Métodos in vivo para avaliação do potencial anti-inflamatório e antinociceptivo

Métodos in vivo para avaliação do potencial anti-inflamatório e antinociceptivo

Autores:

Silvio de Almeida Junior

ARTIGO ORIGINAL

BrJP

versão impressa ISSN 2595-0118versão On-line ISSN 2595-3192

BrJP vol.2 no.4 São Paulo out./dez. 2019 Epub 02-Dez-2019

http://dx.doi.org/10.5935/2595-0118.20190070

INTRODUÇÃO

Para o auxílio da manutenção da saúde humana são consumidos, diariamente ao redor do mundo, produtos naturais que apresentam atividades biológicas, uma antiga tradição trazida como herança há milênios. A partir do conhecimento popular se faz necessária a investigação cientifica da eficácia desses produtos1. Dentre a diversidade de produtos naturais encontrados, apenas uma pequena porção tem suas caracterizações fitoquímica e potencial biológico investigados. As etapas para esclarecimentos, como isolamento, identificação e obtenção de análogos estruturais do metabólito ativo, associado ao conhecimento do potencial farmacológico, toxicológico e do mecanismo de ação dessas substâncias são fundamentais para a obtenção e o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos2,3. A seleção de compostos ativos, presentes em produtos naturais, é um grande desafio enfrentado por pesquisadores, assim como a elucidação de mecanismos de ação desses compostos. Para a realização das descobertas, se faz necessária a realização de ensaios biológicos, que devem ser escolhidos com cautela, visto que precisam ter acuidade na detecção do efeito específico, possuir sensibilidade e reprodutibilidade4.

É notória a quantidade de pesquisas realizadas em busca de compostos que sejam efetivos para a aplicação como agente anti-inflamatório ou com atividade antinociceptiva e que tragam benefícios com o menor número possível de efeitos adversos causados por sua utilização. Para a boa condução dos experimentos, se faz necessário o estudo prévio das metodologias que serão aplicadas, assim como as doses testadas e quantidade de animais. Um dos testes mais utilizados para a avaliação antinociceptiva é o teste de formalina. Encontrou-se 395 artigos publicados, e a atividade anti-inflamatória é o edema de pata, com 244 artigos, conforme evidenciado em consulta à base de dados Pubmed, no ano de 2018 (até outubro).

Frente ao relatado, o objetivo deste estudo foi abordar temas referentes aos principais métodos in vivo para a avaliação de novos compostos com potencial anti-inflamatório e antinociceptivo, assim como os mecanismos envolvidos.

CONTEÚDO

Devido ao índice de rejeição dos fármacos disponíveis no mercado pelos efeitos adversos, se faz necessário o estudo de novos compostos com atividades efetivas. Dentro da etnobotânica é necessária a avaliação dessas atividades, visto que o número de publicações é crescente dentro dessa área. A seleção dos compostos promissores dentro das atividades anti-inflamatórias e analgésicas inicia-se pela cultura da medicina popular seguida de avaliação química desses produtos naturais. A literatura atribui compostos tais como alcalóides, óleos essenciais, flavonóides, taninos, saponinas e compostos fenólicos como responsáveis pela atividade anti-inflamatória e analgésica esperada, com maior efeito que os fármacos encontrados no mercado5,6.

Para comprovação dessas atividades, se faz necessário o uso de modelos animais conforme protocolos, sempre respeitando os princípios éticos. Todos os procedimentos devem passar por comitê próprio, responsável pela avaliação antes do início dos experimentos. Outra observação importante é a utilização do menor número possível de animais, aplicação correta das técnicas e o mínimo de sofrimento causado ao animal7,8.

Seleção de animais

Animais como camundongos (mus musculus) com peso, em média, de 30±5g e ratos (Rattus norvegicus) com peso médio de 150±20g são utilizados como modelo nos ensaios in vivo. A escolha do modelo animal é baseada no teste realizado e no resultado esperado. Aconselha-se a sua aclimatação por um período de sete dias, em condições controladas de temperatura (25±3º C) e ciclo claro/escuro (12h) com alimento e água à vontade9.

Testes de contorções induzidas por ácido acético10

O teste de contorção abdominal em camundongos é um método muito utilizado para avaliar a atividade analgésica de substâncias contra a dor de origem inflamatória, onde o ácido acético (AA) na concentração de 0,6% (0,1mL/10g do animal) induz lesões no abdômen do camundongo, o que é suficiente para provocar os espasmos traduzidos como contorções. Para a realização do teste é necessário a aplicação do composto testado, nas concentrações já pré-definidas. Após 60 minutos, realizar a injeção peritoneal de AA e colocar o animal em caixa de acrílico para que seja possível a observação da quantidade de contrações realizadas em um período de 20 minutos11.

