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Laser de baixa intensidade nos aspectos morfológicos periarticulares do joelho de ratos Wistar em modelo de artrite reumatoide

Laser de baixa intensidade nos aspectos morfológicos periarticulares do joelho de ratos Wistar em modelo de artrite reumatoide

Autores:

Morgana Neves,
Alana Ludemila de Freitas Tavares,
Ana Caroline Barbosa Retameiro,
Taciane Stein da Silva Leal,
Lucinéia de Fátima Chasko Ribeiro,
Gladson Ricardo Flor Bertolini

ARTIGO ORIGINAL

BrJP

versão impressa ISSN 2595-0118versão On-line ISSN 2595-3192

BrJP vol.3 no.1 São Paulo jan./mar. 2020 Epub 27-Fev-2020

http://dx.doi.org/10.5935/2595-0118.20200003

INTRODUÇÃO

A artrite reumatoide (AR) é caracterizada como doença inflamatória, sistêmica, e de caráter autoimune, que afeta o tecido articular e as estruturas periarticulares1. A simetria é característica fundamental da doença que evolui de forma assimétrica para simétrica, com a progressão das manifestações patológicas. Eventos inflamatórios iniciais acometem a membrana sinovial, apresentando hiperplasia celular e processo inflamatório intenso, denotando sinovite2. A membrana sinovial possui inervação marcada pela presença de fibras nervosas positivas para neuropeptídios pró-inflamatórios, como a substância P (sP) e o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP), tanto na camada íntima, como na subíntima, e ao redor dos vasos sanguíneos3. Tais neuropeptídios são resultado de condução nervosa antidrômica, chegando à articulação acometida causando efeitos pró-gênese dos processos articulares inflamatórios crônicos, caracterizado pela inflamação neurogênica4. O estímulo lesivo, junto com o início da inflamação desencadeada por eventos do sistema imune, como o que ocorre na AR, sensibilizam os neurônios nociceptivos primários, e em resposta, ocorre a exacerbação do quadro álgico e inflamatório. Dentre os recursos de tratamentos conservadores, utilizados no controle do quadro álgico e modulação dos eventos inflamatórios, está o laser de baixa intensidade (LBI). Essa terapia é eficaz para estimular a cicatrização de feridas, reduzir o processo inflamatório e analgesia, e o principal alvo da luz irradiada é o citocromo C oxidase, localizado na mitocôndria. A interação resulta no aumento do metabolismo, levando à transdução do sinal para outras regiões celulares5 favorecendo o reparo tecidual. O uso do recurso físico pode ser associado a outras terapias já estabelecidas para o controle inflamatório da doença, caracterizada por degradação da cartilagem articular e inflamação de tecidos periarticulares, culminando para redução da capacidade funcional, e sinais patológicos encontrados em pacientes com AR6. No entanto, o LBI possui efeitos diferenciados nos tecidos, de acordo com os parâmetros de uso, como dose, comprimento de onda, e local de aplicação. Estudos acerca dos efeitos deletérios da AR na membrana sinovial são escassos, e pouco se sabe sobre essas ações no tecido ósseo periarticular. Além disso, sendo essas importantes estruturas envolvidas na função articular, torna-se pertinente a especificidade de tratamentos conservadores que possam modular o perfil inflamatório e a remodelação tecidual periarticular, possibilitando a manutenção da função e qualidade de vida dos indivíduos acometidos pela doença que possui caráter crônico. A hipótese do estudo é que a doença possa induzir efeitos teciduais além do líquido sinovial, mas também em tecidos adjacentes, como a membrana sinovial e região periférica óssea. Além disso, verificar se o LBI, devido às suas propriedades, demonstra efeitos benéficos sobre esses tecidos. Diante do exposto, o objetivo deste estudo foi avaliar se o LBI apresenta efeitos sobre a morfologia dos tecidos periarticulares de ratos submetidos à artrite reumatoide experimental.

