Introdução

A Isquemia e Reperfusão (IR) tecidual e as alterações celulares e humorais que se seguem têm grande impacto na homeostasia do organismo¹. Embora as espécies reativas de oxigênio (EROs) estejam envolvidas na homeostase, sua presença em quantidades que ultrapassem os limites naturais de defesa celular, pelos antioxidantes e varredores, levará ao desequilíbrio conhecido como estresse oxidativo². Embora o oxigênio seja um substrato crítico para o alívio da isquemia, paradoxalmente funciona como metabólito deletério durante o período de reperfusão^{2 - 5}, predispondo ao comprometimento de órgãos distantes, além das lesões locais⁶.

A IR, e o consequente estresse oxidativo, está associada a condições clínicas e cirúrgicas, tais como: sepse, trauma oclusivo arterial, parada cardíaca, trombose, embolia, vasoespasmo, tumores, transplantes e ressecções de órgãos, acidentes vasculares cerebrais e infarto do miocárdio^{2 , 6 - 8}.

O estresse oxidativo no sistema cardiovascular predispõe a lesões graves nos cardiomiócitos e vasos cardíacos, alterando os mecanismos de contração e relaxamento, tendo como consequência sua desadaptação e déficit de função⁶.

A avaliação da expressão gênica associada ao estresse oxidativo em órgãos a distância oferece uma nova ferramenta para esclarecer vários aspectos do fenômeno, tanto no diagnóstico, monitoramento quanto nos resultados de procedimentos terapêuticos^{9 , 10}. Um recurso tecnológico de uso recente permite avaliar uma grande quantidade de genes de maneira segura e relativamente simplificada pelo método da RT- qPCR (Reverse transcriptase quantitative Polymerase Chain Reaction)^{11 - 14}. Desse modo, tem sido descrita em modelos animais a resposta genômica do coração ao estresse oxidativo provocado por isquemia renal, hepática, mesentérica, a oclusão da aorta infrarrenal da aorta ou isquemia de membros inferiores^{13 - 14}.

Considerando que a isquemia esplâncnica, em especial do intestino delgado, é um evento grave e que além de suas manifestações locais tem repercussões sistêmicas, a proposta desta pesquisa foi avaliar a expressão de 84 genes relacionados ao estresse oxidativo e defesa antioxidante no tecido cardíaco após a isquemia e reperfusão intestinal em um modelo em camundongos isogênicos.

Métodos

A pesquisa foi aprovada pela Comissão de Ética em Pesquisa do Hospital São Paulo vinculado à Universidade Federal de São Paulo-UNIFESP sob o número (1379-1308). O projeto foi ratificado pela Comissão de ética em pesquisa da Universidade Federal da Grande Dourados-UFGD (protocolo 306/08). Os procedimentos experimentais seguiram as normas internacionais de pesquisa em animal e as orientações normativas da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL) e foram mantidos segundo o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Instituto de Pesquisa Animal de Laboratório, 1996).

Resultados

Avaliação da Expressão Gênica

Em 84 genes avaliados no intestino, 65 genes (74,71%) apresentaram expressão positiva, e desses, 37 (44,04%) genes foram hiperexpressos, ou seja, expressão superior a três vezes o limiar estabelecido pelo algoritmo em comparação com o grupo controle (Gráfico 1).

Gráfico 1 Dispersão da expressão dos 84 genes no tecido cardíaco relacionados com o fenômeno de isquemia e reperfusão intestinal nos animais do grupo GC e GIR; a linha preta indica a expressão do nível de normalidade; as linhas rosa indicam o limiar de três vezes da expressão gênica permitida pelo algoritmo. 

Na análise sobre o tecido cardíaco, após a I/R intestinal, ocorreu expressão positiva em 28 (33,33%) genes (Tabela 2). Apenas oito (9,52%) superaram em três vezes o limiar do algoritmo (Tabela 3 e gráfico 2). Quatro genes (4,76%) se expressaram positiva e simultaneamente nos tecidos intestinal e cardíaco (Tabela 4).