Avaliação da atividade analgésica e/ou anti-inflamatória pelo teste de formalina12

O teste de formalina é um teste realizado para a avaliação de analgesia, que consiste na avaliação do processo inflamatório em dois momentos: a chamada fase neurogênica e a inflamatória. O teste é realizado com camundongos que recebem o tratamento 1h antes do início do teste, junto com controle negativo (veículo), e o controle positivo por via intraperitoneal (geralmente morfina, 2,5mg/kg p.c., i.p. administrada 40 minutos antes da análise). O teste se inicia com a aplicação de 20µL de formalina a 2,5% por via intraplantar na região do membro pélvico posterior direito e cronometrado o tempo que o animal lambe, sacode ou morde a pata injetada com formalina. Usa-se de 0 a 5 minutos para avaliar a sensibilidade dolorosa na fase chamada neurogênica, na qual ocorre a ativação direta de nociceptores pelo agente químico. Depois, 15-30 minutos para determinar a sensibilidade dolorosa na fase chamada de dor inflamatória, que envolve a transmissão sináptica reforçada pela medula espinhal, bem como a liberação dos mediadores locais, tais como prostaglandinas e histaminas13.

Dor orofacial induzida por formalina. Adaptado14

O teste de dor orofacial induzida por formalina é realizado para a avaliação de analgesia na região de ação do nervo trigêmeo onde a literatura descreve diversas doenças relacionadas, levando a um quadro de dor crônica de leve a intensa. O teste pode ser realizado em ratos ou camundongos e consiste na aplicação de 50µL da substância irritante, no caso a formalina a 2%, na região do coxim direito das vibrissas do animal. A aplicação é realizada por via subcutânea, e o processo de autolimpeza (grooming) é avaliado por meio do ato de coçar a região onde foi aplicada a formalina com os membros dianteiros, avaliando quantas vezes o animal realizou o ato de autolimpeza, comparado aos controles15,16.

Ensaio da placa quente17

O ensaio consiste na exposição do animal à superfície quente, para estímulo térmico, para avaliar a atividade analgésica mediada por mecanismos centrais. É um modelo que avalia a atividade antinociceptiva de fármacos opioides, mas outros fármacos com atividade central, tais como sedativos e hipnóticos, mostram atividade nesse modelo experimental18. A avaliação do desempenho motor tem por objetivo detectar a ocorrência de incoordenação motora, permitindo uma interpretação mais acurada dos resultados obtidos nos testes para determinar da atividade antinociceptiva. Portanto, fármacos que promovem relaxamento ou sedação alteram o desempenho motor e podem interferir na resposta, sem serem necessariamente antinociceptivos19. Para tal, deve-se utilizar uma placa quente, mantida a 55ºC, onde o animal será colocado durante o tempo limite de 20s ou até que ele faça a retirada da pata para realizar o ato de lambedura (tempo de latência). As mensurações devem ser realizadas em zero, 30, 60 e 90 minutos após o tratamento. Junto com os grupos tratados, deve-se incluir um grupo com morfina (4,0mg/kg p.c.) como composto referência17.

Teste de Randall-Selitto20

É utilizado para a avaliação nociceptiva que testa a pressão muscular do gastrocnêmio. Para mensuração de dor é necessária a utilização do analgesímetro (Ugo-Basile, Stoelting, Chicago, IL). Para a realização do teste, os animais, geralmente ratos, são deixados em repouso em uma sala com pouca luz e temperatura controlada para reduzir o nível de estresse. Após 30 minutos, o animal tem o membro pélvico inferior colocado no equipamento. Após a alocação do animal, o equipamento inicia a aplicação de pressão em gramas, gradativamente, até que o animal sinta um desconforto, retirando o membro ou vocalizando. O próprio equipamento registra em gramas a pressão suportada. O teste deve ser realizado antes da administração do fármaco testado e nos períodos de 30min, 1, 2, 3 e 4h e comparados com fármacos analgésicos já conhecidos21,22.

Teste de von Frey23

O teste de von Frey, ou teste de pressão crescente em pata de ratos, consiste na aplicação de uma pressão em gramas nos membros posteriores do rato através de um equipamento eletrônico. Inicialmente, o teste descrito utilizava formas manuais e vem sendo alterado para formas eletrônicas por melhor e maior precisão dos resultados aferidos, entretanto, ainda é possível encontrar trabalhos realizados com equipamentos manuais. O animal é posicionado no equipamento, e através de monofilamentos de ponta rígida de von Frey são aplicados e mensurados em gramas, os limiares de dor mecânica. Esse teste é utilizado para avaliar a atividade antinociceptiva. O teste é realizado até seis vezes para que seja possível obter uma mensuração de três valores próximos de retirada da pata após a aplicação de pressão linear. O resultado é quantificado como a variação na pressão (D de reação em gramas) obtida, subtraindo-se a média de três valores expressos em gramas (força) observada antes do procedimento experimental (zero hora), da média de três valores em gramas (força), após a administração dos estímulos que variam de acordo com o experimento24.

