Imagem molecular pré-clínica: desenvolvimento de instrumentação para pesquisa translacional com pequenos animais
Imagem molecular pré-clínica: desenvolvimento de instrumentação para pesquisa translacional com pequenos animais
Autores:
ARTIGO ORIGINAL
Einstein (São Paulo)
versão impressa ISSN 1679-4508versão On-line ISSN 2317-6385
Einstein (São Paulo) vol.14 no.3 São Paulo jul./set. 2016
http://dx.doi.org/10.1590/S1679-45082016AO3696
INTRODUÇÃO
A Imagem Molecular é uma área da Medicina que compreende um conjunto de técnicas de obtenção de imagens que permitem visualizar, caracterizar e quantificar, de forma não invasiva, processos e fenômenos biológicos que acontecem a níveis celular e molecular, no interior dos organismos vivos.(1) Essas imagens podem ser planas ou volumétricas, estáticas ou dinâmicas, e usar diferentes faixas de energia. Nesse conjunto de técnicas, podemos incluir a tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT, sigla do inglês single photon emission computed tomography), a tomografia por emissão de pósitrons (PET, do inglês positron emission tomography), a imagem por ressonância magnética, a tomografia computadorizada, o ultrassom, a imagem por fluorescência e a bioluminescência.(2) Estas ferramentas são consideradas de uso padrão no ambiente clínico,(3) com exceção da fluorescência e da bioluminescência, que usam radiação infravermelha ou visível, e foram desenvolvidas no ambiente pré-clínico.(4)
Recentemente, tem sido feito um grande esforço para transferir as técnicas de SPECT e PET para o ambiente pré-clínico,(5–10) em que ratos e camundongos são os animais mais usados para estudar e tratar modelos de doenças humanas. Especificamente, SPECT é uma técnica de obtenção de imagens em que um fármaco ligado a um elemento emissor de raios gama, com afinidade por um órgão ou processo de interesse, é injetado no paciente. Imagens do alvo, chamadas projeções, são feitas de diferentes ângulos de visão. Usando ferramentas computacionais apropriadas, as projeções são combinadas para gerar uma imagem tomográfica do alvo. Diferentemente das técnicas invasivas para a avaliação dos efeitos dos protocolos experimentais, em que a eutanásia e a dissecção do órgão ou tecido de interesse são normalmente utilizadas, as técnicas de imagem molecular permitem visualizar a evolução do sujeito de estudo com mínima interferência. Assim, o animal pode ser usado como seu próprio controle e avaliado repetidamente em diferentes momentos ao longo do experimento, o que reduz o efeito das diferenças entre animais, melhorando a qualidade estatística dos dados coletados. Adicionalmente, por não ser necessário um grupo experimental para cada momento de avaliação, há uma redução significativa nos custos de execução e está em acordo com as considerações éticas referentes ao uso de animais de experimentação.(11)
No entanto, considerando o tamanho desses animais, fazer imagens nesse ambiente esbarra em dificuldades associadas à resolução espacial e à sensibilidade. Para resolver esse desafio, diferentes grupos de pesquisa trabalham no desenvolvimento de estratégias para adaptar aparelhos já existentes e de uso clínico,(10,12,13) ou na construção de equipamentos específicos para animais de experimentação,(14–17) cada um favorecendo, à sua maneira, outros aspectos, como custos, reuso de equipamentos no tempo livre ou desativados, e disponibilidade dos equipamentos. De qualquer forma, desenvolver a instrumentação necessária para gerar essas imagens permite entender os parâmetros envolvidos e controlar as fontes de erro associadas, de forma a ter resultados apropriados, com investimento adequado à pergunta formulada.
Trabalhando nesta linha de pensamento, o Hospital Israelita Albert Einstein transferiu uma gama câmara SPECT do serviço clínico para o Centro de Imagem Pré-Clínica, localizado no Centro de Experimentação e Treinamento em Cirurgia (CETEC), onde foi instalada e adaptada para a obtenção de imagens de pequenos animais. O dispositivo de adaptação corresponde a uma atualização do dispositivo miniSPECT, desenvolvido anteriormente, e ajustado à câmara específica.(13)
OBJETIVO
Apresentar o resultado da adaptação de uma gama câmara clínica para uso dedicado na obtenção de imagens tomográficas in vivo de órgãos de pequenos animais de experimentação, e de sua aplicação na obtenção de imagens cardíacas, renais e neurológicas
MÉTODOS
Descrição do equipamento adaptado
Utilizamos uma gama câmara SPECT retirada do serviço clínico, modelo Discovery VH (General Electric Healthcare, Milwaukee, WI, EUA). Esta câmara tem dois detectores de NaI(Tl), com área útil de 540mm×400mm e 9,5mm de espessura, resolução espacial intrínseca de 3,9mm e resolução em energia de 10% a 140keV. Da forma como foi instalada, o software proprietário permite fazer registros em modos estático, dinâmico ou SPECT. No modo estático, imagens individuais são registradas, com tempo de integração determinado pelo usuário. No modo dinâmico, o sistema registra uma sequência de imagens com tempo de integração previamente selecionado, sem movimentação dos detectores. No modo SPECT, os detectores se movimentam, permitindo registrar um conjunto de imagens de diferentes ângulos em torno do alvo. As imagens podem ser registradas em matrizes de até 1.024×1.024 pixels e é possível sincronizar o registro das imagens com o eletrocardiograma (ECG). Neste trabalho, a câmara foi usada em modo dinâmico, e o animal foi girado para cada registro de uma imagem.