MÉTODOS

O estudo foi do tipo experimental e aleatorizado, composto por 64 ratos machos, da linhagem Wistar, com idade de 15 semanas, peso 300±19g, mantidos em caixas plásticas de polipropileno, com acesso à água e ração ad libitum, temperatura controlada a 21°C±1°C, e fotoperíodo claro/escuro de 12 horas. Os animais foram aleatorizados utilizando o programa Microsoft Excel 2016, e separados em dois períodos inflamatórios da doença, agudo (7 dias de inflamação) e crônico (28 dias de inflamação). Ainda, foram subdivididos em quatro grupos cada, GC (grupo controle), GL (grupo lesão), GCLa (grupo controle laser), e GLLa (grupo lesão laser) (Figura 1).

Fonte: autora. GC = grupo controle; GL= grupo lesão, GCLa = gtupo controle laser; GLLa = grupo lesão laser.

Figura 1 Esquematização dos grupos amostrais 

Modelo experimental de artrite reumatoide induzida por Adjuvante Completo de Freund

Inicialmente os animais foram submetidos a um protocolo de pré-sensibilização7 por meio de uma inoculação intradérmica na base da cauda de 50µL de CFA (Adjuvante Completo de Freund, Difco®, 0,5mg/mL, Mycobacterium butirycum) para os animais de GL e GLLa, ou solução fisiológica a 0,9% (SF), Aster® para os animais de GC e GCLa. Para tanto, a área de administração da substância foi tricotomizada e submetida à assepsia do local da injeção com álcool iodado a 1% (Rialcool®). Em seguida, os animais receberam a injeção com uma seringa de 1mL e agulha 13x4.5mm. Adotou-se a inserção da agulha aproximadamente 1cm na base da cauda por via subcutânea. Esse procedimento de injeção intradérmica foi

o primeiro estímulo inflamatório, sete dias antes da injeção via intra-articular. A injeção intra-articular de 50µL (0,5mg/mL) de CFA ou SF, foi administrada na articulação tibiofemoral direita dos animais. Os animais foram contidos manualmente. A área anterior do joelho do membro pélvico direito foi tricotomizada e feita a assepsia com álcool iodado a 1%. Em seguida, a injeção foi aplicada com uma seringa de 1mL e agulha 13x4,5 mm.

Protocolo de tratamento

Os animais dos grupos GCLa e GLLa foram submetidos ao tratamento com LBI5,8 (Laserpulse - Ibramed®), na região do joelho do membro pélvico sensibilizado. Os pontos para aplicação foram: anterior à patela, face medial na articulação tibiofemoral, face lateral na articulação tibiofibular, e posterior em região poplítea. Os parâmetros de tratamento foram: técnica pontual, em quatro pontos, comprimento de onda de 660 nanômetros, potência de 30mW, área de spot: 0,06cm2, densidade de energia: 5J/cm2 por ponto, tempo por ponto: 10 segundos, energia total por ponto: 0,003J, totalizando 4 aplicações nos animais do grupo agudo, e 14 aplicações nos animais do período inflamatório crônico em dias intercalados. O equipamento foi aferido quanto à sua potência, antes do início do tratamento.

Análise morfológica

Após o período experimental, os animais do período inflamatório agudo (7 dias de inflamação) e crônico (28 dias) foram submetidos à eutanásia por decapitação em guilhotina, previamente anestesiados com injeção intraperitoneal de cloridrato de cetamina, (Ketalar® - Brasil, 95mg/kg) e xilazina (Xilazin® - Brasil, 12mg/kg). Após a verificação do estado de consciência do animal (observado pela ausência de resposta motora ao pinçamento da cauda e pregas interdigitais), as articulações do joelho direito e esquerdo foram dissecadas, reduzidas em corte transverso de tíbia e fêmur e fixadas em metacarn (70% de metanol, 20% de clorofórmio, 10% de ácido acético glacial) por 48 horas. Depois, as peças foram fixadas em álcool a 70% (Neon®) por 15 dias. Realizou-se a lavagem do material por 24 horas em água corrente. As articulações foram descalcificadas em ácido tricloroacético a 5% (Neon®) por 7 dias, seguindo para procedimento histológico de rotina para inclusão em parafina (Alphatec®). Realizou-se cortes em plano sagital em micrótomo Olympus CUT 4055, em 7µm de espessura, e montadas em lâminas de vidro. Para a coloração, utilizou-se protocolo de hematoxilina e eosina (Synth®). As lâminas foram analisadas em microscópio de luz, e fotomicrografadas em microscópio Olympus® DP71 (USA). Na análise morfológica, observaram-se aspectos normais e alterações da membrana sinovial, e região periarticular óssea de fêmur e tíbia (Figura 2).O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Uso Animal (CEUA) da Universidade Estadual do Oeste do Paraná (UNIOES-TE) 27/10/2017.

