Laser de baixa intensidade favorece a regeneração muscular em modelo experimental desnutrido e recuperado

Laser de baixa intensidade favorece a regeneração muscular em modelo experimental desnutrido e recuperado

Autores:

Maisa Cardoso da Silva,
Rafael Schimith da Silveira,
Cintia Yuri Matsumura,
Adriana Pertille

ARTIGO ORIGINAL

Fisioterapia e Pesquisa

versão impressa ISSN 1809-2950versão On-line ISSN 2316-9117

Fisioter. Pesqui. vol.25 no.2 São Paulo abr./jun. 2018

http://dx.doi.org/10.1590/1809-2950/17527425022018

RESUMEN

La terapia por láser de baja intensidad (Low-Level Laser Therapy - LLLT) es utilizada con frecuencia en las lesiones musculares, sin embargo, precisa ser investigada en modelo de desnutrición. El objetivo de ese estudio fue analizar los efectos de la LLLT en la regeneración muscular de ratones sometidos a la desnutrición y a la recuperación proteica. Fueron utilizados 40 ratones Wistar, recién-destetados, divididos en grupo control (C), que consumió ración normoproteica (el 14% caseína), y grupo desnutrido (D), que consumió ración hipoproteica (el 6% caseína) por 45 días y ración normoproteica hasta el final del experimento. Posteriormente, el músculo tibial anterior derecho que tuvo criolesión y fue tratado con LLLT (AsGaAl 830nm, 30mW, 20J/cm²), tres veces a la semana, por 7 y 21 días. Hubo reducción del área de inflamación/regeneración en el grupo C21 comparado al D21 (p<0,05), siendo más evidente con la LLLT (C21L y D21L). El contenido de TNF-α fue reducido después de 21 días de la lesión. El área de densidad de tejido conjuntivo (ADTC) fue más pequeña en los grupos C21 y C21L comparados a los respectivos grupos desnutridos (p<0,05). La LLLT redujo la ADTC en el grupo D21L cuando comparado del D21 (p<0,05), sin embargo, el contenido de TGF-β1 no fue influenciado. El área de sección transversa (AST) de la fibra muscular incrementó en los grupos 21 días. La m-TOR presentó contenido más grande en el grupo C21L cuando comparado al D21L (p<0,05). Se concluyó que la LLLT favoreció la regeneración muscular en la etapa tardía en el modelo experimental de desnutrición posnatal y posterior recuperación proteica.

Palabras clave Desnutrición; Músculos/Lesiones; Terapia por Luz de Baja Intensidad

INTRODUÇÃO

Lesões musculares são comuns e a incapacidade gerada por elas está diretamente relacionada às propriedades intrínsecas de recuperação do músculo1. Essas envolvem a presença de células satélites com capacidade de proliferação e diferenciação de novas fibras e a formação da cicatriz2, composta principalmente por colágeno, devido ao acúmulo de matriz extracelular3.

Como opção de tratamento para a recuperação de lesões musculares, a terapia por laser de baixa intensidade (Low-Level Laser Therapy - LLLT) é utilizada, pois modifica o metabolismo celular4 e apresenta uma série de vantagens quando comparada aos tratamentos convencionais, tais como: diminuir o tempo de cicatrização e garantir melhor reparo da lesão em pacientes que, por conta de alguma condição sistêmica, como a desnutrição, o diabetes e o hipotireoidismo, têm esse processo prejudicado5.

A desnutrição é uma condição decorrente do aporte insuficiente de nutrientes e energia ou do inadequado aproveitamento biológico dos alimentos ingeridos, não se relacionando, necessariamente, à condição de fome do indivíduo6. Na desnutrição, o processo de reparação tecidual é prejudicado, pois há alterações no processo de síntese proteica e quebra de colágeno7.

Efeitos positivos da LLLT no reparo de feridas cutâneas de animais desnutridos foram observados, com diferentes comprimentos de onda e densidades de energia8),(9, entretanto a ação da LLLT na regeneração muscular de animais desnutridos é pouco explorada.

