FIPLIQ: uma solução alternativa para exames citológicos ginecológicos e bucais

FIPLIQ: uma solução alternativa para exames citológicos ginecológicos e bucais

Autores:

Michelli Aparecida B. Silva,
Thiago B. D. Batista,
Bruna F. Duarte,
Maria Suely S. Leonart

ARTIGO ORIGINAL

Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial

versão impressa ISSN 1676-2444versão On-line ISSN 1678-4774

J. Bras. Patol. Med. Lab. vol.55 no.5 Rio de Janeiro set./out. 2019 Epub 11-Nov-2019

http://dx.doi.org/10.5935/1676-2444.20190043

INTRODUÇÃO

O exame convencional de Papanicolaou, amplamente utilizado em estudos populacionais, apresenta limitações quanto à adequação da amostra, do transporte, da preservação, da fixação e da representatividade(1-3).

Vários autores apoiam o uso da citologia em base líquida para o teste de triagem cervical, apontando vantagens, como ser menos invasiva e apresentar melhor distribuição celular e esfregaços representativos, com menos resultados falso-negativos. Um aprimoramento na triagem de pacientes de alto risco ao utilizar ensaios moleculares, além da citologia em meio líquido, foi relatado(4-8). No entanto, o alto custo da citologia em meio líquido é um fator limitante para seu uso na triagem populacional em larga escala para o câncer do colo do útero(9-11). Dessa forma, é relevante o desenvolvimento de alternativas adequadas e acessíveis que melhorem o método citológico convencional (exame Papanicolaou).

OBJETIVOS

O objetivo deste estudo foi desenvolver uma solução adequada para a preservação de amostras para exames citológicos.

MATERIAL E MÉTODOS

Fase I

Amostras da mucosa bucal foram coletadas de 10 voluntários de ambos os sexos, com idade entre 20 e 30 anos, não alcoolistas e não fumantes. A mucosa bucal foi esfoliada com escova de citologia cônica (Kolplast®, São Paulo, Brasil) e transferida para um tubo Falcon de plástico de 15 ml (Becton Dickinson®, New Jersey, EUA), contendo 2 ml de teste em meio líquido. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Setor de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Paraná (UFPR), sob parecer de nº 777.445, de 20 de agosto de 2014. No mesmo dia e após três, cinco e 10 dias de armazenamento à temperatura ambiente, as amostras foram homogeneizadas por 20 s (AP56 Vortex Phoenix, Labor, São Paulo, Brasil) e centrifugadas a 289 × g por 5 min (centrífuga Sigma 4k15). Em seguida, o sobrenadante foi descartado por inversão e o sedimento foi ressuspenso em 100 µl de solução de teste e homogeneizado em vórtex. Os esfregaços foram executados pela distribuição de 50 µl do sedimento em lâmina de vidro, circularmente com ponta de pipeta, secos à temperatura ambiente e em seguida fixados com etanol absoluto, por 30 min, corados pelo método de coloração Papanicolaou (Newprov®, Pinhais, Brasil) e montados com Entellan (Merck®, Darmstadt, Alemanha). Foram testadas 127 composições diferentes com os seguintes elementos: etanol, metanol, ácido acético, isopropanol, formaldeído e glutaraldeído (Tabela 1). Os meios líquidos com solução isotônica de tampão fosfato-salino, pH 7,4 foram avaliados. As lâminas foram analisadas por três citologistas, individualmente. Um mapeamento horizontal sistemático foi realizado utilizando um microscópio óptico (100×, 400×; Nikon E200), de acordo com critérios citomorfológicos bem estabelecidos(12-16). Após a preservação celular, coloração do núcleo e citoplasma, o agora denominado FIPLIQ (formaldeído 1 ml/dl e isopropanol 1 ml/dl em solução isotônica de tampão fosfato-salino, pH 7,4) foi selecionado para avaliação adicional de celularidade, sobreposição celular, presença de microrganismos e análise de artefatos. Os critérios utilizados para descarte das soluções em meio líquido consideradas insatisfatórias são: cromatina mal definida e distorção significativa na morfologia celular.

TABELA 1 Reagentes testados e relações em diferentes composições de base líquida 

Reagentes Etanol Metanol Ácido acético Isopropanol Formaldeído Glutaraldeído
Concentração medida (ml/dl) 99,5
97
95
70
77
50
30
20
10
1 0,3 80
70
50
22
20
3
2
1
1
0,5
3
1
0,5

Fase II

Amostras cervicais de 20 mulheres com idade entre 19 e 64 anos foram utilizadas para a avaliação da solução selecionada. Para citologia convencional (grupo-controle), foi coletado material da junção escamocolunar (JEC) com espátula de Ayre, enquanto as células endocervicais com escova cônica (Kolplast®, São Paulo, Brasil). O material foi aplicado em uma lâmina de microscópio e imediatamente fixado em etanol absoluto. Em seguida, o material restante foi transferido para um tubo Falcon de plástico de 15 ml (Becton Dickinson®, New Jersey, USA) contendo 2 ml de solução FIPLIQ. No mesmo dia, e aos três, sete e 15 dias após o armazenamento à temperatura ambiente, as amostras foram processadas em solução de meio líquido como no item anterior. Nessa etapa, a análise citológica incluiu adequação e qualidade das amostras; tipos e estágios de diferenciação celular observados; presença de microrganismos; e alterações celulares reativas, reparativas, pré- -neoplásicas e neoplásicas, estabelecendo comparações entre amostras processadas pelos métodos convencional e em meio líquido.

