Isolamento de células osteoprogenitoras derivadas de sangue de cordão umbilical humano: um candidato promissor para terapias celulares para o reparo ósseo
Isolamento de células osteoprogenitoras derivadas de sangue de cordão umbilical humano: um candidato promissor para terapias celulares para o reparo ósseo
Autores:
ARTIGO ORIGINAL
Einstein (São Paulo)
versão impressa ISSN 1679-4508versão On-line ISSN 2317-6385
Einstein (São Paulo) vol.9 no.4 São Paulo out./dez. 2011
http://dx.doi.org/10.1590/s1679-45082011ao2196
INTRODUÇÃO
Devido ao crescente aumento na expectativa de vida da população mundial nas últimas décadas, as lesÕes traumáticas, degenerativas e crônicas do sistema musculoesquelético representam um problema socioeconômico expressivo(1). A despeito do grande progresso no desenvolvimento de substitutos ósseos, ainda não há um biomaterial ideal capaz de imitar as propriedades naturais de células osteoformadoras viáveis(1,2). Dessa forma, a bioengenharia usa células isoladas ou células associadas a carregadores para substituir funçÕes específicas, com a intenção de criar tecidos duros autólogos ou alogênicos no laboratório, juntamente com possíveis agentes terapêuticos(3,4). Os avanços técnicos em biologia celular e molecular possibilitaram a coleta de células precursoras de osteoblastos (célulastronco mesenquimais – MSC, e células osteoprogenitoras – OPC), e sua diferenciação em tecido ósseo, a partir de uma ampla variedade de tecidos humanos, como aspirado de medula óssea, osso esponjoso, gordura, músculo, periósteo, sinóvia, polpa dental, sangue periférico, derme e cordão umbilical(1,4,5).
As células estromais derivadas de sangue de cordão umbilical humano (SCUH) testadas para fins de medicina regenerativa podem ser expandidas ex vivo sem perder suas propriedades biológicas favoráveis, como autorrenovação, aderência a recipientes de plástico, expressão de antígenos de superfície (CD105+/CD45-)(6), alta plasticidade (multidiferenciação em osteoblastos, condroblastos, adipócitos, neurônios, mioblastos, queratinócitos, endotélio, hepatócitos, células secretoras de insulina)(1,7-9), atividade imunomodulatória (supressão de rejeição de aloenxerto celular)(8,10) e mantêm sua viabilidade após armazenagem a longo prazo por criopreservação(11). A capacidade osteogênica de células SCUH pode ser demonstrada in vitro pela diferenciação em osteoblastos ativos quando há estimulação adequada em um carregador de monocamada ou tridimensional com base no fosfato de cálcio(12,13) e, in vivo, pelo osso ectópico em um sítio subcutâneo(13) e reparo ósseo realçado de defeitos de tamanho crítico em calvárias(14) e fêmur(12) de ratos. Todavia, a dificuldade em produzir culturas e a grande heterogeneidade dos resultados (morfologia, taxas de crescimento, e dados de potencial diferenciação) de células de SCUH são notáveis(7,11,15). As evidências desse comportamento podem ser encontradas em um estudo com 25 doadores de células de SCUH, em que houve isolamento bem sucedido em apenas duas amostras, uma com uma cultura de células que apresentava proliferação e pluripotência normais e a outra, com o desenvolvimento de linhagens aneuploides e osteogênese diminuída in vitro(16).
OBJETIVO
Considerando que estudos prévios apontaram a capacidade controversa de osteodiferenciação e a demanda por uma fonte promissora em terapêutica baseada em células para o reparo ósseo, o objetivo deste estudo preliminar in vitro foi realizar uma avaliação morfológica, citoquímica e funcional do potencial osteogênico de SCUH-OPC.
