Engenharia de tecidos cardíacos: atual estado da arte a respeito de materiais, células e formação tecidual

Engenharia de tecidos cardíacos: atual estado da arte a respeito de materiais, células e formação tecidual

Autores:

Isabella Caroline Pereira Rodrigues,
Andreas Kaasi,
Rubens Maciel Filho,
André Luiz Jardini,
Laís Pellizzer Gabriel

ARTIGO ORIGINAL

Einstein (São Paulo)

versão impressa ISSN 1679-4508versão On-line ISSN 2317-6385

Einstein (São Paulo) vol.16 no.3 São Paulo 2018 Epub 21-Set-2018

http://dx.doi.org/10.1590/s1679-45082018rb4538

INTRODUÇÃO

As doenças cardiovasculares são a principal causa de morte no mundo. Em 2015, a Organização Mundial da Saúde (OMS) estimou que 17,7 milhões de pessoas morreram devido a doenças cardiovasculares, o que representou 31% das mortes no mundo.(1) Uma doença relevante neste cenário é o infarto agudo do miocárdio, resultado do transporte insuficiente de sangue para o coração, causado principalmente por doença coronariana. O infarto do miocárdio leva a remodelamento ventricular, fibrose, necrose, insuficiência cardíaca, entre outros, o que pode causar disfunção cardíaca parcial ou total.(2) Considerando as inúmeras desvantagens do transplante cardíaco, que ainda é a melhor opção para pacientes com insuficiência cardíaca em estágio terminal,(3) bem como as habilidades regenerativas restritas dos cardiomiócitos para curar o coração após infarto agudo do miocárdio,(4) muitos estudos têm sido realizados em Medicina Regenerativa, criando alternativas para a regeneração miocárdica por meio da engenharia de tecidos.

A engenharia de tecidos é um conjunto de técnicas biomédicas, biotecnológicas e de engenharia, que visa manter, regenerar ou substituir tecidos ou órgãos. Os avanços na engenharia de tecidos são evidentes, e a aplicação desta tecnologia à regeneração do miocárdio tem sido cada vez mais explorada, apresentando resultados encorajadores. A principal abordagem deste campo científico é a criação de scaffolds, que contêm células que podem ser aplicadas como enxertos cardíacos no organismo, para obter a recuperação desejada.

Esta revisão apresenta brevemente as técnicas mais amplamente utilizadas na engenharia de tecidos cardíaca, abrangendo duas décadas: final da década de 1990, quando esta aplicação de engenharia de tecidos viu seus primeiros estudos, até os dias atuais, quando se buscam obter enxertos com amplo potencial de regeneração cardíaca.

ENXERTOS CARDÍACOS

As técnicas utilizadas para obter enxertos cardíacos focam em quatro pontos importantes (Figura 1): (1) seleção do material para o scaffold; (2) produção do material para o scaffold; (3) seleção das células; e (4) cultura celular in vitro.

Fonte: Arquivo pessoal.

Figura 1 Técnicas de engenharia de enxerto cardíaco 

Seleção do material para o scaffold

Os biomateriais têm sido o foco para utilização em engenharia de tecidos, como biomateriais tradicionais ou desenvolvendo variantes específicas para a engenharia de tecidos. Eles são capazes de interagir positivamente com sistemas biológicos e, dessa forma, busca-se melhorar a regeneração do tecido danificado ou efetivamente substituí-lo.

Uma das classes mais importantes de biomateriais é a dos polímeros, disponíveis em diferentes composições e propriedades. Trata-se dos biomateriais mais utilizados para regeneração cardíaca. Esta classe de materiais pode ser dividida em sintética e natural, além de materiais combinados sintéticos/naturais.(5)

Alguns biopolímeros sintéticos utilizados para a engenharia do tecido miocárdico incluem o ácido poliglicólico (PGA),(6) ácido poli-L-lático (PLLA), ácido glicólico polilático (PLGA) e poliuretano. Esta revisão aborda a aplicação do poliuretano na engenharia de tecidos cardíaca, tendo em vista que é um dos biopolímeros mais utilizados.