O objetivo deste estudo foi analisar os efeitos da LLLT (830nm) na regeneração muscular de ratos submetidos à desnutrição e recuperação proteica.

METODOLOGIA

Foram utilizados 40 ratos jovens da linhagem Wistar mantidos no Biotério da Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade Metodista de Piracicaba (Unimep), sob temperatura ambiente de 23ºC±2ºC, ciclo claro/escuro de 12 horas e água e ração ad libitum. O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Unimep), sob o protocolo nº 03/2016.

As dietas normoproteica (AIN 93M - 14%) e hipoproteica (AIN - 6%), comercializadas por Prag Soluções Serviços e Comércio Ltda. foram utilizadas, como descrito na Tabela 1.

Tabela 1 Composição das dietas normoproteica (14%) e hipoproteica (6%) utilizadas pelos grupos 

Ingredientes Dieta AIN 93 - 14% proteína (p/1kg) Dieta AIN - 6% proteína (p/1kg)
Amido de milho 465,7 508,0
Caseína 140,0 66,0
Amido dextrinizado 155,0 166,5
Sacarose 100,0 121,0
Óleo de soja 40,0 40,0
Fibra 50,0 50,0
L-cistina 1,8 1,0
Cloreto colina 2,5 2,5
Mix mineral G 35,0 35,0
Mix vitamínico 10,0 10,0
Total 1000,0 1000,0

Fonte: Reeves, Nielsen e Fahey Jr10

Inicialmente, os animais com 21 dias de vida foram divididos aleatoriamente em dois grupos - Controle (C, n=20): recebeu a dieta normoproteica; e Desnutrido/Recuperado (D, n=20): recebeu dieta hipoproteica por 45 dias e, posteriormente, foram recuperados com dieta normoproteica até o final do experimento. Ao completar 90 dias de dieta (111 dias de vida), todos os animais sofreram criolesão e foram subdividos em 8 grupos (n=5): Lesão 7 dias (C7/D7); Lesão+LLLT 7 dias (C7L/D7L); Lesão 21 dias (C21/D21); Lesão+LLLT 21 dias (C21L/D21L), sendo eutanasiados ao final do tratamento.

Para a criolesão os animais foram anestesiados com injeção intraperitoneal (cloridrato de cetamina 1,16g/10mL e cloridrato de xilazina 2g/100mL, dose de 0,09 e 0,06mL/100g de massa corporal, respectivamente). O músculo tibial anterior (TA) direito foi exposto e pressionado com uma barra metálica de 1cm×0,5cm resfriada em nitrogênio líquido por 10 segundos. O procedimento foi realizado duas vezes, segundo o protocolo de Miyabara et al.11.

Para o tratamento utilizou-se o laser de baixa intensidade de diodo AsGaAl 830nm, potência de 30mW e densidade de energia de 20J/cm², por meio da técnica pontual (único ponto) acima da área lesada, sendo os animais contidos manualmente por um pesquisador enquanto outro aplicava o laser. O tratamento iniciou-se 24 horas após a lesão, três vezes na semana, em dias intercalados12. Os animais dos grupos C7L e D7L receberam três sessões e os animais dos grupos C21L e D21L receberam nove sessões de tratamento.

Após o período experimental, os animais foram anestesiados como descrito anteriormente e eutanasiados. O músculo TA foi retirado, pesado e dividido transversalmente em duas partes iguais para microscopia de luz e para immunobloting.

Os músculos congelados foram seccionados transversalmente (10μm) utilizando um criostato (HYRAX C 25 - Zeiss), os cortes foram corados com hematoxilina e eosina. Utilizaram-se as lâminas para mensuração da área de secção transversa (AST), da área de inflamação/regeneração (%Infl/Reg) e da área de densidade de tecido conjuntivo (ADTC), utilizando microscópio óptico com câmera acoplada, com objetiva de 20× e conectado a um computador com software Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics).

Para AST da fibra muscular foram analisadas, por animal, 200 fibras em regeneração, caracterizadas pelo núcleo centralizado. Para a mensuração da ADTC avaliaram-se 15 imagens por animal, e sobre as imagens foi sobreposta uma grade contendo 88 intersecções, na qual contabilizou-se quais estavam sobre o tecido conjuntivo e, posteriormente, o resultado foi transformado em porcentagem.