Tabela 2 Distribuição de 28 genes dentre os 84 genes investigados no coração com expressão positiva (+) ou expressão negativa (-) 2^(- Delta Delta Ct) nos animais submetidos a 60 min de isquemia do intestino delgado e 60 min de reperfusão em comparação ao grupo controle sem isquemia / reperfusão; (* = valor significante p < 0,05) 

#	Base do Gene	Símbolo do Gene	Nome do Gene	GIR Intestino	P- valor	GIR Coração	P- valor
1	NM_013930	Aass	Aminoadipate-semialdehyde synthase	+19,63*	0,000001	+6,65*	0,01209
2	NM_009696	Apoe	Apolipoprotein E	+1,76*	0,002533	+3,60*	0,01737
3	NM_007985	Fancc	Fanconi anemia. complementation group C	+7,42*	0,000015	+1,87*	0,04313
4	NM_018881	Fmo2	Flavin containing monooxygenase 2	+1,52*	0,019633	+4,93*	0,00772
5	NM_010343	Gpx5	Glutathione peroxidase 5	+5,10*	0,001774	+0,50*	0,03717
6	NM_027127	Gpx8	Glutathione peroxidase 8 (putative)	+1,43	0,072334	+2,19*	0,01271
7	NM_010344	Gsr	Glutathione reductase	+1,64	0,149896	+2,34*	0,02997
8	NM_080420	Lpo	Lactoperoxidase	+23,88*	0,00002	-2,28*	0,00326
9	NM_010877	Ncf2	Neutrophil cytosolic factor 2	+4,31*	0,000018	+2,43*	0,02876
10	NM_010927	Nos2	Nitric oxide synthase 2. inducible	+4,71*	0,000117	+1,31*	0,00129
11	NM_015760	Nox4	NADPH oxidase 4	+12,47*	0,000005	+5,73*	0,02561
12	NM_172204	Noxa1	NADPH oxidase activator 1	+3,06*	0,000083	+1,49*	0,00072
13	NM_027988	Noxo1	NADPH oxidase organizer 1	+1,33*	0,000177	+2,10*	0,03623
14	NM_008750	Nxn	Nucleoredoxin	+1,98*	0,002268	+2,53*	0,036
15	NM_133819	Ppp1r15b	Protein phosphatase 1. regulatory (inhibitor) subunit 15b	+1,06	0,962143	+1,99*	0,04908
16	NM_012021	Prdx5	Peroxiredoxin 5	-1,54*	0,008534	+2,14*	0,01926
17	NM_011186	Psmb5	Proteasome (prosome. macropain) subunit. beta type 5	+1,21	0,078442	+1,32*	0,00488
18	NM_008969	Ptgs1	Prostaglandin-endoperoxide synthase 1	+1,56*	0,012124	+2,94*	0,00004
19	NM_011198	Ptgs2	Prostaglandin-endoperoxide synthase 2	+10,07*	0,000003	+3,94*	0,00691
20	NM_009020	Rag2	Recombination activating gene 2	+15,79*	0,000293	+3,42*	0,04444
21	NM_009127	Scd1	Stearoyl-Coenzyme A desaturase 1	+6,85*	0,00042	+31,73*	0,000099
22	NM_134086	Slc38a1	Solute carrier family 38. member 1	+4,59*	0,000106	+8,86*	0,01516
23	NM_013671	Sod2	Superoxide dismutase 2. mitochondrial	+1,47*	0,009249	-1,80*	0,02156
24	NM_011435	Sod3	Superoxide dismutase 3. extracellular	+2,51*	0,002347	+1,28*	0,00081
25	NM_021883	Tmod1	Tropomodulin 1	+15,01*	0,000161	-1,05*	0,00619
26	NM_023719	Txnip	Thioredoxin interacting protein	+1,87*	0,00026	+2,02*	0,00127
27	NM_009464	Ucp3	Uncoupling protein 3 (mitochondrial. proton carrier)	+15,85*	0,000102	+1,62*	0,01441
28	NM_011701	Vim	Vimentin	+2,20*	0,000155	+2,59*	0,01509

Tabela 3 Distribuição de oito genes hiperexpressos 2^(- Delta Delta Ct) dentre os 84 genes investigados no coração de comparados aos genes expressos no intestino de animais submetidos a 60 min de isquemia do intestino delgado e 60 min de reperfusão em comparação ao grupo controle sem isquemia / reperfusão; (* = valor p < 0,05) 

#	Base do Gene	Símbolo do Gene	Nome do Gene	GIR Intestino	P- valor	GIR Coração	P- valor
1	NM_013930	Aass	Aminoadipate-semialdehyde synthase	+19,64	0,000001*	+6,65	0,012092*
2	NM_009696	Apoe	Apolipoprotein E	+1,94	0,002533*	+3,6	0,017365*
3	NM_018881	Fmo2	Flavin containing monooxygenase 2	+1,6	0,019633*	+4,93	0,007719*
4	NM_015760	Nox4	NADPH oxidase 4	+3,13	0,000005*	+5,73	0,025614*
5	NM_011198	Ptgs2	Prostaglandin-endoperoxide synthase 2	+14,6	0,000003*	+3,94	0,006908*
6	NM_009020	Rag2	Recombination activating gene 2	+10,76	0,000293*	+3,42	0,044442*
7	NM_009127	Scd1	Stearoyl-Coenzyme A desaturase 1	+1,62	0,000420*	+31,73	0,000099*
8	NM_134086	Slc38a1	Solute carrier family 38, member 1	-1,29	0,000106*	+8,86	0,015159*

Gráfico 2 Oito genes relacionados ao estresse oxidativo e com expressão três vezes acima do limiar da permitido pelo algoritmo nos tecidos intestinal e cardíaco. 