Há uma diversidade de aplicações biomédicas para poliuretano, desde dispositivos duráveis até scaffolds biodegradáveis.(7,8) Levando em conta a boa compatibilidade tecidual e sanguínea, a adesão celular e as propriedades de ductilidade,(9) o poliuretano têm sido investigado como alternativa para enxertos vasculares(10) e outros dispositivos médicos. No entanto, a bioestabilidade a longo prazo provou ser um obstáculo para este tipo de aplicação.(10)

Por outro lado, as estratégias cardíacas de engenharia de tecidos se concentram em scaffolds de polímero temporários, com taxas de degradação ajustáveis, boa porosidade, biocompatibilidade e propriedades elastoméricas, que podem favorecer mecanicamente a contração do tecido inerente à função cardíaca. Estas propriedades são encontradas em scaffolds à base de poliuretano(11) (Figura 2). Diferentes técnicas utilizando poliuretano foram investigadas, demonstrando as variadas possibilidades e a versatilidade do poliuretano como material para scaffolds porosos na regeneração miocárdica. Fujimoto et al., publicaram estudo bem-sucedido em animais usando um patch cardíaco biodegradável, poroso, de poliuretano, que levou a um fenótipo de formação de tecido muscular liso e contrátil, e melhorou o remodelamento cardíaco e a função contrátil na fase crônica.(12) Baheiraei et al,. demonstraram a síntese de um novo poliuretano condutor biodegradável contendo oligoanilina como polímero condutor eletroativo em experimentos de cultura celular.(13)

Figura 2 Microscopía eletrónica de varredura de scaffold eletrofiado (electrospun) de poliuretano. Escala: 20μ

Polímeros naturais para aplicação, como scaffolds, são inspirados na matriz extracelular (MEC) que mantém as células unidas em um tecido nativo. Assim, alguns materiais, como colágeno (principalmente os tipos I e III são encontrados no coração) e fibrina, foram extensamente investigados na engenharia de tecidos cardíacos, devido a suas propriedades de interação natural com células.(14,15) No entanto, as propriedades mecânicas destes materiais, dependendo da conformação na forma de géis ou estruturas mais sólidas, podem não ser compatíveis com o tecido cardíaco.(5) Estratégia recente para obter polímeros naturais com tamanho e forma (anatomia) adequados é a descelularização.

Considerando a baixa resistência mecânica dos polímeros naturais, a combinação de polímeros sintéticos e naturais é aplicada como estratégia para criar scaffolds com melhores propriedades. Alperin et al., relataram que cardiomiócitos derivados de células-tronco embrionárias podem ser semeados em filmes de poliuretano revestidos com colágeno IV e laminina, e demonstraram um número maior de filmes contráteis do que poliuretano sem revestimento.(16) Hong et al., produziram um composto bio-híbrido combinando MEC com poliuretano, para melhorar a bioatividade in vivo, e empregaram um método de eletrofiação/eletropulverização.(17) Assim, uma abordagem promissora para a regeneração cardíaca pode ser, por exemplo, a síntese de poliuretano à base de colágeno.

Produção de material de scaffold

Uma questão importante, que tem sido objeto de investigação por grupos envolvidos em engenharia de tecidos do miocárdio, é o método de implante das células no local danificado. Uma das primeiras tecnologias desenvolvidas para a regeneração cardíaca foi a cardiomioplastia celular. Esta tecnologia foi muito importante para o estudo dos tipos de células, suas aplicações e efeitos na regeneração cardíaca. Entretanto, os métodos de implante das células no tecido miocárdico utilizados nesta tecnologia, como as vias transvenosa, endomiocárdica e intracoronária, não se mostraram satisfatórios e apresentaram desvantagens que levam a ineficiências.(18) Outras estratégias de engenharia de tecidos cardíacas foram planejadas para melhorar os resultados da regeneração cardíaca, incluindo biomateriais injetáveis contendo células(19) e a criação de estruturas porosas bi- ou tridimensionais (patch ou scaffold).