Caracterizou-se a área de inflamação e regeneração por apresentar intenso infiltrado inflamatório e fibras em estágio inicial de regeneração. Essas fibras possuem pequeno diâmetro, citoplasma escasso fortemente basófilo e núcleo central13. Para essa análise utilizou-se o microscópio óptico com câmera acoplada, com objetiva de 4× para realização das fotos do corte transversal. Posteriormente as imagens foram montadas analisadas no programa Image J, calculando a área total do músculo e a área com infiltrado inflamatório e com fibras em processo inicial de regeneração.

Para o immunoblotting outra parte dos músculos foi cortada em pequenos pedaços e homogeneizada em tampão específico, a 4ºC, usando homogeneizador tipo Polytron PTA 20S (Brinkmann Instruments, Westbury, NY, EUA) operado em velocidade máxima por 30 segundos. Os extratos foram centrifugados a 11.000rpm a 4ºC por 20 minutos e o sobrenadante utilizado para quantificação da proteína total. As amostras foram tratadas com tampão Laemmli e aquecidas em banho seco por 5 minutos. Em seguida, aplicaram-se 50mg de proteína em gel SDS-poliacrilamida a 12% em aparelho para eletroforese da Bio-Rad (mini-Protean, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EUA). Realizou-se a eletrotransferência do gel para a membrana de nitrocelulose em 90 minutos a 120V. As membranas foram lavadas com solução basal e incubadas com 10mg de anticorpo primário (TGF-β1 (transforming growth factor beta), mouse monoclonal, Sigma-Aldrich, T7039; TNF-α (tumor necrosis factor alfa), mouse monoclonal, Sigma, T0157; m-TOR (mammalian target of rapamycin), rabbit policlonal, Sigma, T2949; GAPDH (Glicealdeido 3-fosfato dehidrogenase), mouse monoclonal, Santa Cruz, SC-59540) diluído em 10mL de solução basal contendo 1% de leite desnatado a 4ºC durante a noite. No dia seguinte, as membranas foram lavadas com solução basal e incubadas em 10mL de solução basal contendo 1% de leite desnatado e 2,5mg de anticorpo secundário (Goat Anti-Rabbit IgG-HRP, Santa Cruz: sc-2004; Goat Anti-Mouse IgG-HRP, Santa Cruz: sc-2005) por 2 horas em temperatura ambiente. Posteriormente, as membranas foram novamente lavadas com solução basal e expostas à solução de quimioluminescência (Pierce) por 5 minutos e, em seguida, o sinal fluorescente foi captado no equipamento G-Box (GeneSys).

Após obtenção de bandas, as membranas foram lavadas com solução basal e incubadas com 10mL de Stripping Buffer (10mM Tris-HCl pH 7,5; β-Mercaptoethanol 0,1M; Ureia 8M) durante 1 hora, a 60ºC e incubadas em Tris-HCl 1M pH7,5 por 30 minutos, lavadas com solução basal e processadas conforme descrito previamente para marcação da proteína GAPDH, uma proteína de controle interno, cuja quantidade não se altera em diferentes condições fisiológicas. As bandas foram digitalizadas e quantificadas por densitometria óptica usando o programa Image J (The National Institute of Health, EUA).

Analisaram-se os dados pelo software Bioestat versão 5.0, e a normalidade pelo teste de Shapiro-Wilk. Para análise de variância foi utilizado o teste ANOVA One Way, com pós-teste de Tukey. Foi considerado significativo um valor de p≤0,05.

RESULTADOS

Após o desmame todos os animais apresentavam a mesma massa corporal (40,2±2,7g). Ao final dos primeiros 45 dias do protocolo, o grupo D apresentou redução estatisticamente significativa na massa corporal quando comparado ao C (53±7,2 versus 293,5±18,6g, p<0,05). Após a fase de recuperação nutricional (90 dias), o grupo D aumentou a massa corporal, entretanto, não atingiu os valores do C (305±20,4 versus 389,7±33g, p<0,05).

