Identificação dos principais genes envolvidos no carcinoma nasofaríngeo

Identificação dos principais genes envolvidos no carcinoma nasofaríngeo

Autores:

Xue Jiang,
Lichun Feng,
Baoqiang Dai,
Liping Li,
Weiwei Lu

ARTIGO ORIGINAL

Brazilian Journal of Otorhinolaryngology

versão impressa ISSN 1808-8694versão On-line ISSN 1808-8686

Braz. j. otorhinolaryngol. vol.83 no.6 São Paulo nov./dez. 2017

http://dx.doi.org/10.1016/j.bjorl.2016.09.003

Introdução

O câncer de nasofaringe mais comum, o carcinoma nasofaríngeo (CNF), causou 86.700 novos casos e 50.800 mortes no mundo em 2012.1 O CNF é extremamente comum no sudeste da Ásia e no sul da China, com mais de 50.000 novos casos por ano,2,3 e pode ser induzido por vários fatores, como hereditariedade, fatores virais e influências ambientais.4 A maioria dos casos de CNF está correlacionada à infecção pelo vírus Epstein-Barr (EBV), um herpesvírus B-linfotrópico que tem propriedades de transformação de crescimento.5 Assim, o estudo dos mecanismos do CNF é de grande importância.

Muitos estudos que investigam os mecanismos de CNF foram publicados. Existem vários genes (como C-myc, AKT1, p53, MDM2, LMP1 e PTEN) implicados na patogenia do CNF, porque eles são muitas vezes amplificados ou alterados em pacientes com essa doença.6-8 O Disabled 2 (DAB2) é frequentemente infrarregulado por hipermetilação do promotor e pode ser um supressor tumoral potencial no CNF.9 Estudos anteriores mostram que o potencial gene supressor tumoral de uma desintegrina e metaloprotease com motivos trombospondina 9 tipo 1 (ADAMTS9) está estreitamente relacionado com metástases para linfonodos e pode inibir o crescimento do tumor por meio da supressão da angiogênese no CNF.10,11 O complexo 1 da proteína relacionada com o adaptador (AP-1) do fator de transcrição (TF) ativado pelo antígeno nuclear 1 codificado pelo EBV (EBNA 1) pode ter como alvo o fator-1α induzido por hipóxia, interleucina 8 e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), que promove a formação de microtúbulos em células do CNF.12 O TF forkhead Box M1 (FOXM1) está envolvido no desenvolvimento do tumor e o vetor do adenovírus AdFOXM1shRNA, que expressa short hairpin RNA específico de FOXM1, pode ser usado como intervenção terapêutica para o tratamento de pacientes com CNF.13 Por infrarregulação da expressão da proteína secretada, ácida e rica em cisteína (SPARC), a região de determinação do sexo do TF Y-box 5 (SOX-5) atua na progressão do CNF e pode ser usado como um preditor para o prognóstico sombrio de CNF.14,15 Embora esses estudos tenham sido feitos para investigar CNF, seus mecanismos ainda permanecem obscuros.

Em 2006, Sengupta et al. analisaram a expressão de todos os genes de EBV latentes entre amostras de CNF e amostras de epitélio da nasofaringe normais e obtiveram um painel de genes diferencialmente expressos (GDE).3 Com os mesmos dados empregados por Sengupta et al.,3 não só foram selecionados os GDE, mas também foi feita uma análise bioinformática abrangente para identificar os principais genes associados ao CNF. As funções potenciais dos GDE foram previstas por análises funcionais e da via de enriquecimento. Além disso, uma rede reguladora TF-GDE foi construída para investigar as relações de regulação entre TF e GDE.

Método

Dados de microarray

Os dados do perfil de expressão de GSE12452 depositados por Sengupta et al.3 foram obtidos do banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), que se baseou na plataforma do GPL570 [HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array. Os espécimes incluíram 31 amostras de CNF e 10 amostras de tecido de nasofaringe normais coletadas de pacientes de Taiwan, com consentimento informado. As amostras foram ressecadas, rapidamente congeladas e armazenadas em nitrogênio líquido.