Tabela 4 Quantidade e porcentagem da ocorrência de genes hiperexpressos com valores estatisticamente significantes e suas ocorrências simultânea nos tecidos intestinal e cardíaco 

	GIR Intestino		GIR Coração		Ocorrência simultânea
Genes considerados significantes (p < 0,05)	65 (74,71%)		28 (33,33%)		24 (28,57%)
Genes considerados hiperexpressos	37 (44,04%)		8 (9,52%)		4 (4,76%)

Avaliação Histológica

Na avaliação histológica qualitativa as amostras dos tecidos do coração dos animais pertencentes aos dois grupos de estudo estavam constituídos por vários feixes de fibras musculares cardíacas separados uns dos outros por fibras colágenas do tipo I. Esses feixes estavam formados por células musculares cárdicas, de forma alongada com um ou dois núcleos em posição central, contendo no citoplasma estriações transversais. Ao redor dos cardiomiócitos nota-se a presença de células do tecido conjuntivo, fibras colágenas tipo III e capilares sanguíneos.

No GC observaram-se cardiomiócitos contendo um ou dois núcleos volumosos e nucléolos bem evidentes (Figura 1). No grupo GIR (uma hora de isquemia e uma hora de reperfusão) notaram-se cardiomiócitos de menor tamanho com núcleos picnóticos mais escuros, ricos em heterocromatina e raros nucléolos, indicando sofrimento cardíaco (Figura 2).

Figura 1 Fotomicrografia do ventrículo esquerdo de camundongo pertencente ao Grupo Controle (GC). Notar os núcleos de cardiomiócitos centralizados na célula, volumosos e eucromáticos (setas amarelas); vasos íntegros sem extravasamento de hemácias (setas azuis); fibras cardíacas dispostas regularmente. (HE 400x). 

Figura 2 Fotomicrografia mostrando ventrículo esquerdo de camundongo pertencente ao grupo isquemia e reperfusão (GIR). Notar núcleos dos cardiomiócitos na periferia celular (seta branca), de volume diminuído e picnóticos (setas amarelas); células edemaciadas e desestruturação da direção das fibras cardíacas. (HE 400x). 

Discussão

Os dados coletados na pesquisa sobre estresse oxidativo e resposta antioxidante celular mostraram que, num modelo de isquemia intestinal em curto prazo (uma hora de isquemia seguida de uma hora de reperfusão) em camundongos isogênicos, ocorreu a expressão positiva de determinados genes no tecido cardíaco (Tabela 2 e gráfico 1).

A análise global permite afirmar que a isquemia intestinal seguida de reperfusão é um fenômeno intimamente relacionado à geração e modulação das espécies reativas de oxigênio. As alterações locais no intestino promoveram respostas humorais e celulares que, disseminadas pela corrente sanguínea, afetaram o aparato genômico do tecido cardíaco induzindo respostas de expressão gênica relacionadas à geração e modulação de EROs.

O gene Aminoadipate-semialdehyde synthase (Aass) codifica uma proteína peroxidase com atividade catalisadora cujos substratos são o peróxido de hidrogênio e os hidroperóxidos orgânicos. Está presente na maioria dos tecidos, funcionando como uma enzima bifuncional degradando a lisina até acetilcoenzima A (acetil-CoA) por duas vias metabólicas distintas (sacaropina e ácido pipecólico)^{16 , 17}. A lisina causa lipoperoxidação diminuindo a concentração de glutationa peroxidases e comprometendo as defesas antioxidantes celulares. Atua causando a inibição da Na⁺/K⁺-ATPase com alterações dos mecanismos de troca iônica na membrana celular, sendo indutora do estresse oxidativo^{18 , 19}. A degradação da lisina pela acetilação atua na motilidade do miocárdio, aumentando a velocidade de deslizamento da actina-miosina em comparação com as suas respectivas isoformas não acetiladas¹⁹. Em razão das atividades conhecidas da enzima codificada pelo gene Aass é possível inferir que a sua hiperexpressão no tecido cardíaco esteve associada à proteção do tecido cardíaco da ação deletéria das EROs.

