Ototoxicidade de ácido bórico em pó em um modelo animal de rato

Ototoxicidade de ácido bórico em pó em um modelo animal de rato

Autores:

Murat Salihoglu,
Salim Dogru,
Enver Cesmeci,
Halil Caliskan,
Onuralp Kurt,
Zafer Kuçukodaci,
Atila Gungor

ARTIGO ORIGINAL

Brazilian Journal of Otorhinolaryngology

versão impressa ISSN 1808-8694versão On-line ISSN 1808-8686

Braz. j. otorhinolaryngol. vol.84 no.3 São Paulo maio/jun. 2018

http://dx.doi.org/10.1016/j.bjorl.2017.03.010

Introdução

Além de fármacos comercialmente disponíveis com antibióticos e esteroides, muitos agentes tópicos são usados para tratar as doenças da orelha. Medicamentos em gotas antissépticas e soluções ácidas são frequentemente usados em casos de inflamação e infecção da orelha média, associadas a infecções da orelha externa e perfurações da membrana timpânica.1 As aplicações tópicas têm algumas vantagens em otologia. Elas fornecem uma alta concentração do fármaco nas regiões aplicadas, têm menor potencial para desenvolver resistência bacteriana e não causam efeitos colaterais sistêmicos nos pacientes. Apesar dessas vantagens, após a aplicação na cavidade da orelha média, elas podem passar através da janela redonda e podem ter efeitos adversos nos aparelhos coclear e vestibular.2 Estudos têm demonstrado os efeitos ototóxicos de medicamentos do grupo dos aminoglicosídeos, tais como gentamicina e estreptomicina.3 Além disso, algumas soluções antissépticas têm demonstrado potencial ototóxico.4,5 Durante o uso de medicamento tópico, a ototoxicidade pode ser causada tanto pela própria substância ativa quanto pelo veículo. Além disso, as concentrações da substância ativa e do veículo afetam o nível de ototoxicidade.5

O ácido bórico é um sólido cristalino branco, cuja fórmula molecular é H3BO3. É um ácido fraco encontrado na natureza (minerais, água do mar e frutas) e pode ser produzido pela reação de minerais de borato com ácido sulfúrico. O ácido bórico tem vários usos, tais como inseticida, conservante, lubrificante e agente industrial. Medicinalmente, é usado como antisséptico; por exemplo, é usado diluído na lavagem dos olhos ou é usado para tratar pequenos cortes e queimaduras, acne, lesões aftosas e lesões diftéricas ulceradas, bem como para tratar casos que envolvam secreções, como gonorreia, vaginite e cistite. Também é usado para tratar infecções fúngicas e bacterianas na orelha externa ou média. Sabe-se que é tóxico em doses elevadas, especialmente em lactentes. É frequentemente usado em uma solução a 4% preparada com álcool a 70% ou água destilada e na forma de pó puro é usado como ácido bórico em pó (ABP).6,7 O ABP contém a maior concentração de ácido bórico usada em medicação ototópica. Até o momento, os efeitos do ABP na orelha interna e média não foram avaliados. Este estudo investigou os possíveis efeitos ototóxicos do ABP sobre a função da célula ciliada externa coclear em ratos e mediu as amplitudes das emissões otoacústicas - produto de distorção (EOAPD). As alterações histológicas na mucosa da orelha média também foram avaliadas.

Método

Vinte ratos Wistar albinos, saudáveis, maduros (16-20 meses), entre 250 g e 300 g, foram usados neste estudo. O protocolo experimental foi desenvolvido de acordo com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicadas pela National Academics Press.8 Os ratos foram mantidos em gaiolas separadas em uma sala com ciclos claro/escuro de 12 horas, simulou-se o ritmo normal de dia e noite, a temperatura (20° ± 2 °C) e umidade (55,5%) constantes. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Universitário (protocolo número 58-2013). Os ratos foram anestesiados com quetamina (75-90 mg/kg, Ketalar, Pfizer, Istambul, Turquia) e xilazina (5-8 mg/kg, Rompun, Bayer, Leverkusen, Alemanha) por injeção intraperitoneal. A profundidade da anestesia foi determinada pelo reflexo podal e anestesia adicional foi administrada em incrementos de metade da dose, conforme necessário. Os ratos foram eutanasiados com tiopental sódico (200 mg/kg, Pentothal, Abboth, Campoverde di Aprilla, Itália) por injeção intraperitoneal sob anestesia.