MÉTODOS
Isolamento e expansão celular
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de ética em Pesquisa Humana da Universidade Federal Fluminense (registro CEP-UFF 56/07, Niterói, Brasil) e realizado mediante consentimento prévio dos doadores. Uma equipe de enfermeiros (Cryopraxis, Rio de Janeiro, Brasil) colheu o SCU de feto a termo, de cinco grávidas hígidas (20 a 28 anos de idade) no Hospital ProMatre (Rio de Janeiro, Brasil).
Todas as amostras frescas de SCU, em tubos Falcon de 50 mL, passaram por um processo de separação celular com Ficoll-PaquePlus (Histopaque™ – GE Healthcare, Rio de Janeiro, Brasil; densidade = 1,077 g/mL) e centrifugação (671 × g, 30 min, em temperatura ambiente). As células monocelulares foram coletadas e colocadas novamente em suspensão em meio RPMI com Hepes e albumina 5%, transferidas em temperatura fria para o laboratório e processadas até 24 horas após o nascimento. Houve centrifugação adicional (671 × g, 15 min, em temperatura ambiente) e nova suspensão em α-MEM com 2 mM de L-glutamina, soro bovino fetal (Gibco-Invitrogen, São Paulo, Brasil) a 20% e 100 μg/mL de gentamicina (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil), com armazenamento em recipientes de plástico de 25 cm2 (Corning, São Paulo, Brasil) a 37°C, 5% de pressão CO , e 95% de atmosfera úmida. A cada 2 dias, o meio de cultura contendo células não aderentes foi cuidadosamente removido e centrifugado; o pellet foi misturado a um meio completo fresco e a suspensão de células foi devolvida ao seu recipiente anterior. Aproximadamente 1 semana após a incubação, apareceram colônias aderentes bem definidas e parecidas com fibroblastos. A subcultura ocorreu em cerca de 80% de confluência em monocamada aos 28 dias, quando a cultura celular foi retirada usando 0,25% tripsina-EDTA (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil). Após 14 dias, as células estavam quase confluentes e uma nova subcultura foi feita até a osteoindução. O uso do método de exclusão com Trypan blue (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil) e a câmara Neubauer de contagem permitiram a análise de viabilidade das células, a seguir: NC × D × 104/Q, onde NC = número de células viáveis, D = diluição da amostra, Q = quartos da câmara Neubauer de contagem.
Desenho experimental de osteoindução
Após a expansão, as células SCUH-MSC (1,0 × 105 células/mL) na passagem 2 foram semeadas em placas com 24 poços (Corning Inc., Califórnia, Estados Unidos) em α-MEM enriquecido com soro bovino fetal a 20%. Após 96 horas, com 80% de confluência máxima, as células foram tratadas com uma solução osteogênica bem definida(1) contendo 20 nM de dexametasona (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil), 50 μg/mL de ácido ascórbico (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil), e 10 mM de β-glicerofosfato (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil) (DAG)(1,6). O meio osteogênico foi trocado a cada dois dias. Essas células foram monitoradas por períodos de tratamento bem definidos quanto à diferenciação osteoblástica in vitro(1), em 7, 14, 21, e 28 dias.
Para cada cinco amostras de SCUH, cinco experimentos independentes (análise morfológica, detecção citoquímica de nódulos de mineralização, dosagem de cálcio, atividade de fosfatase alcalina, e conteúdo proteico total) foram feitos segundo os períodos de tratamento correspondentes, usando três réplicas cada (n = 300).
Análise morfológica
Fotomicrografias foram obtidas usando microscópio invertido (contraste de fase) Labomed TCM 400 (Feldmann Wild Leitz, Manaus, Brasil) e documentadas com uma câmera digital Canon Powershot A310 3.2 Mp (Canon, Califórnia, Estados Unidos).
