Expressão aumentada de pendrina na rinossinusite crônica eosinofílica com pólipos

Expressão aumentada de pendrina na rinossinusite crônica eosinofílica com pólipos

Autores:

Taku Ito,
Satoshi Ikeda,
Tomoaki Asamori,
Keiji Honda,
Yoshiyuki Kawashima,
Ken Kitamura,
Keiko Suzuki,
Takeshi Tsutsumi

ARTIGO ORIGINAL

Brazilian Journal of Otorhinolaryngology

versão impressa ISSN 1808-8694versão On-line ISSN 1808-8686

Braz. j. otorhinolaryngol. vol.85 no.6 São Paulo nov./dez. 2019 Epub 13-Dez-2019

http://dx.doi.org/10.1016/j.bjorl.2018.07.005

Introdução

A rinossinusite crônica (RSC) é definida como um processo inflamatório da cavidade nasal e dos seios paranasais com duração de mais de 12 semanas, que provoca bloqueio, obstrução, congestão e secreção nasais.1 A RSC é geralmente dividida em dois subgrupos: com (RSCcPN) e sem (RSCsPN) pólipos nasais. Embora haja uma considerável sobreposição entre essas duas formas de RSC, muitos estudos observaram diferenças nos respectivos perfis inflamatórios e no desfecho do tratamento. Além disso, a RSCcPN pode ser subdividida em rinossinusite crônica eosinofílica (RSCE) e neutrofílica (RSC não E), de acordo com o grau de infiltração eosinofílica nos pólipos nasais.2 A RSCE é caracterizada por polarização de Th2 e expressão acentuada das interleucinas (IL)-4, IL-5 e IL-13.3,4 Por outro lado, o tipo RSC não E exibe inflamação de células T CD8+, na qual o recrutamento de neutrófilos é mediado por IL-1β, IFN-γ, TGF-β1, IL-8, IL-10 e IL-17. Como ambos os subgrupos têm uma capacidade de resposta e um prognóstico muito distintos, diferentes tratamentos médicos têm sido sugeridos para os respectivos pacientes. Portanto, algoritmos diagnósticos apropriados em casos individuais devem ser desenvolvidos para um tratamento médico eficaz.5

A expressão e a função do trocador aniônico, pendrina (SLC26A4), têm sido analisadas principalmente na orelha interna, no rim e na tireoide. Entretanto, dados recentes indicam que a pendrina também é expressa no epitélio brônquico e nasal após exposição a IL-4 e IL-13.68 A expressão da pendrina nas células epiteliais brônquicas é up-regulada na asma brônquica e na doença pulmonar obstrutiva crônica.7 Ambas as doenças envolvem inflamação respiratória, levam à destruição/remodelação tecidual e diminuição da função das vias aéreas. Vários estudos indicam que o aumento da expressão e/ou atividade da pendrina pode contribuir para sua patogênese.9 A pendrina expressa em células epiteliais nasais também pode estar associada à inflamação, produção de muco e diminuição da clearance mucociliar sob algumas condições patológicas.6,10 O nível de expressão da pendrina é maior nos pólipos nasais do que no processo uncinado retirado de pacientes com RSC.6 No entanto, não se sabe quão diferente é o nível ou padrão de expressão da pendrina em pacientes com RSCE e RSC não E. Neste estudo, apresentamos a associação entre o tipo de RSC e a expressão da pendrina em pólipos nasais de pacientes e propomos um novo mecanismo patológico subjacente ao desenvolvimento de RSCE.

Pacientes e método

Pacientes

Uma revisão retrospectiva foi feita para avaliar pacientes com cirurgia endoscópica do sinusal no Departamento de Otorrinolaringologia de abril de 2011 a março de 2016. Foram identificados 68 pacientes com base em seus registros médicos. A RSCcPN foi diagnosticada segundo os sintomas clínicos (rinorreia anterior e/ou posterior, obstrução nasal e diminuição do olfato) com duração de mais de 12 semanas, além de endoscopia nasal e tomografia computadorizada (TC) das cavidades paranasais.1 Não houve casos associados a doenças de base que levassem à RSC secundária, como granulomatose de Wegener, sarcoidose, fibrose cística ou imunodeficiência sistêmica. Pelo menos um mês antes da cirurgia, nenhum paciente foi tratado com esteroides orais ou nasais. Todos os pacientes foram submetidos a tomografia computadorizada (TC), que foi avaliada de acordo com o sistema de pontuação de Lund-MacKay11 por dois otorrinolaringologistas cegados para a informação clínica. Este estudo foi aprovado pelo conselho de ética institucional de nosso hospital (número de aprovação 488) e consentimento livre e informado por escrito foi obtido de todos os pacientes.