Os ratos foram divididos em dois grupos, A e B, cada um constituído por 10 animais (cinco machos, cinco fêmeas). Após a administração da anestesia geral, avaliamos o canal auditivo externo e a membrana timpânica de cada rato com um microscópio cirúrgico. Nenhum dos ratos apresentava infecção ou lesão na orelha. Inicialmente, os animais de cada grupo foram submetidos a testes de EOAPD nas orelhas direita e esquerda. Após esse primeiro teste de EOAPD foi usado um microscópio cirúrgico para fazer uma pequena perfuração (menor do que um quarto da membrana timpânica) em ambas as orelhas de cada grupo e um segundo teste de EOAPD foi feito em ambas as orelhas em todos os ratos. Em seguida, aplicaram-se 35 mg (0,1 cc) de ABP na orelha média direita dos ratos em ambos os grupos por meio da perfuração da membrana timpânica, com uma seringa de 2,5 cc com uma agulha de calibre 22.

Após esse procedimento, a mucosa da orelha média foi observada através da perfuração com um microscópio, para garantir que a presença de ABP na mucosa da orelha média. O teste de EOAPD foi repetido nas orelhas direitas dos ratos em ambos os grupos, imediatamente após a aplicação de ABP. As alterações histológicas e os resultados do teste de EOAPD foram avaliados em ambas as orelhas três dias depois no Grupo A e 40 dias depois no Grupo B. Os resultados histológicos e as medidas do teste de EOAPD foram comparados entre as orelhas direita e esquerda e entre os dois grupos.

Os limiares de EOAPD foram registados a 2 kHz, 3 kHz, 4 kHz, 6 kHz e 8 kHz com um analisador de emissões cocleares Madsen Capella, sistema Noah 3 (GN Otometrics A/S, Taastrup, Dinamarca). Todas as medições foram feitas em uma sala silenciosa. Os tons primários foram emitidos na orelha externa através de um fone de ouvido. O estímulo acústico que criou o sinal de EOAPD consistiu em dois tons puros simultâneos e contínuos em diferentes frequências: f1 e f2. Neste estudo foram usados os parâmetros de estímulo de 80 dB SPL/70 dB SPL com a razão f2/f1 de 1,22 e, em seguida, a amplitude do sinal de EOAPD foi analisada. Foram analisadas 1.000 aquisições.

Todos os ratos em ambos os grupos foram eutanasiados sob anestesia para avaliação histológica. Posteriormente, os ossos temporais foram colhidos e as caixas timpânicas foram rapidamente dissecadas dos ossos temporais e preparadas para exame microscópico. Após fixação em solução de formalina tamponada a 10% por 48 horas, os espécimes foram colocados em uma solução descalcificante de ácido nítrico a 10% por um dia. Cada espécime foi então embebido em parafina e cortado de acordo com a técnica histológica padrão (micrótomo Leica, Alemanha) e depois corado com tricrômico, hematoxilina e eosina. Os tecidos foram analisados sob um microscópio e fotomicrografias foram obtidas. As alterações histológicas foram avaliadas pela observação da mucosa da orelha média para determinar o acúmulo de células inflamatórias (leucócitos polimorfonucleares, macrófagos, linfócitos, células gigantes e outras células) e a presença de atividade fibroblástica e fibrose. O grau dessas alterações foi avaliado visualmente e classificado como: ausente (0), leve (1), moderado (2) ou grave (3).

A classificação da inflamação de acordo com a contagem de células inflamatórias foi feita a uma ampliação de 200x e as contagens foram categorizadas da seguinte forma: leve (< 50 células/campo), moderada (50-100 células/campo) e grave (> 100 células/campo). Dez áreas de aumento de 200 × foram analisadas e calculou-se o número médio de células inflamatórias.9 A atividade fibroblástica e a fibrose foram classificadas de acordo com a classificação de Dogru et al.10 As observações histológicas foram feitas pelo mesmo patologista cegado, que observou cada lâmina duas vezes, e cinco medidas foram feitas para cada espécime.

Análise estatística

As análises dos dados foram feitas com o software SPSS versão 21.0 (Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL). Os dados foram mostrados como média ± desvio padrão para as variáveis contínuas (EOAPD) e como número de casos para as variáveis categóricas (observações histológicas). Ao determinar se os dados eram normalmente distribuídos ou não, verificou-se distribuição não normal. O teste U de Mann-Whitney foi usado para comparar as orelhas direita e esquerda em todas as frequências de EOAPD medidas em ambos os grupos. Usou-se o teste de soma de postos de Wilcoxon para comparar os resultados de EOAPD para as orelhas direitas (as orelhas que receberam ABP) dos ratos no Grupo B, medidos em três tempos diferentes (primeiro dia; antes da perfuração, após a perfuração, após a aplicação de ácido bórico em pó; no terceiro e no 40° dia) ao longo do estudo. As variáveis categóricas (observações histológicas) foram comparadas pelo teste exato de Fisher. A significância estatística foi estabelecida para valores de p < 0,05.

