Metformina sinergicamente potencializa os efeitos antiproliferativos de cisplatina e etoposídeo em linhagem de células de câncer humano de pulmão NCI-H460

Metformina sinergicamente potencializa os efeitos antiproliferativos de cisplatina e etoposídeo em linhagem de células de câncer humano de pulmão NCI-H460

Autores:

Sarah Fernandes Teixeira,
Isabella dos Santos Guimarães,
Klesia Pirola Madeira,
Renata Dalmaschio Daltoé,
Ian Victor Silva,
Leticia Batista Azevedo Rangel

ARTIGO ORIGINAL

Jornal Brasileiro de Pneumologia

versão impressa ISSN 1806-3713

J. bras. pneumol. vol.39 no.6 São Paulo nov./dez. 2013

http://dx.doi.org/10.1590/S1806-37132013000600002

Introdução

O câncer de pulmão (CP) é a neoplasia mais frequente e mortal na população mundial.( 1 ) No Brasil, o CP encontra-se entre os cinco tipos de câncer mais incidentes, segundo estimativas para 2012, e é o que mais fez vítimas entre os brasileiros em 2010.( 2 ) De posse desses dados, torna-se evidente que o CP é um desafio à saúde brasileira e mundial. Sabe-se que 85% de todos os casos de CP são classificados como CP não pequenas células (CPNPC), grupo composto por diferentes tipos histológicos, como adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas e carcinoma de células grandes, porém similares quanto a suas características clinicopatológicas.( 3 , 4 )

A quimioterapia é utilizada em pacientes nos estádios III e IV a fim de ampliar a sobrevida, controlar a doença e melhorar a qualidade de vida. ( 5 ) Em geral, os derivados de platina, tais quais a cisplatina e a carboplatina, cumprem bem esse papel quando associados a antineoplásicos de terceira geração, como, por exemplo, o etoposídeo. ( 6 ) Inquestionavelmente, a combinação terapêutica é vantajosa no tratamento do câncer, posto que possibilita afetar múltiplos alvos moleculares, com aumento da eficácia terapêutica, redução das dosagens e consequente redução de toxicidade, assim como redução ou retardo na aquisição de fenótipos de resistência.( 7 )

Nesse cenário, surge a metformina, uma biguanida amplamente utilizada como primeira linha de tratamento para pacientes com diabetes mellitus tipo 2.( 8 ) No entanto, desde a década de 1970, Dilman sugere o uso das biguanidas antidiabéticas como protetores antienvelhecimento e antineoplásicos.( 9 )

Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi determinar a ocorrência de aditamento, sinergismo ou antagonismo entre antineoplásicos utilizados na terapêutica de CPNPC e a metformina, em linhagem celular NCI-H460, no intuito de avaliar novas combinações terapêuticas para o tratamento dos CPNPC.

Métodos

Inicialmente, a linhagem de CPNPC NCI-H460, representante do grupo histológico de carcinoma de células grandes, foi cultivada a 37°C e 5% de CO2 em meio RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (Gibco/Invitrogen, Grand Island, NY, EUA) e solução estabilizada de penicilina (100 UI/mL), estreptomicina (100 µg/mL) e 0,5% (p/v) de anfotericina B (Gibco/Invitrogen) até a subconfluência. Obtidos através de doação de colaboradores, a cisplatina (Incel, solução injetável 1 mg/mL; Laboratório Darrow, Areal, Brasil), o etoposídeo (Posidon, solução injetável 20 mg/mL; Piére, Buenos Aires, Argentina) e o cloridrato de metformina (Pharma Nostra, Rio de Janeiro, Brasil) foram diluídos em PBS 1×.

