que, em todos os grupos e parâmetros, não houve mudanças para esses dados. Assim, nesse parâmetro escolhido para verificar a inflamação, não foram observadas mudanças, o que mostra que os fatores associados aos grupos não interferem nessa avaliação.

O envelhecimento, a menopausa e a dislipidemia são fatores que também causam o estresse oxidative.3-5 Nesta pesquisa, o estresse oxidative foi verificado através da expressão de 8OHdG, e a ovariectomia diminuiu os valores deste parâmetro nos grupos dislipidêmico e controle, o que diverge dos resultados encontrados em outros estudos.5,35 Quando o treinamento físico foi realizado, os valores diminuíram no grupo controle mas, no grupo dislipidêmico, eles apresentaram um aumento. Curiosamente, esse marcador parece não estar associado aos grupos propostos neste modelo experimental.

Conclusão

Os dados desta pesquisa indicam que o exercício físico influenciou positivamente os grupos controle e dislipidêmico no parâmetro de densidade e volume de fibras colágenas do tipo I e o grupo controle em relação ao estresse oxidativo.

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