O dispositivo de adaptação, ao qual denominamos miniSPECT, consiste em três subsistemas: mecânico, eletrônico e de software.(13) O subsistema mecânico inclui um conjunto de tubos plásticos transparentes à radiação gama para posicionamento de alvos de diferentes tamanhos, os quais são girados por um motor de passos. Há, ainda, colimadores de orifício feitos em peças de chumbo, que projetam a imagem sobre o detector. Foram testados colimadores que consistem em insertos de tungstênio de pequenas dimensões, montados sobre uma peça de chumbo, ou em um orifício perfurado diretamente na peça de chumbo. Os colimadores têm formato de duplo cone, cujos vértices coincidem no centro da peça de que o colimador é feito. Os colimadores são montados sobre uma placa base de alumínio recoberta com chumbo, que serve como blindagem, para evitar a incidência de radiação indesejada no detector. Nesta placa, são fixados os tubos porta-alvo e o sistema de rotação do alvo. Finalmente, a placa base está montada sobre um carro, que permite que o dispositivo seja posicionado na frente do detector, independentemente da câmara utilizada. O dispositivo desenvolvido pode ser visto na figura 1.
Figura 1 Imagem da gama câmara Discovery VH e o dispositivo de adaptação miniSPECT
O subsistema eletrônico consiste em um dispositivo microcontrolado, que gira o tubo porta-alvo na frente do colimador, em sincronia com o registro de imagens pela câmara. Esse subsistema permite selecionar o número de projeções e o tempo por projeção, dentre um conjunto de opções pré-programadas, e controla os estados de ligado ou stand-by. Finalmente, o subsistema de software consiste em uma ferramenta iterativa de reconstrução tridimensional, que combina as projeções registradas com um modelo físico do instrumento utilizando o algoritmo de máxima verossimilhança,(18) para gerar a imagem do alvo que melhor corresponde às imagens registradas. Essa ferramenta foi desenvolvida em linguagem C (Microsoft Visual Studio C/C++). A visualização e a análise das imagens finais foram feitas com ferramentas de software livre, como ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) e Amide's (http://amide.sourceforge.net). Alternativamente, é possível usar a técnica de Ordered Subset Expectation Maximization (OSEM). Com esta técnica, subconjuntos das projeções foram utilizados para fazer reconstruções intermediárias, que serviram como modelo de entrada para a iteração seguinte. Dessa forma, foi possível reduzir significativamente o tempo de processamento, acelerando o processo de reconstrução da imagem.(19)
Determinação da resolução espacial do sistema: fantomas
Em instrumentos de tomografia SPECT que utilizam colimador de orifício, a resolução espacial depende destes fatores: resolução intrínseca do detector, relação de magnificação, diâmetro do orifício, material do colimador e energia de emissão do radionuclídeo. O primeiro fator determina o tamanho com que a gama câmara registra a imagem de uma pequena fonte projetada diretamente sobre o detector, depende do modelo da câmara e, neste projeto, é invariável. A relação de magnificação é dada pela razão entre as distâncias colimador-detector e colimador-alvo. Quanto menor a distância colimador-alvo ou maior a distância colimador-detector, maior a magnificação da imagem, aumentando a separação entre as imagens geradas por dois pontos vizinhos no alvo. A magnificação está limitada pelo tamanho do alvo a estudar e pela área útil do detector, sendo necessário que, durante a rotação do alvo, este seja sempre projetado em sua totalidade sobre a área útil do detector. Finalmente, o diâmetro do orifício afeta o tamanho da projeção de uma pequena fonte, de forma que, quanto menor o orifício, menor a área ocupada pela projeção dessa fonte, melhorando a capacidade de separação das imagens de dois pontos próximos no alvo. Adicionalmente, a resolução espacial depende do material do colimador e da energia do radionuclídeo utilizado, devido à penetração de fótons pelas bordas do orifício do colimador, de forma que, para energias maiores ou materiais menos densos, o orifício é efetivamente maior do que o diâmetro físico.(20) Neste trabalho, limitamo-nos à energia de 140keV, correspondente à emissão pelo 99mTc, e testamos colimadores de chumbo e tungstênio.