No teste de viabilidade celular metabólica in vitro, as células foram cultivadas na densidade de 7,5 x 104 células/poço em placas de 96 poços e, após 24 h, tratadas com cada fármaco, de modo dose-dependente, por 24 h. Em seguida, removeu-se o meio, adicionou-se 15 µL de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT; Sigma-Aldrich) a 5 mg/mL em cada poço, e as placas foram incubadas por 4 h. Enfim, adicionou-se 100 µL de DMSO p.a. (Vetec, Rio de Janeiro, Brasil) para a dissolução dos cristais de formazan. Desse modo, a produção de formazan pela atividade de succinato desidrogenase mitocondrial reflete a proporção de células vivas em processo de estresse oxidativo causado pelos fármacos em teste.( 10 ) Nesse experimento, os valores de absorbância obtidos dos poços das células não tratadas, ou seja, expostas somente ao meio RPMI-1640, representam 100% de viabilidade celular. A citotoxicidade in vitro foi determinada pelo cálculo estimado da dose da concentração inibitória de 50% da proliferação celular (CI50) a partir da curva dose-resposta de cada fármaco, após o cálculo de viabilidade metabólica, avaliada através do ensaio de MTT (absorbância a 570 nm), utilizando um espectrofotômetro (MR-96ª; Bioclin, Belo Horizonte, Brasil). Vale ressaltar que os experimentos para a obtenção das curvas dose-resposta das monoterapias e estimativa do CI50 foram realizados em quadruplicata em três experimentos independentes, enquanto os experimentos para a determinação do índice de combinação foram realizados em triplicata em três experimentos independentes. Ademais, a interação entre os fármacos foi avaliada através da análise do índice de combinação, cujo valor foi determinado utilizando a equação clássica do isobolograma de Chou e Talalay, através do programa CompuSyn, versão 1.0 (ComboSyn, Paragon, NJ, EUA).( 11 ) Nesse contexto, caso o valor resultante do índice de combinação seja superior a 1,1 considera-se uma relação de antagonismo; entre 0,9 e 1,1, o efeito da combinação é aditivo; e, abaixo de 0,9, a combinação é sinérgica. Quanto à análise estatística, a partir dos resultados do ensaio de MTT, a média e o desvio-padrão das absorbâncias foram calculados, ao passo que os CI50 estimados foram calculados usando os programa GraphPad Prism, versão 5 (GraphPad Inc., San Diego, CA, EUA). Todos os dados de combinação foram expressos como média ± dp e analisados utilizando ANOVA de uma via seguido do pós-teste de Bonferroni com o auxílio do mesmo programa.

Resultados

Inicialmente, foram conduzidos os experimentos de viabilidade celular para determinar as concentrações de CI50 da metformina, cisplatina e etoposídeo para a linhagem de carcinoma de células grandes, NCI-H460, conforme apresentado na Tabela 1.

Tabela 1  Doses da concentração inibitória de 50% da viabilidade celular metabólica dos fármacos testados na linhagem celular NCI-H460. 

Fármacos CI50 , mM
Cisplatina 0,19
Etoposídeo 0,37
Metformina 60,58

CI50: concentração inibitória de 50%

Em seguida, de posse desses dados, cada um dos fármacos foi diluído a fim de se obter soluções em concentrações na faixa do CI50, bem como abaixo e acima desse valor, e foram conduzidos os testes de combinação in vitro da metformina com a cisplatina e com o etoposídeo a fim de permitir o cálculo dos gráficos de dose-resposta pelo programa; no entanto, somente serão discutidos os dados mais relevantes. Os dados resultantes desses gráficos foram analisados estatisticamente e estão representados nas Figuras 1 e 2. Finalmente, os efeitos das combinações foram utilizados para o cálculo do índice de combinação, cujos resultados estão apresentados na Tabela 2.

Figura 1  Avaliação da atividade da metformina e cisplatina, em diferentes concentrações, em monoterapia e em combinação, na redução da viabilidade celular metabólica (VCM) sobre as células da linhagem celular NCI-H460. 

Figura 2  Avaliação da atividade da metformina e etoposídeo, em diferentes concentrações, em monoterapia e em combinação, na redução da viabilidade celular metabólica (VCM) sobre as células da linhagem celular NCI-H460. 

Tabela 2  Índices de combinação de metformina com cisplatina ou com etoposídeo em linhagem celular NCI-H460. 

Concentração, mM Índice de combinação
Metformina Cisplatina Etoposídeo
60,58 0,19 0,00 0,70
30,29 0,19 0,00 0,90
30,29 0,00 0,18 0,81
15,14 0,00 0,09 0,90

Conforme o observado nos resultados, a combinação de metformina (60,58 mM) com cisplatina (0,19 mM) demonstrou apresentar uma ação antiproliferativa superior à monoterapia com metformina (nas concentrações de 60,58 e 30,29 mM) ou cisplatina (0,09 mM). Ademais, as combinações de metformina (60,58 e 30,29 mM) com cisplatina (0,19 mM) apresentaram sinergismo. A combinação de metformina (30,39 mM) com etoposídeo (0,18 mM) foi superior na redução da viabilidade celular metabólica da linhagem testada quando comparada à monoterapia com etoposídeo (0,18 e 0,09 mM) e com metformina (30,29 e 15,14 mM). Além disso, as combinações de metformina e etoposídeo, nas doses de 30,39 mM e 0,18 mM, respectivamente, e de 15,14 mM e 0,09 mM, respectivamente, foram sinérgicas.