Avaliação das contagens de eosinófilos no sangue e nos tecidos

A contagem de eosinófilos no sangue no período pré-operatório foi feita em todos os pacientes. Os pólipos nasais foram fixados em formalina a 10%, embebidos em cera de parafina, processados de maneira rotineira e então preparados como cortes semifinos de rotina (3,0 µm). A coloração com hematoxilina e eosina foi feita para detectar eosinofilia tecidual. O número de eosinófilos em cada amostra de tecido foi contado em três campos que continham o maior grau de infiltração celular com o uso de microscopia óptica (aumento de 400 ×) e as amostras foram classificadas em RSCE ou RSC não E de acordo com o grau (70 células por campo) de infiltração eosinofílica.2

Análise imuno-histoquímica

Para a imunocoloração, os cortes foram reidratados com uma série de álcoois e tratamento térmico com um forno de micro-ondas foi feito em tampão de ácido cítrico em pH 6,0 por 15 min, seguido por resfriamento pelo ar por 20 minutos. O tratamento com peróxido de hidrogênio (H2O2) foi então feito por 10 min para inativar a peroxidase endógena. Anticorpo monoclonal antipendrina de camundongo (código K0143-3; MBL, Nagoya, Japão) e anticorpo policlonal anti-MUC5AC (código NCL-MUC-5AC; Leica Biosystems, Newcastle, Inglaterra) foram adicionados aos cortes e a reação ocorreu em uma câmara de umidade à temperatura ambiente durante 1,5 h. Após a lavagem em solução tampão fosfato durante 30 min, foi feito um método polimérico à temperatura ambiente com um kit Novo Link Polymer (Leica Micro-systems, Tóquio, Japão). Finalmente, a visualização foi feita com 3,3’-diaminobenzidina (inclusive o kit), com contracoloração pela hematoxilina e, em seguida, a desidratação e o uso de lamínulas. A presença ou ausência de expressão da pendrina foi avaliada qualitativamente e as áreas de expressão positivas para MUC5AC foram avaliadas pela média dos três principais campos em termos da abundância de sua expressão (ampliação de ×400, 0,575 mm2) e calculada quantitativamente pelo software Image J.12 Essas avaliações foram feitas sem dados clínicos ou outros dados patológicos.

Análises estatísticas

Os dados foram expressos como média ± DP, conforme apropriado. As análises estatísticas foram avaliadas por meio do coeficiente de correlação de Pearson, teste do χ2 e teste t de Student. Um valor de p < 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

Características clínicas dos pacientes

O grupo de estudo incluiu 44 homens (65%) e 24 mulheres (35%). A média foi de 56,2 anos (18 a 87). Entre eles, 38 pacientes (55,9%) foram diagnosticados com RSCE e 30 (44,1%) como RSC não E, por achado histológico. Oito pacientes (21,1%) no grupo RSCE e 3 (10,0%) no grupo RSC não E apresentavam asma concomitante. Não houve diferenças significativas entre os dois grupos na distribuição de idade, razão entre os sexos, prevalência de asma ou qualquer outra complicação (tabela 1). A contagem média de eosinófilos no sangue no período pré-operatório foi de 400 ± 217 células/µL no grupo RSCE (7,07% ± 4,01%) e 116 ± 97 células/µL no grupo RSC não E (1,85% ± 1,43%), significativamente menor do que no grupo RSCE (p < 0,01) (tabela 1). Os escores médios de Lund-Mackay foram 11,3 ± 5,3 e 9,1 ± 5,8, respectivamente, sugeriram que os pacientes com RSCE eram mais propensos a apresentar doença sinusal extensa (tabela 1). Além disso, cada escore foi positivamente correlacionado com a contagem de eosinófilos no sangue para ambos os grupos (fig. 1).

Tabela 1 Dados comparativos entre RSCE e RSC não E 

RSCE RSC não E p-valor
Total 38 30
Idade (anos) 57,5 54,5 0,42
Sexo (masculino/feminino) 28/10 16/14 0,14
Asma 8 (21,1%) 3 (10,0%) 0,21
Leucócitos totais (cél/µL) 5967 ± 1603 6323 ± 1855 0,40
Eosinófilos no sangue (cél/µL) 400 ± 217 116 ± 97 < 0,01
Eosinófilos no sangue (%) 7,07 ± 4,01 1,85 ± 1,43 < 0,005
Escores de Lund-Mackay 11,3 ± 5,3 9,1 ± 5,8 < 0,05
Expressão de pendrina (n) 20 (52,6%) 6 (20,0%) < 0,05
Expressão de MUC5AC (mm2/campo) 0,090 0,048 < 0,01

Figura 1 Contagem de eosinófilos no sangue correlacionada estatisticamente com o escore de Lund-Mackay para os grupos RSCE (A) e RSC não E (B), respectivamente. 

Expressão de pendrina e MUC5AC

Fizemos a análise imuno-histoquímica para determinar a distribuição de pendrina nos pólipos nasais. A expressão de pendrina foi detectada nas células epiteliais superficiais do pólipo nasal em 20 (52,6%) amostras do grupo RSCE e 6 (20,0%) do grupo RSC não E. Houve diferença significativa entre os dois grupos (p < 0,05) (tabela 1, fig. 2 B e E). A média da área de expressão de MUC5AC foi significativamente maior no grupo RSCE (0,090 mm2/campo) do que no grupo RSC não E (0,048 mm2/campo; p < 0,01), sugeriu que a secreção mucosa seria mais ativada nos pólipos do grupo RSCE. No entanto, os níveis de expressão de pendrina ou MUC5AC também não foram correlacionados com as contagens de eosinófilos no sangue ou escores de Lund-Mackay.