Para determinar a resolução espacial do instrumento, utilizamos dois fantomas diferentes: (a) um fantoma de barras quentes ou de Jaszczak e (b) um conjunto de capilares paralelos. O primeiro fantoma consiste em uma peça de acrílico com quatro conjuntos de orifícios de 0,5, 1,0, 1,5 e 2,0mm de diâmetro, com uma distância entre as bordas dos orifícios igual ao diâmetro dos orifícios do conjunto. Esta peça foi colocada em um tubo plástico preenchido com pertecnetato de sódio (Na-99mTcO4 −), selado para evitar vazamentos. O segundo fantoma consiste em um conjunto de seis capilares paralelos montados em formato triangular, preenchidos com Na-99mTcO−. A distância entre as bordas dos espaços preenchidos de capilares contíguos foi de 0,5mm. Os dois fantomas foram preenchidos com uma concentração de 1mCi/mL. Cada fantoma foi posicionado no dispositivo de imageamento e foram feitos dois conjuntos de imagens: um com o fantoma de Jaszczak, com um fator de magnificação de 7x e orifício de 1,5mm de chumbo, e outro com o fantoma de capilares, com um fator magnificação de 9x e orifício de 0,5mm de tungstênio. Nos dois casos, foram registradas 40 projeções de 60 segundos cada uma. As projeções foram processadas para gerar a imagem tridimensional da distribuição do Na-99mTcO4 − no fantoma usando a ferramenta de software iterativo, com 20 iterações, 4 subconjuntos de projeções e suavizado com uma função gaussiana de 1,5 pixel de largura a meia altura a cada duas iterações.
Imagens de órgãos de animais normais Animais
Foram utilizados dois camundongos Swiss machos, normais, com peso aproximado de 30g e um rato Wistar macho, normal, com peso de 350g. Os animais foram mantidos no biotério de experimentação do CETEC, com ciclo claro-escuro de 12 horas, temperatura ambiente controlada em 22±2°C e sem restrição de água ou alimento. Para o registro das imagens, os radiofármacos foram administrados por via intravenosa na veia caudal. Na sequência, os animais foram anestesiados com a associação cetamina:xilazina (75:10mg/kg), respeitando o tempo entre injeção e início dos registros. Após a aquisição das imagens, os animais foram mantidos em sala blindada do biotério por 48 horas, até o decaimento total do radionuclídeo. Posteriormente, foram transferidos para o biotério de experimentação convencional. Todos os procedimentos foram realizados conforme a Diretriz Brasileira para o Cuidado e a Utilização de Animais para Fins Científicos e Didáticos (DBCA), e foram aprovados pela Comissão de Ética para Uso de Animais em Experimentação do Hospital Israelita Albert Einstein, protocolo 2.359/15.
Rins – DMSA-99mTc
O ácido dimercaptosuccínico marcado com 99mTc (DMSA-99mTc) é utilizado em medicina nuclear para estudar a função renal e visualizar anormalidades no parênquima, aproveitando-se do fato de ele ser removido do plasma pelas células tubulares proximais renais e se acumular no córtex, com baixa eliminação na urina.(21,22) Este radiofármaco apresenta alta ligação às proteínas plasmáticas e é excretado por filtração glomerular e secreção tubular. Foram administrados 130MBq de DMSA-99mTc em um camundongo acordado. O animal foi anestesiado 2 horas após a injeção e posicionado horizontalmente no tubo porta-alvo. Foram registradas 40 projeções de 30 segundos cada uma, usando um colimador de 1,5mm de diâmetro e uma magnificação de 7x. As projeções foram processadas para produzir a imagem tomográfica do órgão-alvo, utilizando-se dez iterações e quatro subconjuntos de projeções.