Triagem para GDE

Para o conjunto de dados GSE12452, o método Robust MultiArray Averaging (RMA) no kit Partek® Genomics Suite™ (PGS) (http://www.partek.com/)16 foi usado para pré-processamento, inclusive o ajuste de fundo, a normalização de quantil e a transformação log2. Após a correção do lote, foi obtida a matriz de expressão processada. O método Anova (análise de variância) no kit PGS16 foi usado para comparar os GDE entre as amostras de CNF e as de tecidos normais da nasofaringe. Os valores de p obtidos foram ajustados para testes múltiplos com o método de Benjamini & Hochberg.17 Genes com fold-change (FC) > 2 e valor p ajustado < 0,05 foram selecionados como GDE.

Análise funcional e de via de enriquecimento

Os termos de ontologia do gene (OG) podem ser usados para descrever os três tipos de produtos de genes, inclusive o processo biológico no qual eles estão implicados, sua função molecular e localização subcelular.18 A Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) é um banco de dados composto por genes e suas informações funcionais.19 Com o plug-in BiNGO20, em Cytoscape (http://www.cytoscape.org/), e análise de enriquecimento da via no kit PGS,16 análises de enriquecimento da via GO e KEGG foram feitas separadamente para GDE entre as amostras de CNF e amostras de tecidos normais da nasofaringe. O valor p ajustado < 0,05 foi usado como o critério de corte.

Construção da rede reguladora TF-GDE

O pacote de software Genomatix Suite (https://www.genomatix.de/)21 foi usado para prever fatores de transcrição (TF). Em resumo, a ferramenta Gene2Promoter (http://www.genomatix.de)22 foi usada para extrair sequências promotoras de GDE correspondentes a partir da base de dados Genomatix. Em seguida, os TF foram analisados com a ferramenta MatInspector.21 TF com um valor de p < 0,05 e FC > 2 foram selecionados como TF expressos diferencialmente, e, em seguida, os seus correspondentes pares de TF-GDE foram analisados. Finalmente, a rede reguladora TF-GDE foi visualizada com o software Cytoscape.23

Resultados

Análise de GDE

Após o GSE12452 ser baixado, os dados de perfil de expressão foram pré-processados e, em seguida, os GDE foram identificados por Anova com o kit PGS. O gráfico volcano para GDE, separadamente, é mostrado na figura 1. Foram selecionados 487 genes como GDE entre as amostras de CNF e as amostras de tecidos nasofaríngeos normais, inclusive 122 genes suprarregulados e 365 infrarregulados. O número de genes infrarregulados foi maior do que o número de genes suprarregulados. No heat map da análise hierárquica de agrupamento para os GDE, as amostras do CNF e as amostras de tecidos normais da nasofaringe eram claramente divididas em dois grupos (fig. 2).

Figura 1 Gráfico volcano para genes diferencialmente expressos (GDE) (FC > 2 e valor p ajustado < 0,05). O eixo horizontal representa o fold change e o eixo vertical representa o valor p ajustado. Os círculos vermelhos e azuis indicam genes suprarregulados e infrarregulados, respectivamente. 

Figura 2 Heat map da análise do agrupamento hierárquico para genes diferencialmente expressos (GDE). 

Análise de enriquecimento funcional e de via

As dez principais funções de GO para os genes suprarregulados incluíram a organização de fibrilas de colágeno (p = 1,44E-06), a organização de matriz extracelular (p = 6,73E-08) e regulação do processo biológico (p = 3,35E-06, que envolveu prostaglandina-endoperóxido sintase 2, PTGS2) (tabela 1A). As vias KEGG enriquecidas para genes suprarregulados estão listadas na tabela 1 C e incluíram amebíase (p = 1,25E-07), interação ECM-receptor (p = 9,01E-10) e câncer de pulmão de pequenas células (p = 3,10E-06, que envolveu PTGS2).