RESULTADOS

Entre as 127 formulações diferentes testadas com material citológico bucal, foram selecionadas oito formulações em meio líquido que apresentaram os melhores resultados de conservação (Tabela 2). O melhor meio líquido nesta fase foi o FIPLIQ, o qual foi testado na fase II com amostras de colo uterino. Nessa fase, a análise das amostras processadas com FIPLIQ apresentou os melhores resultados qualitativos em comparação com o exame de Papanicolaou convencional. Algumas amostras de FIPLIQ apresentaram citólise e células sobrepostas, mas isso não foi suficiente para determinar a não conformidade do método. Em apenas duas amostras com FIPLIQ observou-se obscurecimento por leucócitos polimorfonucleares, determinando suas exclusões (Tabela 3). Os tipos de células, microrganismos, alterações celulares reparadoras, degenerativas, pré-neoplásicas e neoplásicas observadas em amostras com FIPLIQ no período de 15 dias de preservação foram similares àquelas observadas na metodologia convencional (Tabela 4; Figuras 1-5). Não houve diferença estatisticamente significante entre as metodologias testadas (teste z, p = 0,05).

TABELA 2 Testes preliminares: avaliação da qualidade citológica do esfregaço de mucosa oral após três dias de preservação 

Composições de base-líquida Núcleo
corado
Citoplasma
corado
Preservação
celular
Sobreposição
celular
Artefatos
Formaldeído 1 ml/dl; isopropanol 1 ml/dl; PBS AS AS AS AI AS
Etanol 20 ml/dl; formaldeído 1 ml/dl; isopropanol 1 ml/dl; PBS AS AS AS AI AS
Etanol 20 ml/dl; formaldeído 3 ml/dl; isopropanol 1 ml/dl; PBS AS AS AS AI AS
Etanol 50 ml/dl; formaldeído 1 ml/dl; metanol 1 ml/dl; isopropanol 1 ml/dl; PBS AS AS AS AI AS
Etanol 10 ml/dl; formaldeído 1 ml/dl; metanol 1 ml/dl; isopropanol 1 ml/dl; PBS AS AS AS AI AS
Etanol 50 ml/dl; formaldeído 1 ml/dl; metanol 1 ml/dl; isopropanol 10 ml/dl; PBS AS AS AS AI AS
Formaldeído 1 ml/dl; isopropanol 20 ml/dl; PBS AS AS AS AI AS
FIPLIQ AS AS AS AS AS

PBS: solução de tampão fosfato-salino, pH 7,4; FIPLIQ: fosfato de formaldeído-isopropanol; AS: amostra satisfatória; AI: amostra insatisfatória.

TABELA 3 Avaliação da adequação e da qualidade das amostras pelo exame de Papanicolaou e pelo FIPLIQ 

Parâmetros Esfregaço de Papanicolaou FIPLIQ 0 dias FIPLIQ 3 dias FIPLIQ 7 dias FIPLIQ 15 dias
Formato celular 20 20 20 20 20
Preservação celular 20 19 18 19 20
Detalhes da cromatina 20 19 19 19 20
Celularidade 20 20 20 20 20
Citólise 20 19 17 19 19
Sobreposição celular 15 15 19 18 20
Obscurecido por leucócitos PMN 20 18 18 18 18
Obscurecido por hemácias 20 20 20 20 20

Formato celular: sem alterações significativas; preservação celular: características citológicas suficientes para reconhecê-la; detalhes da cromatina: visível; celularidade: suficiente; citólise: sem ocorrência significativa; sobreposição celular: não elevada; obscurecido por leucócitos PMN; obscurecido por hemácias: não mais que 70% da área de esfregaço (n = 20).FIPLIQ: fosfato de formaldeído-isopropanol; PMN: polimorfonuclear.

TABELA 4 Alterações reativas, reparativas, degenerativas, pré-neoplásicas e neoplásicas em amostras de células cervicais por Papanicolaou e FIPLIQ, no mesmo dia e após 0, 3, 7 e 15 dias de preservação 

Alterações Exame Papanicolaou FIPLIQ 0 dias FIPLIQ 3 dias FIPLIQ 7 dias FIPLIQ 15 dias
Policromasia 13 16 15 16 16
Vacuolização citoplasmática 3 3 3 3 3
Halos perinucleares 16 13 10 14 14
Grânulos de cerato-hialina 3 3 3 3 3
Bordas mais externas do citoplasma 9 6 6 8 6
Coilócitos 2 1 1 2 2
Queratose 12 16 11 15 13
Espessamento da margem nuclear 2 5 5 5 4
Cariorrexe 2 2 1 1 1
Aumento nuclear 18 17 17 17 17
Binucleação 10 15 16 15 15
Cariopicnose* 12 12 12 10 12
Núcleos lisados 2 1 2 3 1
Hipercromasia 9 6 8 8 8
Proporção de núcleo/citoplasma aumentada 7 8 8 8 8
Cariomegalia 4 4 4 4 4
Cromatina aglomeradas e com irregularidades 4 2 2 2 2

FIPLIQ: fosfato de formaldeído-isopropanol;

*presença de cariopicnose, exceto em células superficiais.