Muitas técnicas foram investigadas para criar enxertos a serem implantados no coração, tais como métodos de produção de fibras, como eletrofiação(7,8,20) e rotofiação,(21) além de engenharia por camadas de células.(22) Ademais, as técnicas mais interessantes e recentes, como a descelularização, visam obter estruturas tridimensionais que não só podem regenerar o coração existente, mas também criar um órgão bioartificial inteiro.

A descelularização é um processo que consiste na remoção de todas as células dos tecidos ou órgãos, mantendo a MEC intacta (Figura 3), por meio de diferentes métodos físicos, químicos ou enzimáticos. Esta técnica é amplamente utilizada para obter scaffolds biológicos para aplicações clínicas. O processo de descelularização por perfusão se mostrou um método eficiente para preservar a geometria tridimensional dos órgãos e, com uma distribuição mais uniforme dos agentes de descelularização, é capaz de eliminar as células de maneira eficiente.(23,24) Esta técnica foi a mais utilizada para a bioengenharia do coração inteiro, em parte devido à complexidade anatômica da macro e da microanatomia do órgão cardíaco, difícil de reproduzir em detalhes por meios inteiramente sintéticos, mas razoavelmente possível pela técnica de descelularização. A escolha do conduto para perfusão também é importante, e diferentes condutos de natureza vascular ou parenquimatosa são alternativas viáveis para certos órgãos (por exemplo, rim-vascular: artéria renal, veia renal; parenquimatosa: ureter), mas, para a descelularização cardíaca, a via de perfusão vascular é preferível, apresentando resultados promissores.(24)

Fonte: Arquivo pessoal.

Figura 3 Esquema de descelularização. (A) Um coração inteiro (pode ser humano, por exemplo de cadáver ou de transplante rejeitado, ou, mais comumente, de animal doador com tamanho/anatomia compatíveis, em geral, suíno) é colocado em (B) uma câmara de órgão de um biorreator de descelularização conectada à tubulação e a cânulas adequadas para perfusão. Inicia-se o processo de descelularização. Por algum tempo, geralmente 1 ou mais dias de aplicação contínua de solução de descelularização, o coração, aos poucos branqueia, indicando que o constituinte celular do tecido está sendo lavado, deixando para trás o colágeno e outras substâncias de tecido conjuntivo, e preservando bastante a arquitetura anatômica original do órgão em relação à vascularização e ao parênquima (C) 

Seleção celular

A tecnologia da cardiomioplastia celular baseia-se no transplante celular e consiste no fornecimento de células para o tecido miocárdico lesado, visando à regeneração da função cardíaca que foi comprometida.(25) Muitos tipos de células foram utilizados para o transplante celular para o miocárdio lesado e são os mesmos utilizados como candidatos em outras técnicas de engenharia de tecidos miocárdico, incluindo cardiomiócitos adultos, fetais e neonatais;(26,27) mioblastos esqueléticos;(28) células-tronco derivadas da medula óssea (como células-tronco/progenitoras mesenquimais, endoteliais e hematopoiéticas);(29) células-tronco embrionárias;(3033) células de músculos lisos;(34,35) células-tronco derivadas do tecido adiposo;(36,37) células-tronco cardíacas;(38) e a tecnologia relativamente nova de células-tronco pluripotentes induzidas (células iPSC).(39,40) Muitas considerações devem ser feitas para escolher o melhor tipo de célula a ser aplicada em cada situação, dependendo, por exemplo, de sua disponibilidade e sua adequação.(41) É válido analisar as vantagens e desvantagens de cada tipo celular (Tabela 1).

Tabela 1 Vantagens e desvantagens de cada tipo de célula utilizada para cardiomioplastia celular 