Nos cortes histológicos observa-se nos grupos 7 dias grande infiltrado inflamatório e tecido conjuntivo, principalmente no grupo D7L, com a presença de pequenas fibras musculares no estágio inicial da regeneração. No grupo C7L observa-se a redução do infiltrado inflamatório e tecido conjuntivo. Nos grupos 21 dias observa-se o aumento da AST das fibras regeneradas (com núcleo centralizado) em todos os grupos, principalmente no grupo C21L (Figura 1).

Figura 1 Cortes transversais histológicos corados com HE do músculo tibial anterior lesado dos grupos avaliados. Notar o infiltrado inflamatório e aumento do tecido conjuntivo nos grupos 7 dias. Aumento da AST nas fibras com núcleo centralizado nos grupos 21 dias 

Na fase aguda do processo de regeneração muscular observou-se que os grupos C7 e D7 apresentaram o mesmo comportamento em relação ao processo inflamatório. Entretanto, na fase crônica, há maior área de inflamação no grupo D21 comparado ao C21 (p<0,01, Figura 2 A e C). A LLLT favoreceu a redução da área de inflamação/regeneração no grupo C7L comparado ao C7 (p<0,01), sem alterar o conteúdo muscular da citocina TNF-α. No grupo D7L houve aumento da área de inflamação/regeneração e diminuição do conteúdo de TNF-α comparado ao D7 (p<0,05; Figura 2A e C). Na fase crônica, a LLLT favoreceu a redução da área de inflamação, entretanto não ficou evidenciada a interferência do tipo de dieta nesse contexto.

Figura 2 Análise da inflamação nos grupos avaliados 

Em relação à quantificação do tecido conjuntivo, na fase inicial da regeneração, a LLLT favoreceu a redução da ADTC apenas no grupo C7L quando comparado ao C7 (p<0,01; Figura 3A). O conteúdo da citocina TGF-β1 foi similar entre todos os grupos 7 dias (Figura 3C). Com o transcorrer do processo de regeneração houve redução da ADTC nos grupos controles (C21 e C21L) e no grupo D21L quando comparado aos respectivos grupos 7 dias (p<0,01). O efeito positivo da LLLT ficou evidente no grupo D21L, com a redução da ADCT quando comparado ao D21 (p<0,01; Figura 3A). Entretanto, o conteúdo da citocina TGF-β1 apresentou redução apenas no grupo C21 quando comparado ao C7 (p<0,01; Figura 3C.)

Figura 3 Quantificação do tecido conjuntivo nos grupos avaliados 

A AST e o conteúdo da proteína m-TOR foram similares entre todos os grupos 7 dias (Figura 4A e C), entretanto, após 21 dias da lesão, apenas o grupo C21 apresentou maior AST e aumento no conteúdo da m-TOR quando comparado ao C7 (p<0,01; Figura 4A e C). A LLLT favoreceu o aumento da AST da fibra muscular e conteúdo de m-TOR no grupo C21L quando comparado aos grupos C21 e D21L (p<0,01; Figura 4A e C). Nos animais desnutridos, o conteúdo da proteína m-TOR foi similar entre os grupos.

Figura 4 Análise da fibra muscular nos grupos avaliados 

DISCUSSÃO

Neste estudo observou-se nos animais controle a resposta gradativa do processo de regeneração, com redução da inflamação, diminuição do TNF-α muscular e do TGF-β1 e aumento da proteína m-TOR e da AST da fibra muscular, sendo o processo favorecido pela irradiação da LLLT. Os resultados dos grupos desnutridos sugerem que o processo de regeneração acontece de forma mais lenta, com acúmulo de tecido conjuntivo e déficit na recuperação da AST das fibras musculares regeneradas, que também são minimizados pela irradiação da LLLT.

O protocolo de desnutrição pós-desmame utilizado neste estudo foi eficaz, comprometendo o desenvolvimento do animal, evidenciado pela redução da massa corporal do grupo desnutrido. Esses resultados corroboram com Escriva et al.14, que afirmam que a redução da massa corporal de ratos jovens por dieta hipoproteica é consequência de alterações funcionais da insulina nos tecidos. Ihemelandu15 afirma que a desnutrição afeta o crescimento e a diferenciação das células, e que danos ao sistema muscular com redução de proteínas são fundamentais para diminuição do peso corporal na fase adulta.

