Inflamação renal, alterações metabólicas e oxidativas após 6 semanas de dieta de cafeteria em ratos

Inflamação renal, alterações metabólicas e oxidativas após 6 semanas de dieta de cafeteria em ratos

Autores:

Maria Eugênia Lopes Navarro,
Klinsmann Carolo dos Santos,
André Ferreira do Nascimento,
Fabiane Valentini Francisqueti,
Igor Otávio Minatel,
Damiana Tortolero Pierine,
Renata Azevedo de Melo Luvizotto,
Ana Lúcia A. Ferreira,
Dijon Henrique Salomé de Campos,
Camila Renata Corrêa

ARTIGO ORIGINAL

Brazilian Journal of Nephrology

versão impressa ISSN 0101-2800versão On-line ISSN 2175-8239

J. Bras. Nefrol. vol.38 no.1 São Paulo jan./mar. 2016

http://dx.doi.org/10.5935/0101-2800.20160003

Introdução

Obesidade é uma condição associada à inflamação e ao estresse oxidativo, que ocorrem quando uma alta ingestão de gorduras e açúcares são oxidados, produzindo substâncias tóxicas, tais como produtos finais de glicação avançada (AGEs).1-3 Quando o consumo se torna crônico, há um desequilíbrio no sistema redox, que causa a geração destas espécies, as quais estão associadas com disfunções metabólicas e danos inflamatórios em diversos órgãos.4,5 Os AGEs podem agir de várias formas, entre as quais, por se ligar ao receptor RAGE (o receptor para a glicação avançada de produtos finais), iniciando uma cascata de acontecimentos que envolvem cinases de transdução de sinal. Esta associação culmina na ativação de fatores Ikkβ/NFkB - elementos de transcrição nuclear envolvidos na produção de citocinas pró-inflamatórias.6 Uma vez que estes receptores estão presentes em vários órgãos, incluindo os rins, esta pode ser uma forma de indivíduos obesos desenvolverem insuficiência renal.7

Estudos em animais diabéticos e obesos mostraram que os AGEs são compostos que podem causar doença renal.7-9 No entanto, a literatura não mostra se um curto período de ingestão de açúcar e gordura seria capaz de aumentar a formação de AGEs - que causam as alterações metabólicas e inflamação no tecido renal. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a influência do curto período de exposição à dieta de uma lanchonete na inflamação do tecido renal, bem como de produtos AGEs no plasma de ratos.

Materiais e Métodos

Animais e protocolo experimental

Ratos Wistar machos (10 semanas de idade, pesando cerca de 350g), do Biotério da Faculdade de Medicina da Universidade Estadual Paulista de Botucatu, UNESP (Botucatu, SP, Brasil), foram inicialmente divididos para receber uma dieta de controle padrão (5% energia de gordura e água (C, n = 8 animais/grupo) ou dieta de lanchonete (29% de energia de gordura) e açúcar na água potável (300 g/l) (CAF-D, n = 8 animais/grupo) durante 6 semanas. A dieta de lanchonete foi desenvolvida em nosso laboratório para conter uma dieta de ração comercial em pó -NUVILAB CR-1 (Nuvital Q5), além de alimentos processados como biscoito wafer, leite condensado e óleo de palmeira, vitaminas e minerais. A composição nutricional da dieta está apresentada na Tabela 1.

Tabela 1 Composições nutricionais das dietas de controle e de lanchonete 

Dieta Lanchonete
Componentes Controle Dieta
Proteínas (%) 25,0 21,0
Carboidratos (%) 58,0 45,0
Gordura (%) 5,0 29,0
% Energia a partir de proteína 26,5 16,0
% Energia a partir de carboidratos 61,5 34,3*
% Energia a partir de gordura 12,0 49,7
% Energia a partir de gordura saturada 2,1 24,7
% Energia a partir de gordura insaturada 9,9 25,0
Energia (kcal/g) 3,8 5,3
Energia (KJ/g) 15,8 22,0
Outros 6,8 5,4
Mistura vitaminas/minerais - acrescentar

*A energia do açúcar na água potável (300 g/l) não foi incluída.

Com base nas quantidades de vitaminas/minerais da dieta de ração, para cada kg da DAG, foram adicionados os seguintes nutrientes: Fe, 25,2 mg; K, 104,8 mg; Se, 73,1 ug; sulfato de molibdénio, 150,0 mg; vitamina B12, 34,5 ug; vitamina B6, 6 mg; biotina, 0,12 mg; vitamina E, UI 48,9; vitamina D, 2447,0 UI; vitamina A, 15.921,2 UI.