Figura 2 Esquematização da articulação do joelho, demonstrando os locais de análise periarticular de fêmur e tíbia (campo demarcado)  

RESULTADOS

A análise morfológica da membrana sinovial GC (Figura 3A, B, C, D), apresenta aspectos normais da membrana sinovial organizada em duas camadas de células (sinoviócitos) na íntima sinovial, e subíntima, com predominância de células adiposas, vasos sanguíneos e conjuntivo sem alterações. Os animais do GCLa (Figura 3I, J, K, L) apresentaram aspectos morfológicos semelhantes ao GC. No entanto, a membrana sinovial dos animais do GL (Figura 3C, D, E, F), revelaram intenso processo inflamatório, com espessamento da íntima sinovial desorganizada quanto à distribuição epitelioide dos sinoviócitos. Subíntima com ausência de adipócitos, aumento do número vasos sanguíneos, caracterizando sinovite articular. No GLLa (Figura 3I, J, K, L), a membrana sinovial mostrou discreta organização celular, e reorganização dos adipócitos, mostrando recuperação tecidual. Nos animais do GL agudo (Figura 3F), o membro pélvico esquerdo (não sensibilizado) apresentou alterações morfológicas da membrana sinovial, o que não foi observado nos animais do grupo crônico, que mantiveram aspectos morfológicos normais no membro não sensibilizado. Na análise da região periarticular de fêmur (Figura 4) e tíbia (Figura 5) dos animais do grupo controle (A, B, C, D) verificou-se aspectos normais do tecido ósseo, com periósteo em suas camadas osteogênica e fibrosa, matriz óssea com aspecto de osso compacto e presença de vasos sanguíneos. Nos animais do GL (E, F, G, H), no fêmur (Figura 4) e tíbia (Figura 5), encontrou-se diferenças morfológicas comparado ao GC, o tecido apresenta-se com intenso processo inflamatório no periósteo, na camada osteogênica, presença de células inflamatórias diferenciadas, lacunas e modificação do osso compacto na região da matriz óssea para característica de osso esponjoso. As modificações morfológicas periarticulares foram verificadas com maior evidência tanto no fêmur quanto na tíbia dos animais do grupo agudo, ainda apresentando alterações no membro contralateral não sensibilizado (Figura 4). Fêmur e tíbia dos animais do GLLa (F, G, H, I), no período agudo, apresentaram aspectos morfológicos semelhantes ao GL. Já no período crônico, verificou-se remodelação tecidual com semelhanças morfológicas ao GC.

Figura 3 Fotomicrografias da membrana sinovial, períodos de inflamação agudo e crônico, membros direito e esquerdo respectivamente. Corte sagital, coloração em hematoxilina e eosina. GC (A, B, C, D) verifica-se aspectos normais da membrana sinovial organizada em duas camadas, a íntima sinovial, com sinoviócitos distribuídos em camadas (seta), subíntima organizada com predominância de adipócitos (Ad), cavidade articular (estrela) sem infiltrado inflamatório. No GL (E, F, G, H), membrana sinovial com intenso processo inflamatório (seta vazada), espessamento da íntima sinovial (asterisco), e diminuição das células adiposas (Ad) na subíntima. No GLLa (I, J, K, L) no período inflamatório agudo, denota recuperação tecidual com discreta reorganização dos adipócitos. 