Detecção citoquímica de nódulos de mineralização
Para detectar a capacidade de SCUH de mineralizar a matriz extracelular na forma de nódulos mineralizados, foi usada a coloração de von Kossa. Resumidamente, a camada de células foi fixada por formalina a 10% (10 min) e rigorosamente lavada com PBS (10 min). A seguir, foi adicionado nitrato de prata a 5% seguido da exposição à luz ultravioleta por 60 min. A camada de células foi novamente lavada com PBS (três vezes), imersa em tiossulfato de sódio a 5% por 3 min, corado com safranina a 0,5%. A análise citoquímica foi feita usando microscópio invertido (contraste de fase), Labomed TCM 400 (Feldmann Wild Leitz, Manaus, Brasil), e as fotomicrografias foram documentadas com uma câmera digital Canon Powershot A310 3.2 Mp (Canon, Califórnia, Estados Unidos).
Dosagem de cálcio
Foi utilizado um kit comercial (Enzipharma, São Paulo, Brasil) para quantificar a presença de cálcio no sobrenadante (ou cálcio livre) ou no precipitado (cálcio aprisionado) da cultura celular. Em cada período do experimento, o meio de cultura (sobrenadante) ou a camada de células (precipitado)foi coletado e congelado a -20°C em microtubos (EppendorfTM, Campinas, Brasil). A seguir o precipitado, camada contendo células e a matriz extracelular, foi digerido em 0,5 M de HCl durante 18 horas a 4°C e congelado até o momento da dosagem. As amostras foram lidas no leitor de microplacas-espectrofotômetro (Beckman Coulter, Califórnia, Estados Unidos) no comprimento de onda de 560 nm usando o cálcio como padrão de referência. O branco para a máquina foi água destilada (para o meio) e HCl 0,5 M (para o precipitado).
Atividade da fosfatase alcalina
Em cada período experimental, o meio de cultura foi coletado (1mL), transferido para um microtubo (EppendorfTM, Campinas, Brasil) e congelado a -20°C para posterior determinação da atividade da fosfatase alcalina. Resumidamente, alíquotas de 100 μL foram adicionadas ao meio da reação para a determinação da atividade enzimática usando um kit comercial (Enzipharma, São Paulo, Brasil). Depois de 10 minutos de incubação a 37°C, foram adicionados 100 μL de 1,0 M NaOH, interrompendo a reação. A densidade óptica foi medida no leitor de microplaca-espectrofotômetro (Beckman Coulter, Califórnia, Estados Unidos) na frequência de ondas de 405 nm.
Proteína total
O conteúdo de proteína total no sobrenadante da cultura celular foi determinado em todas as amostras usando o método de Bradford conforme proposto pelo fabricante (Bio-Rad kit™ – Bio-Rad, Califórnia, Estados Unidos). O meio de cultura foi coletado (1 mL), transferido a um microtubo (EppendorfTM, Campinas, Brasil) e congelado a -20°C para determinação posterior da proteína total. Resumidamente, alíquotas de 20 μL foram adicionadas ao meio de reação (1 mL) para a determinação da concentração de proteína solúvel. Após 5 minutos de incubação à temperatura ambiente, a reação foi interrompida e a densidade óptica foi medida no leitor de microplacas-espectrofotômetro (Beckman Coulter, Califórnia, Estados Unidos) na frequência de ondas de 405 nm.
Análise estatística
Os resultados bioquímicos foram mostrados em gráficos representando a média ± erro padrão da média. Os dados de cada ensaio foram analisados com software InStat 3.10 (GraphPad Inc., Califórnia, Estados Unidos) usando o teste estatístico de Kruskal-Wallis (p < 0,05) e o teste de comparaçÕes múltiplas de Dunn como pós-teste.
RESULTADOS
Análise morfológica
A cultura primária de SCUH foi inicialmente caracterizada como sendo composta de células arredondadas e mononucleares (Figura 1A) com adesão lenta a recipientes plásticos, aos 7 dias, durante a expansão in vitro (Figuras 1B e 1C) e que alcançavam confluência em 28 dias, adotando um fenótipo mesenquimal semelhante ao de fibroblasto (Figura 1D). A subcultura de células SCUH diminuiu em metade do tempo da confluência célular para 14 dias. Após o processo de semeadura para o ensaio de osteogênese, 80% de confluência foi obtida apenas em 4 dias, confirmando a expansão mais demorada dessas células imaturas derivadas de SCUH. Algumas unidades formadoras de colônias estromais aderentes (CFU) (Figura 1B) foram evidentes após 7 dias em expansão e poderiam sugerir ninhos de células tronco mesenquimais clonogênicas. A alteração fenotípica de células fibroblastoides ou indiferenciadas (Figuras 1C e 1D) para morfologia poliédrica ou cuboide semelhantes a osteoblastos (Figura 2A) ocorreu após 14 dias de osteoindução.