A prostaglandina-endoperóxido sintetase (Ptgs-2) é uma peroxidase com a função de converter o ácido araquidônico em prostaglandina e está associada às lesões causadas pelo processo inflamatório e proliferação celular²⁰. Ela tem duas funções no processo inflamatório: inicialmente contribui para o aparecimento da inflamação e posteriormente atua na resolução do processo^{21 , 22}. A Ptgs2 não é detectável nas células em condições normais, porém está presente em resposta a citocinas inflamatórias em diferentes tipos celulares e situações de estresse oxidativo. Há relato de sua presença no miocárdio em várias doenças concorrendo para a falência cardíaca. No contexto desta pesquisa a hiperexpressão do gene Ptgs2 mostrou que o tecido miocárdio é sensível a isquemia intestinal respondendo de modo defensivo contra o estresse oxidativo²².

Os processos de neutralização de xenobióticos, entre eles aminas, sulfuretos e alguns compostos de fósforo e selênio, são executados por uma enzima da família das mono oxigenases (Fmo2) que contêm o nucleotídeo flavina. A reação é dependente da presença do NADPH (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato hidrogenase). Na ausência de NADP (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato) a Fmo2 funcionaria como uma NADPH-oxidase que consome NADPH e causa estresse oxidativo, mediante a produção excessiva de peróxido de hidrogênio²³. Mamíferos expressam cinco diferentes mono-oxigenases, e a isoforma Fmo2 é a mais prevalente Estudo em humanos associou a Fmo2 com a maior resistência ao estresse oxidativo causado por fatores ambientais^{24 , 25}. Nesta pesquisa a hiperexpressão do gene Fmo2 sugere que a isquemia intestinal induziu a codificação da proteína para a defesa antioxidante do tecido cardíaco.

A NADPH oxidase (Nox) é um grupo de sete enzimas oxidases com manifestação intracelular, perinuclear e presente em diversos tecidos. É relevante sua presença no tecido cardiovascular, embora sem distinção clara entre miócitos e demais componentes vasculares. A Nox4 é a isoforma envolvida na produção de EROs, predominantemente de peróxido de hidrogênio e em menor escala do ânion superóxido²⁶. Está envolvida na detecção de oxigênio, controle vasomotor, proliferação celular, diferenciação, migração, apoptose, senescência, fibrose e angiogênese²⁷. Citocinas inflamatórias, entre elas a TNF-alfa, funcionam como moduladoras da expressão do gene Nox4²⁸. Ambas desempenham um papel relevante na patogênese das doenças cardiovasculares estimulando a via extrínseca na formação de um complexo de sinalização indutor de morte celular, conduzindo à ativação da cascata de caspases. Fica evidente a correlação delas em doenças cardiovasculares (aterosclerose, hipertensão arterial, insuficiência cardíaca e acidente vascular cerebral isquêmico)^{26 , 28 , 29}. A sua hiperexpressão evidencia que a isquemia/reperfusão intestinal teve um efeito deletério sobre o coração. O efeito pôde ser constatado morfologicamente pelas alterações identificadas nas lâminas coradas pela HE (Figura 2).

A apoliproteína E (Apoe) é fundamental para o metabolismo normal dos componentes lipoprotéicos de triglicérides e colesterol. Primariamente produzida pelo fígado e macrófagos, atua no transporte do colesterol, proteção às células endoteliais dos vasos, tem aparente ação em doenças neurológicas, e exerce funções imunomoduladoras in vitro diminuindo proliferação de linfócitos após o estímulo mitogênico³⁰. Há relatos da sua ação ante a isquemia agindo como antioxidante, protegendo células de diferentes tecidos, como o endotélio contra o efeito tóxico do peróxido de hidrogênio^{31 - 34}. Considerando as atividades da Apoe nos diferentes tecidos, pode-se levantar a hipótese de que ante o estresse oxidativo do nosso modelo experimental houve uma resposta de proteção dos efeitos deletérios das EROs sobre o coração.

O gene Rag2 (recombination-activating gene 2) codifica uma das peroxidases que desempenham papel importante no rearranjo e recombinação dos genes das imunoglobulinas e dos receptores moleculares de células T²⁷. É uma multiproteína complexa, mediadora da fase de clivagem de DNA durante recombinação. As proteínas RAG1 E RAG2 são essenciais para a maturação dos linfócitos bursa (B) e timo (T) dependentes. Os dois tipos celulares são fundamentais na adaptação do sistema imunológico³⁵. As peroxidases são conhecidas por desempenhar um papel na modulação do estresse oxidativo^{35 , 36}. A hiperexpressão da Rag2 pode estar associada à necessidade de ajustes na replicação celular cardíaca devido à presença de excessiva quantidade de EROs, em especial o peróxido de hidrogênio e os hidroperóxidos orgânicos, mostrando uma ação de proteção aos efeitos deletérios das EROs.