Figura 4 Fotomicrografias do fêmur, região periférica periarticular, período inflamatório agudo e crônico, direito e esquerdo respectivamente Corte longitudinal, coloração hematoxilina e eosina. GC (A, B, C, D) aspectos normais do tecido ósseo, periósteo em suas camadas fibrosa (Pof), osteogênica (Poo), e matriz óssea (Mo) com presença de vasos sanguíneos (Vs). GL (E, F, G, H) tecido denota presença de células inflamatórias, e modificação do osso compacto para característica de osso esponjoso (asterisco). GLLa (I, J) no período inflamatório agudo, apresentam aspectos morfológicos semelhantes ao GL, com início de remodelação tecidual. Já no GLLa período inflamatório crônico (K, L) revelam semelhanças ao GC com remodelação tecidual.  

Figura 5 Fotomicrografias da tíbia região periférica periarticular, período inflamatório agudo e crônico, direito e esquerdo respectivamente. Corte longitudinal, coloração hematoxilina e eosina. GC (A, B, C, D) aspectos normais do tecido ósseo, periósteo em suas camadas fibrosa (Pof) e osteogênica (Poo), matriz óssea (Mo) com presença de vasos sanguíneos (Vs). GL (E, F, G, H) tecido denota presença de células inflamatórias, e modificação do osso compacto para característica de osso esponjoso (asterisco). GLLa (I, J) no período inflamatório agudo, apresentam aspectos morfológicos semelhantes ao GL. Já GLLa no período inflamatório crônico (K, L), denotam semelhanças ao GC com remodelação tecidual.  

DISCUSSÃO

No presente estudo, duas inoculações de CFA contendo Mycobacterium butyricum induziram o aparecimento de alterações morfológicas significativas, incluindo hiperplasia da membrana sinovial com sinovite característica e modificações ósseas periarticulares no fêmur e tíbia. Um estudo postulou que a indução adequada da AR consiste em duas injeções de CFA contendo uma micobactéria atenuada, considerando a classificação da doença, autoimune, o modelo é utilizado através da pré-sensibilização dos animais7. A patogênese da AR pode ser influenciada por potenciais inflamatórios de origem medular8. Estímulos como traumas mecânicos, alterações de pH, presença de mediadores inflamatórios, podem desencadear um processo denominado inflamação neurogênica9, que reflete na liberação de neurotransmissores do aferente primário, como sP e CGRP10, que potencializam a inflamação periférica. Um estudo inferiu que um nervo sensitivo contralateral à indução da artrite, conduz potenciais de ação em direção à periferia; também observaram que animais induzidos a um processo inflamatório por CFA, apresentaram maior atividade antidrômica espontânea quando comparados a um grupo controle. Em seu estudo, verificaram que as articulações contralaterais apresentaram extravasamento plasmático devido à presença de sP e CGRP, reafirmando a ação neuronal na formação do padrão simétrico lesional da AR11. No presente estudo, constatou-se que a membrana sinovial e tecido ósseo do membro pélvico não sensibilizado dos animais do GL apresentaram aspectos de hiperplasia celular. Outro estudo demonstrou que o LBI suprimiu a sinalização de fibras aferentes e modula a transmissão sináptica aos neurônios dos cornos dorsais, e inibição da sP, embasando os mecanismos neurais da eficácia da terapia a laser em condições dolorosas12. A membrana sinovial é inervada por fibras sP positivas, o que indica ser o estímulo inflamatório potencializador da AR3. Os resultados encontrados no presente estudo corroboram os outros achados que demonstraram ações da terapia a laser na redução da hiperplasia da membrana sinovial13. Na mesma linha, uma revisão sistemática para avaliar a eficácia do LBI no tratamento da AR concluiu que a terapia apresenta efeito benéfico quando utilizada com mínimo de quatro semanas, com efeitos na redução da dor e rigidez matinal, sintomas relatados por pacientes acometidos14.