Coração – Sestamibi-99mTc
O hexaquis-2-metoxi-isobutil-isonitrila marcado com 99mTc (Sestamibi-99mTc) é um radiofármaco usado para estudar a perfusão miocárdica, que se acumula nos miócitos proporcionalmente ao fluxo sanguíneo.(23) Este radiofármaco apresenta baixa ligação às proteínas plasmáticas, com rápido clareamento sanguíneo, e é excretado pelo sistema renal, hepatobiliar e intestinos. Foram administrados 186MBq de Sestamibi-99mTc em um camundongo acordado. O animal foi anestesiado 2 horas após a injeção e posicionado verticalmente no tubo porta-alvo. Foram registradas 40 projeções de 30 segundos cada uma, usando um colimador de 1,5mm de diâmetro e uma magnificação de 9x. Para produzir a imagem tomográfica do órgão alvo, foram utilizadas dez iterações e quatro subconjuntos de projeções.
Cérebro – HMPAO-99mTc
O hexametil-propileno-amina-oxima marcado com 99mTc (HMPAO-99mTc) e o dicloridrato de etileno cisteína dietil ester marcado com 99mTc (ECD-99mTc) são radiofármacos usados na prática clínica para estudos de perfusão cerebral. Trata-se de agentes lipofílicos, o que garante sua passagem pela barreira hematoencefálica, que se acumulam no meio intracelular proporcionalmente ao fluxo sanguíneo.(23) Diferentemente do HMPAO-99mTc, o ECD-99mTc não é retido no cérebro de ratos ou coelhos,(24,25) o que justifica nossa escolha pelo HMPAO-99mTc neste experimento. A excreção deste ocorre pelo sistema hepatobiliar e renal. Assim, foram administrados 370MBq de HMPAO-99mTc em um rato anestesiado. Imediatamente depois, o animal foi posicionado verticalmente no tubo porta-alvo. Foram registradas 40 projeções de 30 segundos cada uma, usando um colimador de 1,5mm de diâmetro e uma magnificação de 5,5x. A imagem tomográfica do órgão alvo foi produzida utilizando-se 20 iterações e 4 subconjuntos de projeções.
RESULTADOS
Resolução espacial
Na figura 2, podem ser vistos uma foto do fantoma de Jaszczak e cortes transaxiais através das imagens da distribuição do Na-99mTcO4 − nos dois fantomas utilizados. No primeiro caso, que corresponde a uma configuração para estudo de alvos do tamanho de ratos jovens, foi possível verificar que uma resolução espacial entre 1,0 e 1,5mm foi atingida. No segundo caso, que corresponde a uma configuração para estudo de alvos do tamanho de camundongos, os capilares contíguos foram identificados individualmente, correspondendo a uma resolução espacial melhor que 0,5mm.
Figura 2 Resolução espacial. (A) Imagem do fantoma de Jaszczak indicando os tamanhos dos orificios e o espaçamento entre eles. (B) Corte transaxial da imagem da distribuição do radiotraçador no fantoma de Jaszczak, em que as barras de 1,5mm podem ser facilmente identificadas. (C) Corte transaxial da imagem da distribuição do radiotraçador no fantoma de capilares, em que os capilares contiguos são identificados individualmente
Imagem renal
Na figura 3, ilustramos o resultado da obtenção de imagens renais de um camundongo normal. À esquerda, observa-se um corte transversal da imagem tomográfica dos rins e à direita, um corte horizontal da mesma imagem. Pode verificar-se que os rins têm dimensões de 3,5mm de diâmetro e 6,5mm de altura. Igualmente, a integridade do parênquima renal pode ser verificada.
Figura 3 Imagem renal com DMSA-99mTc. Cortes transversal e horizontal através do modelo reconstruído da distribuição do radiofármaco DMSA-99mTc nos rins de um camundongo normal
Imagem cardíaca
Na figura 4, é ilustrado o resultado da obtenção de imagens cardíacas de camundongo. À esquerda, observa-se um corte transversal da imagem tomográfica e à direita, um corte horizontal da mesma imagem. Devido à proximidade anatômica do coração e do fígado, associada à excreção hepática do Sestamibi, a atividade hepática se sobrepõe à da parede inferior do ventrículo esquerdo, ainda que o animal seja mantido na posição vertical.
Figura 4 Imagem cardíaca com Sestamibi-99mTc. Cortes transversal e horizontal através do modelo reconstruído da distribuição do radiofármaco Sestamibi-99mTc no coração de um camundongo normal
Imagem de perfusão cerebral
Na figura 5, ilustra-se o resultado de uma imagem de perfusão cerebral de um rato jovem. À esquerda, um corte horizontal através da imagem tomográfica e à direita, três cortes transversais da mesma imagem em diferentes alturas.