A proteína codificada pelo gene Scd1 (Stearoyl-Coenzyme A desaturase 1) catalisa a síntese de ácidos graxos insaturados e seu principal produto é o ácido oleico, formado pela dessaturação do ácido esteárico, e está agrupada na família de enzimas relacionadas às espécies reativas de oxigênio³⁷. A deficiência de Scd1 aumenta a taxa de oxidação de ácidos graxos no fígado e no músculo esquelético. Quanto maior essa taxa, maior é a probabilidade de que a deficiência de Scd1 venha a alterar o metabolismo cardíaco invertendo a proporção do substrato energético entre ácidos graxos e glicose disponível para o coração³⁸. A incompatibilidade entre a absorção e utilização de ácidos graxos de cadeia longa pelo miocárdio leva a concentração anormalmente elevada de ácido graxo intracelular, induzindo a disfunção do miocárdio³⁷. Na presente pesquisa, a hiperexpressão do gene no tecido cardíaco pode estar relacionada à necessidade de maior aproveitamento das gorduras em substituição ao substrato oxidável dependente da glicose, na tentativa de reparar o desequilíbrio metabólico cardíaco.

A proteína codificada pelo gene Slc38a1 (Solute carrier family 38) é transportadora de aminoácidos de ocorrência predominante no coração, no cérebro e na placenta. Transportadores de soluto são proteínas da membrana eucariótica que controlam a absorção e efluxo de diferentes solutos, incluindo aminoácidos, açúcares e fármacos³⁹. Os aminoácidos são necessários para uma ampla variedade de importantes processos biológicos celulares como na produção do tiol glutationa (GSH) catalisada pela presença da cisteína também necessária para outras reações no tecido do miocárdio e fornecida pela proteína transportadora Slc38a1⁴⁰. A vigência do estresse oxidativo estimula sua captação provocando aumentos de expressão Slc38A1 no miocárdio de mamíferos, consequentemente com maior presença de (GSH)^{39 , 40}. No presente estudo a hiperexpressão do gene Slc38a1 corrobora a afirmação de sua ação similar em outros tecidos e mostra que sua presença pode implicar uma ação protetora no mecanismo de transporte energético da célula miocárdica.

O racional desta pesquisa foi traçar o perfil de resposta gênica do tecido cardíaco quando submetido a estímulos provenientes de órgãos a distância atingidos pelo estresse oxidativo. Dados o ineditismo dos resultados e a complexidade da expressão gênica, a ratificação dos resultados fica na dependência de confirmação posterior através da proteômica, onde a identificação e a quantificação da proteína no tecido poderão fornecer subsídios que permitam verificar se a expressão gênica funcionou como estímulo real de codificação proteica ou se a expressão está relacionada à sinalização ou modulação de outras vias metabólicas de resposta ao estresse oxidativo. Como ponto de partida para futuras pesquisas o mapeamento realizado permitiu identificar oito genes que se mostraram mais responsíveis ao estresse oxidativo que, portanto, devam ser inicialmente focados como novo objeto de estudo. A linha de pesquisa é promissora, pois o entendimento da expressão gênica poderá produzir procedimentos de monitoramento da evolução e tratamento da síndrome de falência de múltiplos órgãos e especificamente na participação do tecido cardíaco nesse fenômeno.

Conclusões

No perfil traçado para a resposta gênica associada ao estresse oxidativo foram identificados oito genes no tecido cardíaco que respondem com hiperexpressão quando o intestino é submetido a isquemia e reperfusão. O estudo abre perspectiva de organizar um protocolo de monitoramento em situações clínicas de isquemia e reperfusão a partir da expressão gênica em tempo real.

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Somaio Neto F, Fagundes DJ; Obtenção de dados, Análise e interpretação dos dados e Redação do manuscrito: Somaio Neto F, Ikejiri AT, Bertoletto PR, Chaves JCB, Teruya R, Fagundes DJ, Taha MO; Análise estatística: Somaio Neto F, Teruya R, Fagundes DJ; Obtenção de financiamento: Somaio Neto F, Ikejiri AT, Bertoletto PR, Chaves JCB, Taha MO; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual: Fagundes DJ.