Tipo celular Mecanismo de ação Vantagens Desvantagens
Cardiomiócitos (adulto, fetal e neonatal) Miogênese Integração com o tecido hospedeiro, como visto em roedores(26,27)
Fenótipo de cardiomiócitos adultos(26)
Dilema ético
Incapacidade para reproduzir(25)
Disponibilidade limitada
Imunogenicidade(18)
Curta viabilidade celular(25)
Integração inadequada com tecido hospedeiro em suínos(27)
Mioblastos esqueléticos Miogênese Autólogos
Alta viabilidade celular e adesão do enxerto(42)
Fenótipo de musculatura esquelética adulta(28)
Fácil de isolar
Alto risco de arritmias(32)
Pouca integração estrutural e fisiológica com o tecido hospedeiro(32)
Células-tronco derivadas de medula óssea (mesenquimais, progenitoras endoteliais e hematopoiéticas) Multipotentes
Autólogos
Fáceis de isolar
Alto potencial de expansão
Presença de efeitos adjacentes(43)
Possível angiogênese em locais indesejados(41)
Disponibilidade limitada
Células-tronco mesenquimais Miogênese Diferenciados em fenótipo semelhante a cardiomiócitos(44)
Diferenciação em células endoteliais, conforme visto em caninos(45)
Propriedades imunossupressoras(46)
Alta integração estrutural e fisiológica com tecido hospedeiro(43,45)
Imunogenicidade de células-tronco mesenquimais alógenas(47)
Células progenitoras endoteliais Angiogênese Neovasculogênese(48) Limitação em número e migração celular em pacientes com doenças coronárias(49)
Células-tronco hematopoiéticas Angiogênese Impacto benéfico no remodelamento do ventrículo esquerdo e angiogênese(50) Incapazes de se diferenciar em cardiomiócitos(50)
Células-tronco embrionárias Miogênese Alta proliferação(51)
Pluripotentes(51) Diferenciam-se em cardiomiócitos(32)
Integram com cardiomiócitos do hospedeiro via junções comunicantes(30)
Podem ser pré-tratadas com fatores de crescimento(33)
Dilema ético
Risco de formação de teratoma(51) Alta imunogenicidade(52) Disponibilidade limitada
Células de músculos lisos Miogênese Propriedades elásticas melhoram função cardíaca(35) Imunogenicidade(34)
Não melhoram função contrátil(34)
Células-tronco derivadas de tecido adiposo Angiogênese Miogênese Multipotentes(53)
Alta disponibilidade(36)
Fáceis de isolar(53)
Alta proliferação(36)
Secretam fatores de crescimento(37)
Induzem miogênese e angiogênese(37)
Adesão celular ruim a longo prazo(54)
Sem diferenciação significativa(55)
Células-tronco cardíacas Miogênese Autólogas
Multipotentes(38)
Expandem in vitro(38)
Disponibilidade limitada
Celuals-tronco pluripotentes induzidas Miogênese Pluripotentes
Autólogas
Diferenciam-se em cardiomiócitos(39)
Boa disponibilidade
Grande potencial de expansão
Risco de formação de teratoma(40)

Cultura celular in vitro

O próximo tópico crítico para a criação de um enxerto cardíaco, após a seleção celular, é a cultura celular. De placas a equipamentos especializados em cultura de células (biorreatores), foram feitas pesquisas para estudar como promover a proliferação, o alinhamento, a diferenciação e a maturação celulares in vitro, antes da implantação in vivo.

O potencial para o alinhamento de células no scaffold foi demonstrado em alguns estudos com poliuretano e em cultura de células in vitro em placas. McDevitt et al., demonstraram que os cardiomiócitos poderiam ser cultivados em filmes de poliuretano com padrões de laminina impressos, permitindo o alinhamento bidimensional das células e apresentando resposta contrátil.(11) Rockwood et al., prepararam substratos de cultura de poliuretano biodegradáveis alinhados e desalinhados usando eletrofiação, demonstrando que scaffolds alinhados podem gerar uma organização celular semelhante à do tecido cardíaco nativo.(20)