Figura 2 Coloração imuno-histoquímica de pendrina e MUC5AC na mucosa nasal nos grupos RSCE (B e C) e RSC não E (E e F; ampliação original, × 400). Abundante infiltração eosinofílica foi demonstrada no grupo RSCE (A, seta). A coloração para pendrina foi intensa no grupo RSCE (B), mas ausente no grupo RSC não E (E). A expressão de MUC5AC foi amplamente observada no grupo RSCE (C) em comparação com o grupo RSC não E (F). 

Discussão

A pendrina é expressa em uma distribuição tecidual restrita que inclui a orelha interna, a tireoide, o rim, o pulmão e vários outros órgãos.13 A redução da expressão da pendrina resulta em perda auditiva, bócio e aumento do aqueduto vestibular, denominada síndrome de Pendred. De modo inverso, o aumento da expressão da pendrina está relacionado a doenças do trato respiratório inferior, inclusive asma brônquica e doença pulmonar obstrutiva crônica. A patogênese da asma envolve principalmente a ativação de eosinófilos e células T CD4+, com inflamação downstream mediada principalmente por citocinas do tipo Th2 (IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13 e fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos). A exposição à IL-13 induz a hiperresponsividade das vias aéreas, eosinofilia aguda e produção de IgE e muco. A IL-13 aumenta a expressão do RNAm de SLC26A4 (pendrina) e MUC5AC nos tecidos pulmonares e nasais.6,14 No entanto, a expressão de MUC5AC não foi induzida pelo tratamento da IL-13 na ausência da condição da pendrina.15 De maneira oposta, a superexpressão da pendrina nos tecidos pulmonares resultou em aumentos na formação de exsudatos de muco, infiltração neutrofílica e expressão de MUC5AC no lavado broncoalveolar. Em um modelo animal, camundongos knockout para pendrina estimulados com ovalbumina exibiram menos eosinofilia e inflamação do que o tipo selvagem.16 Uma correlação semelhante também foi sugerida em humanos entre a resistência à asma e a síndrome de Pendred.17 Esses dados sugeriram que a pendrina poderia desempenhar um papel patológico importante nas doenças respiratórias superiores e inferiores crônicas.

Além das IL–4/13, várias citocinas ou estímulos ambientais são conhecidos por causar a expressão da pendrina nos tecidos pulmonares. A IL-1β, o interferon-γ e a IL-17 foram listadas como as citocinas que podem induzir a expressão da pendrina.7,16,18 Especialmente a IL-17 é uma citocina pró-inflamatória sintetizada por células Th17 e comumente associada a respostas alérgicas. A expressão de IL-17 pode ser encontrada em eosinófilos, macrófagos e linfócitos de pólipos nasais.19 O número de células positivas para IL-17 foi significativamente correlacionado com o número de células positivas para MUC5AC e com o grau de infiltração de eosinófilos no tecido nasal.20 Além disso, o tratamento combinado de IL-13 e IL-17 induziu sinergisticamente a expressão da pendrina nas células epiteliais nasais cultivadas.6 Mostramos a relação entre pendrina, MUC5AC e infiltração de eosinófilos em nossos casos, mas a pendrina não foi detectável em quase metade dos pólipos do grupo RSCE. Esses resultados sugerem que a infiltração eosinofílica mediada por citocina do tipo Th2 foi importante, mas não suficiente para a expressão da pendrina nasal, e outro tipo de fatores, como a citocina Th17, pode ser necessário para a expressão da pendrina e o desenvolvimento de RSCE.

Foi demonstrado que a pendrina troca ânions e bases através da membrana plasmática. Acredita-se que ela faça a mediação da troca Cl-/HCO3- na orelha interna.21,22 Por outro lado, acredita-se que a pendrina funcione como trocador de Cl-/I no tecido da tireoide23 e pode contribuir para o equilíbrio ácido-base, secretando HCO3 no rim.24 Assim, a pendrina tem diferentes funções de acordo com os tecidos expressos, que é regulada por fatores transcricionais específicos.25 Atualmente, o papel da expressão da pendrina no tecido nasal é desconhecido, mas a mudança no nível de expressão nasal pode influenciar a secreção mucosa e a homeostase local e estar associada ao desenvolvimento de RSCE via incremento, ativação e/ou infiltração tecidual de eosinófilos.

Conclusão

Foram mostradas as características clínicas e diferenças histopatológicas entre pacientes com RSCE e RSC não E no Japão. A contagem de eosinófilos no sangue e os escores de Lund-Mackay foram significativamente maiores no grupo RSCE do que no grupo RSC não E. Maior expressão de pendrina e MUC5AC foi observada no grupo RSCE em comparação com o RSC não E. No entanto, a expressão da pendrina não foi detectada em quase metade dos pólipos no grupo RSCE. A infiltração de eosinófilos seria importante, mas não suficiente para a expressão da pendrina nasal, e outros tipos de fatores podem ser necessários para a expressão da pendrina e o desenvolvimento de RSCE.

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