Figura 1. Etapa proliferativa na cultura primária de células SCUH. (A) Células mononucleares arredondadas e não aderentes, em 1 dia, (B) Unidade formadora de colônia aderente (seta preta) em 7 dias, (C) Células semelhantes a fibroblastos aderentes (seta branca) em 7 dias e (D) Monocamada de células confluentes, 28 dias
Figura 2. Análise morfológica do processo de osteodiferenciação. (A) Células com formato cubóide (seta branca), 14 dias após contato com o meio osteoindutor. (B-D) Coloração Von Kossa, sem formação de nódulos ósseos em 14 dias (B) ou demonstrando presença múltipla de pequenos nódulos de mineralização (setas pretas) em 21 dias (C-D)
Análise citoquímica
A osteoindução na cultura de células SCUH até 14 dias (Figura 2B) não exibiu sinais positivos de biomineralização. Entretanto, múltiplos nódulos mineralizados pequenos e corados de preto foram observados pelo método de von Kossa após 21 dias de osteoindução na cultura de SCUH-OPC (Figura 2C e Figura 2D), continuando o seu aumento em número e tamanho aos 28 dias.
Análise funcional
Todos os achados bioquímicos ajudaram a corroborar o processo de osteodiferenciação e nenhuma diferença significante foi observada entre os doadores de células SCUH para cada período de tratamento (p > 0,05). Em comparação com o meio puro osteoindutivo, o nível de cálcio no sobrenadante da cultura celular declinou em 21 dias (absorbância: 0,59 ± 0,02; p < 0,05) e, de forma mais significante, em 28 dias (absorbância: 0,53 ± 0,05; p < 0,01) (Figura 3A). Por outro lado, o nível de cálcio no precipitado representado pelas células aderentes e sua matriz extracelular aumentou durante o mesmo período de 21 dias (absorbância: 0,19 ± 0,01; p < 0,05) e obteve o maior valor em 28 dias em comparação com todos os períodos experimentais (absorbância: 0,28 ± 0,01; p < 0,001) (Figura 3B). A atividade da fosfatase alcalina teve um crescimento significante durante o período de 21 dias (38,31 ± 4,44 U/L; p < 0,05) até 28 dias (42,88 ± 2,75 U/L; p < 0,01) (Figura 3C). O conteúdo total de proteína se manteve inalterado durante os períodos experimentais em todas as amostras de SCUH-OPC (p > 0,05) (Figura 3D), salientando, assim, a expressão particular de fosfatase alcalina na osteogênese in vitro.
Figura 3. Análise funcional do processo de osteodiferenciação de SCUH-OPC com 7, 14, 21 e 28 dias. (A) Nível de cálcio em sobrenadante de cultura celular em comparação com o meio osteogênico (MO), (B) Nível de cálcio em precipitado de cultura celular, (C) Atividade de fosfatase alcalina e (D) Conteúdo total de proteínas no sobrenadante de cultura celular
DISCUSSÃO
Há um grande esforço para introduzir a terapia celular como uma opção para pacientes com defeitos ósseos. A coleta de células de SCU, uma rica fonte de células-tronco hematopoiéticas com benefícios práticos e éticos, representa um método não invasivo alternativo à coleta de MSC de medula óssea(3,11,16), embora também exiba desafios específicos para a regeneração óssea(1).