Para promover o aumento da proliferação, da diferenciação e da maturação celulares, a cultura celular in vitro dos tipos celulares escolhidos é realizada em laboratórios especializados em cultura de células, tanto nas instituições acadêmicas quanto nas indústrias. A infraestrutura padrão inclui salas limpas, incubadoras de dióxido de carbono, armários de segurança biológica, consumíveis de cultura de células estéreis, contadores de células, e outros equipamentos padrão. Em alguns casos,(56) pode ser justificado o uso de biorreatores celulares, baseados unicamente na finalidade de melhorar, refinar e otimizar a qualidade e o rendimento (expansão) da própria célula. O objetivo de empregar tais biorreatores celulares, que podem incluir equipamentos como biorreatores de ondas (GE Xuri, GE Healthcare, Nova Iorque, NI, EUA) e biorreatores de tanque agitado (Applikon, Delft, Holanda; Sartorius, Gottingen, Alemanha; e outros) com microtransportadores para cultura de células aderentes, ou robôs de cultura celular automatizados (SelecT & CompacT SelecT, Sartorius Stedim Biotech, Royston, Reino Unido; sistemas VANTAGE & STAR, Hamilton, Reno, NV, EUA; sistema Freedom EVO, Tecan, Mânnedorf, Suíça; sistema Cytomat 10, Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA e outros), seria melhorar a qualidade e o rendimento viáveis alcançados pelas técnicas tradicionais de cultura celular. Olhando de forma mais ampla a categoria dos equipamentos como um todo, os biorreatores podem ser descritos como sistemas com condições e parâmetros controlados que permitem a estimulação do crescimento celular ou a transformação de substrato em produtos de interesse por células vivas ou seus componentes, como enzimas ou organelas.(56) Sistemas baseados na produção de bioprodutos, como proteínas, lipídeos, entre outros, são chamados de biorreatores de produção.(57) Sistemas que, por outro lado, focam na expansão celular e na terapia celular, para obter as próprias células como produto, são chamados biorreatores de células.(57) Finalmente, os sistemas utilizados para a engenharia de tecidos, procurando obter tecido maduro como resultado, são denominados biorreatores de tecidos.(57)

Muitos tipos de biorreatores foram utilizados para diferentes aplicações em bioprocessos. A diversidade de alternativas de projetos de biorreatores é baseada em parâmetros e condições específicas, como transferência de calor ou gás e homogeneidade, necessárias para cada aplicação. Alguns exemplos de projetos de biorreatores são o tanque-agitado e os reatores tipo airlift.(58)

A possibilidade de criar um ambiente dinâmico com controle mecânico, físico e bioquímico, faz dos biorreatores teciduais uma tecnologia amplamente utilizada na engenharia de tecidos, devido à necessidade de fornecer estímulos apropriados para diferenciação e proliferação celular, e estimular propriedades da MEC adequadas para tecidos em desenvolvimento.(59) Alguns estudos sobre biorreatores engenharia de tecidos, incluem osso,(60) cartilagem(61) e sistema cardiovascular.(62)

No âmbito dos estudos com foco em tecido cardiovascular, têm-se vasos sanguíneos,(63) válvulas cardíacas(57,64) e cultura de tecido cardíaco.(4,6568) O tecido cardíaco é extremamente complexo e os biorreatores podem ajudar a entender melhor a influência de cada parâmetro durante a cultura in vitro (Figura 4). Carrier et al., estudaram e caracterizaram o efeito de diferentes parâmetros, como fonte das células, cultivo celular, fluxo e oxigênio, na estrutura e na função cardíacas, que passaram por processos de engenharia, semeando suspensões bem misturadas de cardiomiócitos em placas misturadas em órbitas e frascos giratórios.(65) Bursac et al., demonstraram que o músculo cardíaco tridimensional poderia ser manipulado usando células isoladas e scaffolds de polímero (PGA) biodegradável, em frascos giratórios, para obter propriedades estruturais e eletrofisiológicas específicas.(6) Papadaki et al., mostraram a correlação entre propriedades moleculares, estruturais e eletrofisiológicas, e como estas podem ser melhoradas com uma alta concentração de miócitos, scaffolds de PGA com superfície hidrolisada, revestida por laminina, usando biorreatores rotativos e um meio com baixo teor de soro.(4) Carrier et al., estudaram o efeito de perfusão na melhora das condições de transporte da cultura e na criação de construtos com distribuições espaciais relativamente uniformes de células cardíacas, usando frascos mistos.(66) Radisic et al., mostraram que a inoculação rápida de células, seguida por perfusão imediata, permitiu o cultivo rápido e uniforme de cardiomiócitos em alta densidade, mantendo a viabilidade celular.(67) Bursac et al,. relataram que cardiomiócitos de ratos recém-nascidos cultivados utilizando biorreatores rotatórios em scaffolds tridimensionais tinham propriedades mais semelhantes ao tecido nativo do que células cultivadas em monocamadas.(68) Gonen-Wadmany et al., estudaram o efeito de um biorreator de estimulação de tensão para aplicar distensão cíclica em construtos cardíacos modificados por engenharia e melhorar a orientação celular in vitro.(69) Lichtenberg et al., relataram o desenvolvimento de um biorreator multifuncional com quatro câmaras e dois compartimentos separados para o cultivo concomitante tridimensional de diferentes tipos de células e condições de cultura.(70) Desta forma, muitos tipos de biorreatores foram projetados para engenharia de tecidos cardíacos, e as diferentes técnicas testadas abriram caminho para um grande número de estratégias possíveis, que podem ser melhoradas, refinadas ou otimizadas, para obter um enxerto ideal de tecido miocárdico maduro.