Discussão

Diversos estudos epidemiológicos apontam a atividade da metformina tanto na prevenção quanto no tratamento do câncer.( 12 - 15 ) Há, inclusive, estudos que apontam que a metformina é capaz de melhorar o tratamento e, por conseguinte, a sobrevida dos pacientes com CPNPC e diabetes submetidos à quimioterapia.( 16 ) Posto que a metformina tem segurança e uso bem estabelecidos desde seu primeiro teste clínico em 1957, seu uso como um potencial agente antineoplásico é, decerto, uma estratégia interessante.( 17 )

Apesar de a ação citotóxica da metformina, observada no presente estudo, ter sido inferior à ação do etoposídeo e da cisplatina em até 200 vezes, conforme podemos observar pelas doses de CI50, a metformina em monoterapia reduziu a viabilidade celular metabólica das células de carcinoma de células grandes. Todavia, em esquemas politerápicos, a metformina, nas concentrações de 60,58 e 30,29 mM em combinação com cisplatina na concentração de 0,19 mM, demonstrou um efeito superior e sinérgico quando comparado à metade da dose do CI50 da cisplatina (0,09 mM). Por sua vez, a combinação de metformina (30,39 mM) e etoposídeo (0,18 mM) apresentou um efeito sinérgico e superior na redução da viabilidade celular metabólica da linhagem NCI-H460 ao uso monoterápico do etoposídeo, nas doses de 0,18 e 0,09 mM, e da metformina, nas doses de 30,29 e 15,14 mM. Em consonância com nossos resultados, estudos pré-clínicos indicam que a administração oral de metformina em combinação à quimioterapia é capaz de bloquear o crescimento tumoral e prevenir a recidiva, bem como permite a redução das doses de doxorrubicina utilizadas no tratamento.( 18 )

Apesar de sua consolidação no tratamento de diabetes, os mecanismos pelos quais a metformina pode atuar na supressão tumoral ainda precisam ser mais bem elucidados. O principal mecanismo possível da ação das biguanidas está relacionado à sua capacidade de inibir o complexo I das mitocôndrias com consequente desequilíbrio energético, desencadeando a fosforilação da enzima AMP kinase (AMPK) dependente da liver kinase B1 (LKB1).( 19 , 20 ) A LKB1 é a principal reguladora, em condições de estresse energético, da AMPK; essa, por sua vez, é moduladora do crescimento celular e do metabolismo em condições de redução do ATP intracelular.( 21 , 22 )

Perdas alélicas de LKB1 ocorrem em diversos tipos de câncer - entre estes, os CPNPC - principalmente em adenocarcinomas pulmonares. Ademais, acredita-se que a maior parte das mutações em LKB1 no CPNPC geram perda da função da proteína codificada.( 23 , 24 ) A linhagem celular de carcinoma de células grandes utilizada no presente estudo (NCI-H460) apresenta uma mutação do tipo nonsense no LKB1, que leva à ausência da expressão do seu produto proteico.( 24 ) É possível atestar, portanto, que os mecanismos de ação da metformina nessas células são independentes da atividade de LKB1. Shackelford et al. observaram que a fenformina, um dos membros do grupo das biguanidas, pode ser utilizada como um agente antineoplásico para tumores com deficiência em LKB1 por ocasionar apoptose possivelmente induzida por estresse metabólico.( 25 ) Dessa forma, sugere-se que um possível mecanismo para a ação da metformina e outras biguanidas em células tumorais deficientes em LKB1 seja a inibição do complexo I mitocondrial, que causa a indução de espécies reativas de oxigênio e consequente apoptose, devido a sua incapacidade de neutralizar eficientemente essas espécies.( 26 )

Outra razão plausível para a ação antiproliferativa e sinérgica da metformina é a sua atividade preferencial em células-tronco tumorais, grupo de células da massa tumoral que pode relacionar-se à formação tumoral, manutenção da massa tumoral, recidiva e metástase. Devido a essas características, fármacos que atinjam seletivamente essas células são extremamente promissores, posto que junto à quimioterapia convencional, poderiam tornar o tratamento mais efetivo e impedir a recidiva da doença.( 27 ) Hirsch et al. observaram que, em modelos xenográficos, a metformina inibe a proliferação, de forma preferencial, de células tumorais com fenótipo de células-tronco.( 26 )

Em suma, o presente estudo apontou, pela primeira vez, que a metformina apresenta atividade antiproliferativa em uma linhagem de carcinoma de células grandes (NCI-H460) e, em combinação com cisplatina ou etoposídeo, age sinergicamente, ampliando a taxa de morte celular. Entretanto, ainda são necessários estudos mais amplos no intuito de elucidar melhor os mecanismos envolvidos.

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