As culturas de células de SCUH são notoriamente heterogêneas em função da qualidade de preparados de laboratório, incluindo amostras de tecido fresco, meios de cultura celulares, presença de soro animal, citocinas, densidade celular, número de passagens mediante cultura e indução osteogênica(9,11,15). CondiçÕes ótimas em culturas de células SCUH incluem um volume mínimo aspirado de 33 mL, tempo da coleta até o isolamento de menos de 15 horas, e uma alta concentração inicial de células (1,0 × 106-108células)(4,5,17). é realizada a cocultura inicial de material hematopoiético e MSC derivados de SCUH (populaçÕes de células osteoprogenitoras e células aderentes aparecem após 3 a 5 semanas in vitro)(4,11,18). A clonogenicidade de células de SCUH é determinada pela presença de CFU(4) e a frequência da variação de MSC de 0 a 2,3 clones por 1,0 × 108 células(5). A cultura primária de SCUH demorou a atingir a confluência, de 34 dias (passagem 1) até 55 dias (passagem 1-2) subsequentes em função da presença de células mais imaturas(1). Uma vez estabelecida, a cinética de proliferação de células SCU não diferiu de maneira significante daquela de medula óssea, resultando em 20 duplicaçÕes de população dentro de 8 passagens(5), até mais de 50 duplicaçÕes de população após 15 semanas(4), assim como sua capacidade de multilinhagens(3,5,16). Diferentes meios de cultura incluindo α-MEM, DMEM, e MSCGM (suplemento de crescimento SingleQuot), enriquecido com soro fetal bovino a 10 a 15% ou lisado de plaquetas humanas e mistura osteogênica (DAG) em combinação com ou sem BMP-2 (10-7M) podem levar a uma grande quantidade de Cbfa1/Runx2, colágeno I(1,6,19), fosfatase alcalina, matriz extracelular mineralizada(1,6,7,19), osteocalcina, osteonectina, osteopontina, vimentina, sialoproteína óssea, fator de crescimento fibroblástico-2 e fator de crescimento endotelial vascular, dentre outros marcadores ósseos em culturas celulares de SCU ao longo de 21 dias de diferenciação osteoblástica(1,6). A exposição precoce a um meio com suplementos osteogênicos e plasma humano aumentou de maneira marcada o crescimento célular estromal e a taxa de diferenciação osteogênica, sugerindo que SCU de feto a termo possa agir como uma fonte adequada de OPC, o que terá um impacto significativo sobre o desenvolvimento de constructos ósseos autólogos produzidos pela engenharia de tecidos(2). Esses protocolos corroboram nossa boa experiência usando um volume de amostra adequado (40 a 50 mL de SCUH), meio de cultura (RPMI para a co-cultura inicial de células hematopoiéticas e mesenquimais, e α-MEM com soro bovino fetal a 20% para proliferação mesenquimal e proliferação de OPC), e DAG no passo de osteoindução. Além disso, a similaridade morfológica de células SCUH que haviam passado por criopreservação por 0,1 a 5 anos com amostras frescas(7,11) e seu armazenamento de rotina em bancos biológicos poderiam salientar o valor clínico imediato de SCUH(20).
Entretanto, o isolamento e a expansão celulares têm tido mais sucesso usando amostras de medula óssea (10:10)(9), tecido adiposo (10:10)(21) e matriz de cordão umbilical (MCU) [8:8(9) ou 10:10(20)], em comparação com as taxas variáveis nas amostras de SCU [10%(20), 46%(4), ou 63%(5,21)]. A frequência de CFU é a mais baixa em SCU, mas SCU-MSC pode ser cultivado por tempo mais longo e demonstra a maior capacidade proliferativa(21) por causa da imaturidade das células de recém-nascidos(1), tornandose assim um bom substituto para medula óssea, que tem um procedimento altamente invasivo e decresce em número de MSC e potencial de diferenciação com o aumento da idade(1,3,10,21). Além disso, as células SCU-MSC expandidas in vitro retêm baixa imunogenicidade e um efeito imunomodulatório em linfócitos e células dendríticas maduras, o que é ideal para aplicaçÕes alogênicas no futuro(10).