Tabela 1 Função enriquecida de GO e as vias de KEGG para os genes suprarregulados e infrarregulados. (A) As dez principais funções do GO enriquecidas para os genes suprarregulados. (B) As dez principais funções do GO enriquecidas para os genes infrarregulados. (C) As dez principais vias de KEGG enriquecidas para os genes suprarregulados. (D) As dez principais vias de KEGG enriquecidas para os genes infrarregulados 

Termo Descrição Número do gene Símbolo do gene Valor p
A
30198 Organização da matriz extracelular 9 COL18A1, COL4A2…… 6,73E-08
30199 Organização colágeno fibrila 5 COL3A1, COL1A2…… 1,44E-06
43062 Organização da estrutura extracelular 9 COL3A1, COL1A2…… 2,85E-06
50789 Regulação do processo biológico 72 PTGS2, EZH2…… 3,35E-06
32964 Processo biossintético de colágeno 3 COL1A1, COL5A1, COL5A1 3,91E-06
43588 Desenvolvimento da pele 5 COL5A2, COL5A1…… 4,77E-06
65007 Regulação biológica 74 SLC9A7, PTGS2…… 6,95E-06
6950 Resposta ao estresse 30 C3AR1, PTGS2…… 8,65E-06
9611 Resposta à formação de feridas 15 BMP2, TNFSF4…… 1,03E-05
6954 Resposta inflamatória 11 CXCL9, PLA2G7…… 2,15E-05
B
10880 Regulação da liberação de íon de cálcio sequestrado em citosol pelo retículo sarcoplasmático 4 CALM3, FKBP1B…… 2,32E-07
30855 Diferenciação de células epiteliais 13 EREG, ELF3…… 1,30E-06
60316 Regulação positiva da atividade do canal de liberação de cálcio sensível a rianodina 3 CALM2, CALM1, CALM1 3,21E-06
60314 Regulação atividade do canal de liberação de cálcio sensível a rianodina 4 FKBP1B, CALM2…… 9,20E-06
60315 Regulação negativa de atividade do canal de liberação de cálcio sensível a rianodina 3 CALM3, CALM2, CALM1 1,27E-05
7017 Processo baseado no microtúbulo 14 TPPP3, DNAH9…… 1,92E-05
8544 Desenvolvimento da epiderme 12 CST6, EREG…… 2,15E-05
1539 Motilidade ciliar ou flagelar 4 TEKT2, DNAH2…… 3,02E-05
7018 Movimento baseado no microtúbulo 9 DNAH2, DNAH7…… 3,72E-05
30216 Diferenciação de ceratinócito 7 PPL, CNFN…… 3,90E-05
C
Interação ECM-receptor 11 COL1A1, COL1A2…… 9,01E-10
Digestão e absorção da proteína 10 COL1A2, COL3A1…… 9,05E-09
Amebíase 10 CD14, COL1A2…… 1,25E-07
Câncer de pulmão de pequenas células 8 PTGS2, FN1…… 3,10E-06
Infecção por Staphylococcus aureus 5 C3AR1, FCGR2A…… 2,66E-04
Diferenciação de osteoclastos 6 SOCS1, TYK2…… 2,23E-03
Via de sinalização do receptor Toll-like 5 CXCL9, NFKBIA…… 4,54E-03
Reprodução do DNA 3 PCNA, MCM2…… 6,36E-03
Leishmaniose 4 FCGR2A, PTGS2…… 6,94E-03
Ciclo celular 5 CCNE2, SMC1A…… 9,53E-03
D
Metabolismo do fármaco-citocromo P450 9 ADH1 C, ADH7…… 3,02E-07
Metabolismo de xenobióticos por citocromo P450 8 ADH7, ALDH1A3…… 8,48E-06
Metabolismo da tirosina 5 ALDH3A1, ALDH3B2…… 1,69E-04
Glicólise/gliconeogênese 6 ADH7, ALDH1A3…… 2,51E-04
Metabolismo da histidina 4 ALDH3A1, ALDH3A2…… 5,74E-04
Metabolismo de beta-alanina 4 ALDH3A2, ALDH3B2…… 6,59E-04
Metabolismo de fenilalanina 3 ALDH1A3, ALDH3A1, ALDH3B2 1,88E-03
Junção de oclusão 7 CGN, CLDN7…… 2,40E-03
Fototransdução 3 CALM1, CALM2, CALM3 7,52E-03
Metabolismo do retinol 4 DHRS9, SDR16C5…… 1,03E-02