O tecido inicialmente atingido pela inflamação na AR é a membrana sinovial, denotando hiperplasia celular e processo inflamatório que caracteriza o processo de sinovite2. Os animais dos grupos lesão apresentaram alterações morfológicas com intenso processo inflamatório. Nos casos de evolução da doença sem administração do tratamento adequado, há progressão dos eventos inflamatórios para outros tecidos, com destruição articular e perda óssea. As alterações ósseas periarticulares em pacientes com AR são causadas por aumento ósseo e reabsorção resultante do acúmulo de células inflamatórias, dentre elas linfócitos e macrófagos, e citocinas pró-inflamatórias que promovem a reabsorção óssea mediada por osteoclastos. As alterações qualitativas do osso periarticular na AR são pouco estudadas, mas de grande interesse, pois os pacientes acometidos são propensos a fraturas devido à fragilidade tecidual ocasionada pela perda óssea15. Neste estudo, avaliou-se a morfologia do tecido ósseo de fêmur e tíbia, na região periarticular, de ratos submetidos à AR experimental. Verificou-se que os animais do GL demonstraram alterações ósseas resultante de intenso processo inflamatório. Análises histopatológicas têm apresentado redução significativa da inflamação, destruição óssea, da cartilagem e formação de pannus com outras formas de terapia16, entretanto, não há evidência clínica quanto à relação entre o LBI e a análise óssea periarticular. A diminuição da força óssea associada à inflamação crônica, juntamente com as alterações significativas na qualidade e estrutura óssea, podem aumentar a suscetibilidade do osso à falência sob carga de baixa energia17. Os animais que foram tratados com LBI nos aspectos morfológicos ósseos no período inflamatório crônico, apresentaram remodelação tecidual. Sugere-se que o tratamento tenha proporcionado aumento do metabolismo, além da modulação do processo inflamatório no período experimental. O LBI causa vasodilatação, fator relevante para a inflamação articular, pois aumenta o suporte local de oxigênio e contribui para a migração de células imunes18 auxiliando no reparo tecidual19-23. Um estudo que avaliou os efeitos do LBI na modulação do processo inflamatório, utilizando modelo experimental com animais, concluiu que o tratamento apresenta melhores efeitos quando administrado nas fases crônicas da doença19. Ainda inferem que o comprimento de onda 660 nm é o mais indicado nessa fase, e que um plano de tratamento de três sessões, com intervalo de 1 dia entre elas, é suficiente para modular o perfil inflamatório da doença. No presente estudo, verificou-se que o comprimento de onda de 660 nm estimulou discreta organização celular e reorganização dos adipócitos, denotando recuperação tecidual. O LBI possui ações diferenciadas nos tecidos, de acordo com os parâmetros de uso, como dose, comprimento de onda, modo contínuo ou pulsado, duração e local do tratamento, e efeitos anti-inflamatórios quando utilizado na progressão da doença19,20. A terapia tem propriedades bioestimuladoras, causando aumento do metabolismo celular, síntese de colágeno, efeitos analgésicos e anti-inflamatórios5,21. Segundo um estudo, o uso do comprimento de onda de 670nm apresentou resultados satisfatórios como expressão de fatores de crescimento do endotélio vascular22. No presente estudo, o comprimento de onda utilizado foi de 660nm, e apresentou melhora morfológica tecidual quando comparado aos animais do GL22. A hipótese inicial do estudo foi verificar se o modelo experimental de indução da doença repercutia em alterações morfológicas dos tecidos periarticulares, e avaliar se o tratamento com LBI seria eficaz em reduzir os efeitos deletérios da lesão. Contudo, a hipótese pode ser confirmada devido às alterações encontradas nos animais dos grupos lesão, o que denota intenso processo inflamatório periarticular. O LBI também se mostrou eficaz em reduzir morfologicamente esses efeitos, mesmo não promovendo restauração tecidual. Além disso, o estudo limitou-se pelo protocolo com animais machos, sendo que a prevalência em humanos é no sexo feminino24-27. Sugere-se que sejam realizados estudos relacionados especificamente à morfometria do tecido ósseo para corroborar os achados morfológicos do presente estudo. Ainda, que sejam testados outros parâmetros do LBI, como intensidade, dose e comprimento de onda, para que os achados possam ser utilizados na prática clínica.

CONCLUSÃO

O LBI apresentou efeitos benéficos sobre a morfologia dos tecidos periarticulares de ratos submetidos à artrite reumatoide experimental.

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