Os ratos foram alojados em gaiolas individuais em um biotério no Laboratório Experimental de Medicina Interna, Botucatu Faculdade de Medicina da UNESP, sob uma temperatura ambiente (22-26°C) e iluminação (ciclos com 12h de luz-12h no escuro) controladas. Os animais foram sacrificados por decapitação após jejum de 12 horas e anestesia com pentobarbital de sódio Q4 (50 mg/kg, intraperitoneal). O experimento foi conduzido em conformidade com as Diretrizes para o Cuidado e Uso Experimental de Animais. As dietas seguiram as especificações das exigências e necessidades de nutrientes para ratos de laboratório. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética local para Pesquisa com Animais (protocolo n° PE-47/2011).

Índice de adiposidade

O índice de adiposidade (IA) foi utilizado como um indicador da obesidade, porque permite a avaliação exata das percentagens de gordura corporal. Depósitos de gordura epididimais, retroperitoneais, e viscerais foram dissecados dos ratos. A soma dos depósitos de gordura, normalizada pelo peso corporal [(epididimal + retroperitoneal + visceral)/peso corporal] x 100, foi calculada para se obter o índice de adiposidade.10

Medidas do plasma

Utilizamos um kit colorimétrico enzimático para medir a glicose (Bioclin ®, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil), triglicérides e colesterol (Bioclin®, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil) plasmáticos. Usamos a espectrofotometria, realizada com o Analisador de Química BS 200 - espectrofotômetro automático (Mindray, China).

Insulina, leptina, adiponectina e AGEs foram adquiridos da Millipore Corporation, EUA. TNF-α e IL-6 vieram da R&D System, EUA. As concentrações plasmáticas foram medidas utilizando métodos de ELISA, segundo as instruções do fabricante, utilizando um espectrofotômetro leitor de microplacas (SpectraMax 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA).

Resistência a insulina

A resistência à insulina foi determinada utilizando o índice do modelo de avaliação da homeostase (HOMA-IR) através da seguinte fórmula:11 HOMA-IR = insulina em jejum (mU/ml) x glicose em jejum (mmol/l)/22.5.

Medidas dos AGEs e da insulina plasmática

Insulina (Millipore Corporation, Billerica, MA, EUA); AGEs (Biolabs Celulares, INC, San Diego, CA); as concentrações plasmáticas foram medidas pelo método ELISA. Um espectrofotômetro leitor de microplacas (SpectraMax 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA) foi utilizado, de acordo com as instruções do fabricante.

Quantificação da expressão gênica renal usando PCR em tempo real para interleucina-6 (IL6) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α)

O RNA total foi extraído a partir de tecido adiposo epididimal e tecidos renais, utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen). Utilizamos o Sistema Superscript II de Síntese da primeira cadeia para RT-PCR. Usamos o kit da Invitrogen para a síntese de 20 ml de DNA complementar a partir de 1000 ng do RNA total. Os níveis de RNAm de TNF-a (ensaio Rn 00562055_m1; Applied Biosystems) e IL-6 (ensaio Rn 01410330_m1; Applied Biosystems) foram determinadas por PCR em tempo real. As medidas quantitativas foram realizadas com um kit comercial (TaqMan qPCR; Applied Biosystems) em um sistema de detecção (StepOne Plus; Applied Biosystems). As condições de ciclagem foram as seguintes: ativação da enzima a 50°C durante 2 min, desnaturação a 958C durante 10 minutos, os produtos complementares de DNA foram amplificados por quarenta ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 15s e anelamento/extensão a 60 ° C durante 1 min. A expressão do gene foi quantificada em relação aos valores do grupo C, após normalização por um controle interno (ciclofilina: ensaio Rn 00690933_m1; Applied Biosystems) pelo método 22DDCT, como descrito previamente.12

Análise histológica

O tecido renal foi fixado por formaldeído a 4% e embebido em parafina. Cortamos duas secções consecutivas de cada amostra (4 mm) e as coramos com hematoxilina-eosina. As lâminas foram escaneadas pelo sistema 3DHISTECH Pannoramic MIDI, conectado a uma câmera colorida HITACHI HV-F22 e analisadas sob ampliação de 40x de forma cega.

Análise estatística

Utilizamos o teste de Kolmogorov-Smirnov para verificar a normalidade dos dados. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (DP), e a significância foi calculada pela teste-t para as variáveis independentes. Utilizamos o software SigmaStat versão 3.5 para Windows (Systat Software, Inc.). As diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05.