Nossos resultados, baseados em boas práticas laboratoriais e um protocolo proficiente, poderiam sugerir a presença de CFU durante a etapa de expansão de células SCUH e acompanhar seu processo bem definido de osteodiferenciação in vitro. Esse comportamento biológico particular poderia ser explicado pela morfologia celular cuboide que se assemelha a osteoblastos em 14 dias(1) e a presença de matriz óssea extracelular ao longo de 21 dias, detectada na análise citoquímica com típicos nódulos de mineralização, em culturas de osteoblastos(1,6,19) e na análise funcional com a manutenção do conteúdo de proteína total, sugerindo o estabelecimento de crescimento celular em direção a um processo de diferenciação, aumento de expressão da fosfatase alcalina(13,19), e alteraçÕes no metabolismo de cálcio (decréscimo de nível no sobrenadante e aumento de depósito em pellets) durante a etapa de osteoindução(1,14). Dessa maneira, como uma fonte arquetípica de células osteoprogenitoras que podem ser colhidas, enriquecidas e expandidas in vitro, as células de SCUH foram descritas como significantes para a medicina regenerativa(11,15).
Múltiplos estudos pré-clínicos testaram as SCUH em terapias baseadas em células para o reparo ósseo, mas raros estudos clínicos foram realizados(15). As células de SCUH podem se aderir e espalhar com eficiência em estruturas baseadas em fosfatos de cálcio (hidroxiapatita/ fosfato tricálcico)(2), colágeno poroso(3,6), colágeno/fosfato tricálcico(12), ou ácido poli(láctico-ácido glicólico)/ hidroxiapatita(13). Além disso, elas podem continuar até a diferenciação osteoblástica(2,3,6), promover osteogênese ectópica(13), ou aumentar o reparo ósseo em defeitos de calvárias de ratos em até 78% em 12 semanas(14). A capacidade de células SCUH de se diferenciarem em osteoblastos maduros quando cultivadas dentro de coágulos plasmáticos humanos sugere sua potencial aplicação em cirurgia ortopédica(3). Curiosamente, um estudo clínico recente realizado em pacientes adultos com pseudoartrose óssea traumática, demonstrou que o autotransplante do osso ilíaco apresentou diferenças estatisticamente significantes com um tratamento baseado em células (células alogênicas estromais SCUH conjugadas a plasma autógeno rico em plaquetas e pó de osso desmineralizado) que exibiu a maior e mais rápida restauração tibiofemoral, diminuindo pela metade o tempo de união óssea (6 meses). Dessa forma, o papel específico da terapia celular com SCUH na restauração óssea e a bioatividade relacionada aos seus carregadores auxiliares merece uma investigação melhor(17).
Considerando questÕes de segurança, disponibilidade, metodologia de transplante, rejeição e efeitos colaterais, argumenta-se que a terapêutica usando células de SCUH fornece um repositório confiável de células precursoras iniciais, e a presença confirmada de OPC neste trabalho encoraja seu uso como potencial fonte para protocolos de terapia celular para defeitos ósseos. A elucidação de aplicaçÕes não hematopoiéticas para SCU facilitará o desenvolvimento de terapia celular pioneira relevante(8). Ademais, o estudo de SCUH-OPC poderá fornecer novos modelos de pesquisa celular para a compreensão de malformaçÕes humanas e transtornos genéticos, além da possibilidade de testar os efeitos de diferentes drogas terapêuticas(20).
CONCLUSÃO
Poderíamos concluir que a cultura celular do sangue do cordão umbilical humano é uma técnica confiável que se estabelece como uma fonte alternativa de células osteoprogenitoras para necessidades experimentais. Mais testes em animais têm de ser conduzidos para validar seu uso e para estabelecer o controle de qualidade de futuras terapêuticas baseadas em células autólogas ou alogênicas que visam a reparação óssea.