Teste de retirada da cauda20

É utilizado para avaliar a atividade antinociceptiva promovida pelo sistema nervoso central e é de simples realização. O animal (rato) é colocado no equipamento e sua cauda repousada sobre um local onde será incidido um feixe de luz que aquecerá a cauda do animal. Um teste basal deve ser realizado, e os animais com tempo de retirada da cauda superior a 7,9s devem ser excluídos. Após a administração do produto natural avaliado, realizar a mensuração no período de 2h (30, 60, 90, 120 minutos)19,25.

Edema intraplantar induzido por carragenina26

A injeção intraplantar de carragenina induz um aumento agudo e progressivo do volume da pata injetada dos animais. Esse edema, que é proporcional à intensidade da resposta inflamatória, constitui-se em um parâmetro útil na avaliação da atividade anti-inflamatória. A carragenina desencadeia o processo inflamatório mediado por prostaglandinas, apresentando pico máximo entre 2 e 3h após a aplicação27,28. A inibição do edema causado por carragenina envolve o mecanismo relacionado com a síntese de prostaglandinas, em especial PGE2α e PGF2α, sendo a atividade comparada a anti-inflamatórios não esteroides (AINES)29. Antes da realização do teste, deve ser avaliado o volume do membro pélvico inferior (pata traseira) do animal por meio de plestismometria. A administração deve ser feita em um grupo controle veículo, para avaliar o solvente utilizado na solubilização do composto testado; um grupo controle com um AINE, e os grupos testes com doses já bem definidas. Após 1h da aplicação, deverá ser realizada a aferição do volume em 30, 60, 120 e 180 minutos, pela injeção da pata no pletismômetro9,30. Além da carragenina31 que é o mediador pró-inflamatório mais utilizado, pode-se utilizar a histamina32, dextran33, xileno e serotonina34, bradicinina e prostaglandina35.

Edema de orelha induzido por óleo de cróton em camundongos36

O teste tem como importância a avaliação através da capacidade de inibir a formação do edema na orelha dos animais testados após a aplicação tópica do óleo de cróton. Para a realização desse teste, deve-se administrar, 1h antes, o composto de interesse sobre a superfície interna da orelha. Deve-se decidir qual orelha receberá a indução do processo inflamatório com óleo de cróton e em qual será administrada acetona na mesma quantidade que o óleo para controle negativo. Realizar a mensuração da formação do edema com a aplicação do composto e em acetona. O teste pode ser utilizado ainda, acrescentando um grupo de animais testados com fármacos já conhecidos no mercado, como a indometacina e a dexametasona37.

Peritonite induzida por carragenina38

Através do uso da carragenina é possível produzir uma resposta inflamatória na cavidade peritoneal com predominância de muitas células polimorfonucleares presentes no exsudato. Deve ser realizado o tratamento dos animais com o grupo do veículo utilizado, um grupo com fármaco AINES e os grupos testes com concentrações já bem definidas. Realizar a aplicação de carragenina por injeção intraperitoneal e aguardar 4h para que o animal tenha a ação anti-inflamatória e a formação de exsudato. Após o período aguardado, eutanasiar o animal e lavar o peritônio com solução PSB heparinizado para contagem de células polimorfonucleares. O número de leucócitos deve ser comparado ao grupo teste para análise39.

Pleurisia40

No teste da pleurisia é avaliado o efeito anti-inflamatório sistêmico através do volume de exsudato, ou seja, em um processo inflamatório na região pleural, a quantidade de proteínas existentes tende a aumentar e o número de células de defesa (leucócitos) tem um aumento significativo41. Para a realização deste estudo deve ser feito o tratamento por gavagem dos animais grupo controle, com solução veículo, grupo com fármaco já conhecido e grupo testes com concentração já bem definidas, e após 60min, realizar a indução do processo inflamatório com aplicação de carragenina em injeção na região pleural. Seis horas após a indução do processo inflamatório, deve ser realizada a eutanásia dos animais e abertura da cavidade pleural. Enxaguar com solução fisiológica e EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) e realizar contagem de celulariedade em câmara de Neubauer, comparando sempre ao controle negativo42.

CONCLUSÃO

Os benefícios que são alcançados durante esses estudos são inegáveis, porém, princípios éticos devem ser seguidos na utilização do número de animais testados e resultados esperados. A utilização de animais para fins experimentais é de suma importância e cabe ao pesquisador saber escolher os melhores testes que fundamentem as hipóteses e direcione a obtenção de moléculas com potencial analgésico ou anti-inflamatório.

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