Resultados

Índice de adiposidade de animais na dieta de lanchonete (CAF-D) na sexta semana foi significativamente maior em comparação com os animais na dieta de controle (C) (Figura 1). Sobre os parâmetros metabólicos, observou-se que glicose, triglicerídeos, leptina e insulina foram maiores no grupo CAF-D em relação ao grupo C. Observamos também que no prazo de seis semanas, os animais CAF-D desenvolveram resistência à insulina (aumento no HOMA-IR) e diminuição significativa da adiponectina plasmática.

Figura 1 Índice de Adiposidade dos animais nas dietas de Controle e de Lanchonete ao longo de 6 semanas. Os dados são expressos como média ± SE. Letras diferentes indicam diferença estatística entre os grupos (teste-t para variáveis independentes p < 0,05) 

Não houve diferença nos níveis de TNF-α e IL-6, entre os grupos (Tabela 2). A concentração plasmática de AGEs está apresentada na figura 2. Observou-se aumento nos animais em CAF-D, em comparação com os animais C. Além disso, os animais alimentados com dieta de lanchonete mostraram um aumento significativo na expressão gênica de IL-6 e TNF-α no tecido renal (Tabela 3). Este comportamento não foi observado na expressão gênica no tecido adiposo (Tabela 3).

Tabela 2 Variáveis plasmática, hormonais e de citocinas de ratos que receberam as dietas de controle e de lanchonete durante o período experimental de 6 semanas. 

Variáveis Controle (n = 8) Dieta de Lanchonete (n = 8)
Glicose (mmol/L) 6,8 ± 0,8a 9,0 ± 0,9b
Triglicérides (mg/dL) 45,8 ± 13,9a 87,6 ± 29,3b
Leptina (ng/mL) 2,5 ± 0,1a 6,2 ± 0,1b
Insulina (ng/mL) 1,9 ± 0,1a 3,9 ± 0,2b
Adiponectina (ng/ mL) 19,4 ± 0,9a 11,4 ± 0,2b
HOMA-IR 0,9 ± 0,5a 3,8 ± 2,5b
IL-6 (pg/mL) 156,9 ± 11,4a 154,8 ± 12,2a
TNF-α (pg/mL) 3,1 ± 2,0a 4,3 ± 3,9a

Dados apresentados como média ± desvio padrão. Letras diferentes indicam diferença estatística entre os grupos (teste-t para variáveis independentes, p < 0,05). HOMA-IR = avaliação do modelo do índice de homeostase, IL-6 = interleucina-6, TNF-α = fator de necrose tumoral-alfa.

Figura 2 Produtos plasmáticos finais avançados da glicação (AGEs) dos animais nas dietas de controle e de lanchonete ao longo de 6 semanas. Os dados estão expressos como média ± SE. Letras diferentes indicam diferença estatística entre os grupos (teste-t para variáveis independentes, p < 0,05) 

Tabela 3 Níveis de RNAm de citocinas no rim e no tecido adiposo de ratos, que foram alimentados com dietas de controle e de lanchonete durante o período experimental de 6 semanas 

Variáveis Controle (n = 8) Dieta de lanchonete (n = 8)
Tecido renal
IL-6 1,0 ± 0,1a 1,6 ± 0,5b
TNF-α 1,0 ± 0,1a 1,5 ± 0,6b
Tecido adiposo
IL-6 1,0 ± 1,5a 0,4 ± 0,2a
TNF-α 1,0 ± 0,3a 1,3 ± 1,2a

Dados apresentados como média ± desvio padrão. Letras diferentes indicam diferença estatística entre os grupos. (teste-t para as variáveis independentes, p < 0,05). IL-6 = interleucina-6, TNF-α = fator de necrose tumoral-alfa.

A análise histológica do rim nos dois grupos não apresentou alterações estruturais ou características inflamatórias, com ausência de infiltrado inflamatório peritubular, glomerular ou intersticial. Túbulos e glomérulos mostraram arquitetura celular normal. Não houve alteração na morfologia do endotélio vascular, e não houve deposição focal ou disseminada de colágeno, o que poderia sugerir a esclerose. A hipercelularidade glomerular estava normal, compatível com a linhagem de camundongos utilizados, semelhante aos animais de controle.