Figura 5 Imagem de perfusão cerebral com HMPAO-99mTc. Corte horizontal e três cortes coronais através do modelo reconstruído da distribuição do radiofármaco HMPAO-99mTc no cérebro de um rato normal
DISCUSSÃO
Recentemente, a necessidade de aplicar técnicas de imagem molecular no ambiente pré-clínico tem recebido amplo reconhecimento. A maior parte dessas técnicas foi desenvolvida para uso clínico, em que os órgãos e estruturas de interesse têm dimensões de vários centímetros. Já no ambiente pré-clínico, em que os experimentos são realizados em pequenos animais, as estruturas alvo apresentam tamanhos de alguns milímetros ou menores. Com isso, as técnicas de imagem molecular a serem usadas enfrentam importantes desafios associados com resolução espacial e sensibilidade.
Para superar esses desafios, dois enfoques têm sido seguidos: adaptar instrumentos clínicos ou desenvolver aparelhos específicos para pequenos animais. No primeiro enfoque, aparelhos desenvolvidos para avaliar órgãos humanos, e cuja tecnologia é relativamente bem dominada, são modificados mediante a instalação de dispositivos eletromecânicos, para se aproximarem dos requisitos de resolução espacial e sensibilidade necessários à nova aplicação.(12,13,26–28) Este enfoque tem a vantagem de que os custos são significativamente reduzidos, uma vez que o aparelho de detecção já está instalado e é usado no tempo ocioso, ou trata-se de um aparelho mais antigo e desativado do serviço clínico, embora ainda totalmente funcional. No segundo caso, detectores, colimadores e ferramentas de produção de imagens são desenvolvidos e construídos visando ao uso específico no ambiente pré-clínico, tendo como alvos desde camundongos até ratos adultos.(15,16,29,30)
Seja qual for a alternativa escolhida, o uso de técnicas de imagem molecular permite avaliar a evolução do protocolo experimental em estágios intermediários, mantendo o animal vivo, o que leva a uma importante redução do número de grupos experimentais e, com isso, dos custos e do tempo de execução, e a uma melhor qualidade dos resultados.
Nesta aplicação, testamos o uso de uma versão atualizada do dispositivo de adaptação miniSPECT(13) em uma gama câmara clínica Discovery VH da General Electric Healthcare, e verificamos que é possível obter resolução espacial melhor que 0,5mm, utilizando colimador de orifício simples de 0,5mm de diâmetro e uma magnificação de 9x, o que corresponde a uma configuração apropriada para imagens de órgãos de camundongos. Já em uma configuração apropriada para órgãos de ratos, atingimos uma resolução espacial melhor que 1,5mm. Imagens de diferentes órgãos de camundongos e ratos foram obtidas, em todos os casos, com um tempo de registro menor que 30 minutos. As projeções registradas foram processadas e a imagem tridimensional de distribuição do radiofármaco foi produzida utilizando uma ferramenta computacional baseada no algoritmo de máxima verossimilhança. Essa ferramenta foi adaptada para as condições específicas desta aplicação, a partir de uma versão anterior implementada em Linguagem C, utilizando a versão gratuita do compilador Visual Studio C++.(13) Foram feitas imagens de perfusão miocárdica, funcionalidade renal e perfusão cerebral em animais normais, mostrando a aplicabilidade da técnica nestas áreas. Considerando que a solução apresentada se baseia no uso de um equipamento retirado de um serviço de medicina nuclear, que os subsistemas mecânico e eletrônico usam componentes de fácil aquisição no mercado local, e que o subsistema de software foi desenvolvido no nosso laboratório, o custo de implementação do equipamento combinado é significativamente reduzido, em comparação com equipamentos comerciais específicos para animais de experimentação.
Futuramente, deve ser construído um segundo dispositivo, que permita utilizar os dois detectores simultaneamente, com o que teremos uma redução no tempo de registro ou na atividade do radiofármaco administrada ao animal. Trabalharemos no uso de colimadores de orifícios múltiplos, o que deve permitir fazer um uso mais eficiente da área útil dos detectores e reduzir o tempo de registro. Finalmente, incluiremos uma ferramenta para registros sincronizados com o ECG, o que deve permitir melhorar a qualidade das imagens e fazer estudos específicos na área de cardiologia.
CONCLUSÃO
Foi possível desenvolver instrumentação de baixo custo aproveitando o reuso de um equipamento retirado de sua função original, atingindo resultados com qualidade comparável à de equipamentos comerciais específicos para essa aplicação. Adicionalmente, considerando que o aparelho está instalado no Centro de Imagem Pré-Clínica, no Centro de Experimentação e Treinamento em Cirurgia, deve ser possível realizar este tipo de experimentos de forma contínua, tornando-se uma ferramenta permanentemente disponível para pesquisas em diferentes áreas. Finalmente, ainda há espaço para melhorias no equipamento, que permitirão realizar estudos aprimorados em áreas específicas.