Fonte: Arquivo pessoal.

Figura 4 Biorreator para tecidos e órgãos Eva Luxor™ com uma traqueia na câmara de órgão, passando pelo processo de descelularização. O mesmo biorreator pode ser utilizado para cultivo de tecido usando meio de cultura celular no lugar de soluções de descelularização (por exemplo, detergentes) 

CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

O coração é um órgão extremamente complexo e as técnicas que influenciam em sua regeneração dependem de muitas variáveis de caráter não triviais. Estas técnicas geralmente se concentram na seleção de material de scaffold, produção de material de scaffold, seleção celular e cultivo celular in vitro. Muitos estudos neste campo já fizeram um enorme progresso, seja em um enxerto ou em um coração bioartificial inteiro. No entanto, muito trabalho ainda precisa ser feito para melhor entender e resolver os desafios experimentais e das tecnologias existentes, melhorando as técnicas atuais e desenvolvendo novas técnicas, protocolos e métodos.

Para a seleção e a estrutura do material, primeiramente, é importante definir o melhor material (sintético, natural ou híbrido) para aplicações cardíacas. Algumas propriedades desejadas para estes materiais são taxas de degradação ajustáveis, boa porosidade, biocompatibilidade, hemocompatibilidade, boa adesão celular, propriedades mecânicas e elásticas compatíveis com o coração, e que o material permita um bom acoplamento elétrico entre as células e entre o scaffold e o tecido nativo.(11,13) Em segundo lugar, é necessário escolher a técnica para produzir o scaffold, na qual as células vão ser semeadas antes da implantação. As perspectivas neste campo concentram-se na obtenção de um scaffold a partir da estrutura tridimensional de um coração inteiro. Além da descelularização, que é promissora para a aplicação em engenharia de tecidos cardíacos, outra tecnologia em destaque é a bioimpressão tridimensional de tecidos e órgãos.(71) A combinação de bioimpressão tridimensional, biorreatores e células-tronco poderia fornecer uma nova tecnologia que permitiria o desenvolvimento do órgão humano da próxima geração.

Para a seleção celular e a expansão in vitro, o primeiro passo essencial é determinar o melhor tipo de célula para a aplicação (células-tronco derivadas da medula óssea, cardiomiócitos, iPSC, entre outros), considerando a disponibilidade e as peculiaridades sobre cada tipo de célula. Depois disso, o cultivo das células in vitro é necessário antes da semeadura e da posterior implantação do tecido. A tecnologia mais eficiente para fornecer a proliferação e a diferenciação destas células é o biorreator. Muitos tipos diferentes de biorreatores para aplicações cardíacas de engenharia de tecidos foram estudados, mas ainda resta determinar quais técnicas são as mais adequadas, com um equilíbrio ideal de vantagens e desvantagens, reconhecendo que nenhuma técnica isolada pode preencher todos os requisitos.

Outras oportunidades para engenharia do tecido miocárdico incluem encontrar a melhor combinação das diferentes técnicas aqui descritas, para conseguir o miocárdio artificial ideal para aplicações clínicas e estudar a influência de outros aspectos, como o melhor momento para implantação, com maior adesão celular no tecido do receptor após um infarto agudo do miocárdio.(18)

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