FIGURA 1 Tipos celulares em amostras cervicais no exame de Papanicolaou e FIPLIQ após 0, 3, 7 e 15 dias de preservação celularNão houve diferença estatisticamente significante (teste z, p = 0,05).FIPLIQ: fosfato de formaldeído-isopropanol; CES: células escamosas superficiais; CEI: células escamosas intermediárias; CEP: células epiteliais parabasais; CM: células metaplásicas; CE: células endocervicais. 

FIGURA 2 Leucócitos polimorfonucleares, histiócitos e sangue em amostras cervicais de Papanicolaou e FIPLIQ após 0, 3, 7 e 15 dias de preservação celularNão houve diferença estatisticamente significante (teste z, p = 0,05).FIPLIQ: fosfato de formaldeído-isopropanol; LP: leucócitos polimorfonucleares; HIST: histiócitos; H: hemácias. 

FIGURA 3 Fotomicrografias de tipos celulares observadas em amostras cervicais por exame de Papanicolaou (A) e preservadas em FIPLIQ após 15 dias (B). Papanicolaou, 400×FIPLIQ: fosfato de formaldeído-isopropanol; LP: leucócitos polimorfonucleares; CES: células escamosas superficiais; CEI: células escamosas intermediárias; CM: células metaplásicas; CE: células endocervicais. 

FIGURA 4 Fotomicrografias de microrganismos observadas em amostras cervicais por exame Papanicolaou (A) e preservadas em FIPLIQ após 15 dias (B). Papanicolaou, 400×FIPLIQ: fosfato de formaldeído-isopropanol; Cspp: Candida spp.; Gv: Gardnerella vaginallis; Lspp: Leptothrix spp. 

FIGURA 5 Anormalidades citológicas em células cervicais pelo exame de Papanicolaou (A) e preservadas em FIPLIQ após 15 dias. Papanicolaou, 400×FIPLIQ: fosfato de formaldeído-isopropanol. 

DISCUSSÃO

A metodologia de Papanicolaou tem sido questionada em alguns estudos que apontam para níveis de sensibilidade dos esfregaços citológicos convencionais com representação inadequada de tipos celulares. A citologia em meio líquido tem sido descrita como uma melhora do esfregaço citológico convencional, pois está relacionada com a qualidade da amostra, além de destacar a possibilidade de exames complementares no material coletado(1-4,17-19). Por ser um método mais caro que o exame de Papanicolaou convencional, a implementação da citologia em meio líquido nos sistemas públicos de saúde nos países em desenvolvimento não é viável(11,20,21). Este estudo preliminar procurou desenvolver alternativas mais acessíveis com base no custo. Em testes com o FIPLIQ, o JEC permaneceu intacto em ambas as metodologias, independentemente do tempo de preservação, revelando a adequação da coleta e a conservação morfológica das células. A distinção entre os tipos celulares foi mantida, permitindo sua detecção (Figuras 1-3). A reprodutibilidade entre os métodos que se referem à presença de microrganismos e alterações citológicas também foi estudada (Figura 4). Além disso, a taxa de detecção de anormalidades epiteliais em ambas as preparações foi semelhante (Tabela 2; Figura 5).

Ao comparar as amostras de Papanicolaou e de FIPLIQ, observou-se semelhança em relação à adequação e à qualidade das amostras (Tabela 1). Alguns estudos relatam que a citologia em meio líquido apresentou sensibilidade e especificidade equivalentes aos esfregaços convencionais de Papanicolaou e indicou substancial vantagem da citologia em meio líquido devido à possibilidade de se realizar outros testes com as amostras(2,19,22).

Outros autores, em estudos sobre comparações para o desempenho de amostras citológicas bucais pelo exame de Papanicolaou convencional e em meio líquido, observaram que a sobreposição celular, embora reduzida, não é eliminada pela solução em meio líquido(22,23). A preparação de amostras citológicas é difícil de padronizar, considerando a heterogeneidade das amostras coletadas em relação à celularidade e a outros fatores, que podem não estar sob o controle do técnico, tanto no momento da coleta como no processamento das amostras. Neste trabalho, a sobreposição de células foi um inconveniente em alguns casos.

CONCLUSÃO

Os resultados obtidos sugerem que o FIPLIQ apresentou similaridade em relação à adequação e à qualidade das amostras quando comparados com os do Papanicolaou. Ele pode ser utilizado para preservação de amostras citológicas da mucosa cervicovaginal por 15 dias com preservação celular e preparação de esfregaços de qualidade. Novos estudos podem investigar a adequação do método a outros tipos de amostras citológicas.

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