Da mesma maneira, análises de enriquecimento funcionais e de via foram feitas para os genes infrarregulados. Como pode ser visto na tabela 1B, as funções que incluem a regulação da liberação do íon de cálcio sequestrado para o citosol por retículo sarcoplasmático (p = 2,32E-07), diferenciação de células epiteliais (p = 1,30E-06) e regulação positiva de atividade do canal de liberação de cálcio sensível a rianodina (p = 3,21E-06) foram enriquecidas. As vias enriquecidas incluíram citocromo P450 do metabolismo do fármaco (p = 3,02E-07), metabolismo de xenobióticos por citocromo P450 (p = 8,48E-06) e metabolismo da tirosina (p = 1,69E-04) (tabela 1D).

Análise da rede reguladora TF-GDE

Com o pacote Genomatix Software Suite, os TF foram previstos para 122 genes suprarregulados e 365 genes infrarregulados. Havia TF suprarregulados que almejavam genes suprarregulados ou infrarregulados, bem como TF infrarregulados que almejavam gentes suprarregulados e infrarregulados. No entanto, apenas TF que tiveram como alvo tanto genes suprarregulados como infrarregulados foram selecionados. A rede reguladora de TF-GDE dos TF (membro da família Zic 2, ZIC2; tipo ovo 1, OVOL1; e o hairy/enhancer of split 1, HES1) e seus GDE alvo são mostrados na figura 3. Em particular, PTGS2 significativamente suprarregulado, fibronectina (FN1) e quimiocinas (CXC motif) que ligam 9 (CXCL9) foram almejados e ativados por ZIC2. No entanto, quimiocina significativamente suprarregulada (C-X-C motif) que liga 10 (CXCL10) foi almejada e suprimida por OVOL1.

Figura 3 Rede reguladora de fatores de transcrição (TF, como ZIC2, OVOL e HES1) e seus genes diferencialmente expressos almejados (GDE). 

Discussão

Neste estudo, foram selecionados 487 genes como amostras GDE entre amostras de CNF e amostras de tecidos nasofaríngeos normais, inclusive 122 genes suprarregulados e 365 infrarregulados. Havia muitas funções enriquecidas para os GDE, como a organização de matriz extracelular e organização da estrutura extracelular. PTGS2, FN1, CXCL9 e CXCL10 eram genes significativamente suprarregulados, envolvidos na rede reguladora TF-DEG, e podem funcionar no CNF através de ZIC2 ou OVOL1 (p.ex., ZIC2 → PTGS2 e OVOL1 → CXCL10).

A análise de enriquecimento indicou que PTGS2 estava envolvido na regulação do processo biológico e câncer de pulmão de pequenas células. Como um gene a jusante envolvido na via de NF-κB, PTGS2 também é chamado de ciclo-oxigenase-2 (COX-2). Sabe-se que COX2 pode regular células cancerosas do tipo estaminais das células de CNF e promover as suas características. Além disso, o partenolídeo pode funcionar na quimioterapia dirigida por meio da via do NF-κB/COX2.24 Com base em PCR e análise de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição, o polimorfismo −765 G> do promotor funcional C do COX2 pode ser relacionado a risco e progressão neoplásica de CNF.25 Os resultados de imuno-histoquímica e avaliação semiquantitativa mostram que a expressão de COX-2 aumenta à medida que o epitélio da nasofaringe evolui de normal a displásico e, em seguida, para CNF, indica que COX-2 promove o desenvolvimento de CNF.26,27 Isso sugere que PTGS2 pode estar associado ao CNF.