No processo de regeneração das fibras musculares de um indivíduo normalmente nutrido, após 48 horas da lesão, as partes necrosadas das fibras musculares são removidas por macrófagos, ao mesmo tempo inicia-se a formação do tecido conjuntivo por fibroblastos. No terceiro dia ocorre a ativação das células satélites e no quinto dia inicia-se a fusão de mioblastos, e o tecido conjuntivo tornou-se mais denso. No sétimo dia, as células musculares regeneradas começam a invadir a região da cicatriz e, por volta do 21º dia, as miofibrilas se fundem, com pouco tecido conjuntivo entre elas16.

A LLLT é utilizada para acelerar o processo de regeneração como observado por Renno et al.17, que avaliaram ratos submetidos à criolesão e tratados com laser AsGaAl (808nm, 50mw e densidades de energia de 10J/cm2 e 50J/cm2) e encontraram redução das áreas de infiltrado celular e de lesão comparados ao grupo controle após 13 dias. Resultado semelhante foi encontrado após 21 dias de criolesão nos grupos controle e desnutrido neste trabalho.

Aimbire et al.18 observaram em ratos com lesão pulmonar que a LLLT (AsGaAl, com potência de 1.0, 2.5 e 5mW e comprimento de onda de 650nm) reduziu de forma significativa os níveis séricos de TNF-α nos animas que receberam a irradiação quando comparados ao grupo controle, sendo o efeito dose dependente.

Neste estudo não observamos tal efeito no conteúdo muscular do TNF-α, provavelmente por não representar o conteúdo plasmático da citocina avaliada na maioria dos trabalhos.

O atraso na regeneração dos animais desnutridos e recuperados após 21 dias, sugerida pela maior área de inflamação no grupo D21, confirma o observado por Pertille et al.19 aos 14 dias após criolesão com o mesmo protocolo de desnutrição.

Lopes et al.20 realizaram análise histopatológica e morfométrica do músculo sóleo de ratos submetidos a dieta hipoproteica nos primeiros dias de vida, com posterior recuperação. No grupo normalmente nutrido, a análise do tecido conjuntivo mostrou predominância do colágeno tipo I distribuído de forma organizado. O grupo desnutrido apresentou predominância de colágeno tipo III de forma desorganizada e no grupo recuperado houve retorno do colágeno tipo I, mas parcialmente organizado. O colágeno tipo I é responsável por formar fibras paralelas que conferem força tênsil e rigidez21, e a laserterapia acelera o processo de reparo tecidual com aumento na produção e melhora na organização de fibras colágenas22.

Neste estudo, o efeito positivo da LLLT ficou evidente no grupo D21L, com a redução da ADCT. Entretanto, o conteúdo da citocina TGF-β1 apresentou redução apenas no grupo controle 21 dias. Essa citocina é importante na síntese e remodelação da matriz extracelular, sendo assim, comumente utilizada para investigar a formação de fibrose23.

Além disso, a LLLT favoreceu o aumento da AST dos grupos 21 dias, principalmente do grupo C21L, no qual houve aumento da proteína m-TOR, uma proteína quinase encontrada em dois complexos multiproteicos, sendo um deles o mTORC124, regulador central do crescimento celular, por controlar a tradução de RNAm e, consequentemente, a síntese de proteínas25.

O aumento da AST nas fibras com LLLT confirma o observado em trabalhos anteriores no músculo TA, mas com diferentes parâmetros da LLLT26),(27.

Outros estudos deverão ser realizados para avaliar o tipo de colágeno encontrado na área na lesão, como também a avaliação de marcadores de inflamação sistêmico.

CONCLUSÃO

A terapia com laser de baixa intensidade 830nm nos parâmetros utilizados favoreceu a regeneração muscular na fase tardia (21 dias) no modelo experimental de desnutrição proteica pós-natal e posterior recuperação nutricional.

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