Discussão

A obesidade é acompanhada por uma resposta inflamatória sistêmica e distúrbios metabólicos.13 Este processo inclui aumento dos níveis de citocinas circulantes, assim como na glicemia, nos triglicerídeos, na leptina e diminuição de adiponectina.14 O nosso estudo observou a manifestação da obesidade em 6 semanas, com os animais apresentando maiores índices de adiposidade, aumento da glicemia de jejum, de triglicérides, de leptina, de resistência à insulina, e redução na adiponectina, refletindo o contexto da obesidade e distúrbios metabólicos. Essas alterações na composição corporal e no metabolismo já estão bem descritas na literatura, mas com períodos mais longos de exposição à dieta rica em gordura, como no trabalho de Vincent et al.,15, que realizaram um estudo observando alterações metabólicas semanais durante 20 semanas em animais alimentados com dieta rica em gordura (45%) e apenas na 12ª semana encontraram alterações nos perfis lipídico, glicêmico e hormonal. A diferença nos eventos metabólicos pode ser explicada pela composição da dieta. Dieta com alto teor de gordura consiste em uma dieta em que a maior parte das calorias são provenientes de gordura, enquanto dieta de lanchonete é constituída por uma combinação de alimentos saborosos, com alta densidade energética, o que reflete atualmente o padrão de dieta ocidental. Em um estudo conduzido por Sampey et al.,16 que comparou o efeito da dieta de lanchonete e uma dieta rica em gordura na indução da síndrome metabólica em ratos, os autores mostraram que a dieta de lanchonete induziu um aumento no peso corporal e de gordura epididimal, em comparação com o grupo sob dieta com alto teor de gordura e foi também capaz de induzir resistência à insulina já às sete semanas de consumo, o que não ocorreu com a dieta rica em gordura. Esses dados corroboram a ideia de que a dieta de lanchonete funciona como um gatilho para deflagrar alterações metabólicas.

A literatura tem se concentrado no fato de que um aumentado índice de massa corporal (IMC) aumenta o risco de progressão da doença renal.17-19 Pessoas obesas com doença renal crônica têm maior velocidade de declínio na taxa de filtração glomerular e têm progressão mais rápida da doença renal.20 No entanto, os mecanismos pelos quais a obesidade predispõe as pessoas a danos renais são desconhecidos.8 Sabe-se que a obesidade provoca um aumento da inflamação no tecido renal e lesão renal,21 e uma das causas desta inflamação é o estresse oxidativo.22 Os AGEs são gerados in vivo, como consequência normal do metabolismo, mas sua formação é acelerada em condições de hiperglicemia, hiperlipidemia e aumento no estresse oxidativo.7,23 Esses AGEs são altamente reativos, e podem provocar inflamação principalmente através da geração de TNF-α e IL-6,8 que poderia prejudicar o rim através da apoptose das células tubulares, e pode também promover a proliferação de células mesangiais, causando glomerulonefrite proliferativa mesangial, e nefrite.24

No presente estudo não se observou alterações morfológicas no rim entre os grupos, mas foi observado aumento da expressão gênica dessas citocinas no tecido renal de animais em CAF-D. Isso pode ter sido provocado pela alta presença de AGEs no plasma, que quando presentes na corrente sanguínea entram em contato com o rim e se ligam a receptores RAGE, provocando inflamação no órgão. Apesar de alguns estudos na literatura indicarem inflamação no tecido adiposo como o início do processo inflamatório na obesidade, e, posteriormente, pela circulação afeta outros órgãos, nós não observamos neste trabalho, uma vez que não encontramos aumento da IL-6 e TNF-α no tecido adiposo ou no plasma dos animais alimentados com a CAF-D.

Isso nos leva a destacar que no início da obesidade, a inflamação se manifesta de forma independente e por diferentes mecanismos em diferentes órgãos. Assim, nota-se que o estresse oxidativo causado por alterações metabólicas na obesidade e hiperglicemia causam inflamação. Animais obesos tiveram um acúmulo de AGEs no plasma e, é claro que, se esta obesidade persistir além do período proposto (6 semanas), a inflamação nos rins pode se tornar um fator que favorece a progressão de complicações renais. O TNF-α é um importante mediador da inflamação e um importante participante na patogênese da lesão renal, promovendo apoptose por inflamação e o acúmulo de matriz extracelular, reduzindo a taxa de filtração glomerular (TFG) e aumentando a permeabilidade à albumina.25

Juntos, os AGEs no plasma podem ser um biomarcador para a doença renal, uma vez que estudos relataram que, quando há uma redução na glicemia, ou mesmo a diminuição da ingestão de açúcares e comida processada que contém grandes quantidades de AGEs,26 há uma melhora na função renal.27

Conclusão

Estes dados nos permitem concluir que um período curto de exposição à dieta de lanchonete reflete em alterações metabólicas, níveis plasmáticos elevados de produtos tóxicos como os AGEs, que podem aumentar a expressão de citocinas inflamatórias.

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