Sabe-se que FN1 contribui para a tumorigênese por meio da promoção do crescimento e migração de células tumorais, bem como do aumento da resistência à terapia.28,29 O FN1 suprarregulado correlaciona-se com a transição epitelial para mesenquimatosa (TEM) e contribui para a metástase de células tumorais; pode, portanto, ser usado como um potencial marcador de diagnóstico e alvo terapêutico de CNF.30 Com base no sistema de arranjo de suspensão multiplex, um estudo anterior descobriu que a expressão de CXCL9 é significativamente suprarregulada em pacientes com CNF e carcinoma espinocelular da cavidade oral.31,32 A PCR quantitativa em tempo real e a imuno-histoquímica sugeriram que CXCL9 suprarregulado está relacionado com agressividade do CNF e um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima indicou que seu nível sérico pode ser um indicador de prognóstico valioso.33 Os genes ZIC, que consistem em cinco domínios de dedo de zinco Cys2His2, codificam fatores de transcrição de dedos de zinco.34 Entre os membros da família, ZIC2 medeia a expressão específica de tecido do receptor da dopamina D1 acoplado à proteína G.35 A expressão de ZIC2 é suprarregulada em diversos tumores malignos, inclusive sarcoma sinovial, meduloblastoma pediátrica e cânceres do endométrio.36-38 Portanto, os níveis de FN1, CXCL9 e ZIC2 podem estar correlacionados com o CNF. Na rede reguladora TF-DEG, descobrimos que ZIC2 almejou e ativou FN1, CXCL9 e PTGS2, indica que ZIC2 pode também funcionar em CNF e regular FN1, CXCL9 e PTGS2.

Relata-se que os TF OVOL1 e OVOL2 desempenham papéis cruciais na indução da transição de mesenquimatoso para epitelial (TME) em vários tipos de cânceres humanos.39 Como um membro da família quimioquina CXC, CXCL10 liga-se ao seu receptor CXCR3 para exercer funções biológicas em doenças infecciosas, disfunção imune, inflamação crônica, desenvolvimento de tumores e metástases.40 A quimiocina CXC negativa para ELR CXCL10 pode atenuar a angiogênese e suprimir tumores.41 A sobre-expressão de CXCL10 e CXCR3 desempenha papéis essenciais em cânceres avançados, tais como carcinoma de células basais,42 linfoma de células B,43 mieloma múltiplo44 e carcinoma do ovário.45 As citocinas inflamatórias que incluem CXCL10, proteína inibidora de macrófago 1 (MIP1) e interleucina 1 alfa são sobre-expressadas em células malignas de CNF, que podem promover o infiltrado de leucócitos.46 Esses resultados sugerem que OVOL1 e CXCL10 podem estar correlacionados com CNF. Na rede reguladora TF-DEG, também descobrimos que OVOL1 tinha como alvo e reprimia CXCL10, sugere que OVOL1 pode também desempenhar um papel na mediação do CNF por CXCL10.

Conclusão

Foram usados os dados do perfil de expressão de GSE12452 baixados da GEO para estudar os mecanismos de CNF. Foram selecionados 487 genes como GDE entre as amostras de CNF e as de tecidos normais da nasofaringe. Vários genes (PTGS2, FN1, CXCL9, CXCL10, ZIC2 e OVOL1) podem desempenhar papéis no CNF e também podem ser usados para a terapia alvo de CNF na prática clínica. Entretanto, uma validação experimental adicional ainda é necessária para desvendar seus mecanismos de ação no CNF.

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