Resultados

Nenhum dos ratos foi a óbito durante o estudo. As membranas timpânicas dos ratos foram examinadas com otomicroscopia antes da eutanásia. No Grupo A, as perfurações iatrogênicas persistiram em ambas as orelhas de todos os ratos e não houve sinais de infecção. No Grupo B, as perfurações iatrogênicas em ambas as orelhas estavam cicatrizadas em todos os ratos. Não foram encontradas diferenças significativas entre as orelhas direita e esquerda em todas as frequências de EOAPD medidas em ambos os grupos (tabela 1). Quando comparamos os resultados do teste de EOAPD das orelhas direitas (as que receberam ABP) dos ratos do Grupo B, foram medidos três tempos diferentes (primeiro dia; antes da perfuração, após a perfuração, após aplicação de ácido bórico em pó, terceiro dia e 40° dia) ao longo do estudo e não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas (tabela 2).

Tabela 1 Distribuição das amplitudes de EOAPD para as frequências de 2, 3, 4, 6 e 8 kHz nas orelhas direita e esquerda dos ratos nos Grupos A e B (estímulos de 80 Db/SPL 70 dB/SPL) 

EOAPD, média ± DP (Grupo A/B)
Orelha direita Orelha esquerda p-valor a
2 kHz
Antes da perfuração 12,08 ± 0,98/12,35 ± 1,16 12,18 ± 1,10/12,38 ± 0,90 0,70/0,91
Após a perfuração 11,79 ± 0,88/11,82 ± 1,94 11,74 ± 1,19/11,79 ± 1,53 0,76/0,81
Após uso de ácido bórico em pó 11,49 ± 1,12/11,21 ± 1,70 -/- -/-
3º dia 12,06 ± 1,39/12,28 ± 0,88 11,93 ± 1,16/12,34 ± 0,66 0,47/0,80
40º dia -/12,48 ± 1,02 -/12,17 ± 1,10 -/0,76
3 kHz
Antes da perfuração 23,75 ± 1,87/23,72 ± 1,32 23,23 ± 1,40/23,62 ± 1,72 0,57/0,88
Após a perfuração 23,48 ± 1,73/22,55 ± 1,04 23,07 ± 1,28/22,97 ± 1,24 0,71/0,54
Após uso de ácido bórico em pó 23,27 ± 2,11/23,09 ± 1,50 -/- -/-
3º dia 23,42 ± 1,69/23,72 ± 1,32 23,18 ± 1,77/22,94 ± 1,04 0,82/0,15
40º dia -/23,27 ± 1,18 -/22,99 ± 1,84 -/0,65
4 kHz
Antes da perfuração 26,28 ± 1,51/26,18 ± 1,88 26,17 ± 2,05/26,08 ± 2,14 0,94/0,53
Após a perfuração 26,22 ± 1,86/26,02 ± 1,60 25,17 ± 1,45/25,62 ± 1,96 0,23/0,47
Após uso de ácido bórico em pó 25,97 ± 1,74/25,94 ± 1,95 -/- -/-
3º dia 25,92 ± 2,09/25,94 ± 1,95 25,84 ± 2,16/26,12 ± 1,77 0,88/0,86
40º dia -/26,16 ± 1,74 -/26,06 ± 1,82 -/0,72
6 kHz
Antes da perfuração 32,87 ± 2,27/33,76 ± 2,21 32,70 ± 1,75/33,50 ± 1,93 0,79/0,92
Após a perfuração 32,73 ± 2,29/32,88 ± 2,59 32,61 ± 1,90/33,14 ± 2,14 0,91/0,80
Após uso de ácido bórico em pó 32,41 ± 1,96/32,68 ± 2,06 -/- -/-
3º dia 32,94 ± 2,92/33,68 ± 2,18 32,67 ± 2,11/33,12 ± 2,22 0,91/0,54
40º dia -/33,40 ± 1,83 -/33,47 ± 2,80 -/0,84
8 kHz
Antes da perfuração 37,96 ± 3,37/38,23 ± 2,81 38,09 ± 3,13/38,53 ± 30,0 1,00/0,80
Após a perfuração 37,54 ± 2,14/37,76 ± 2,69 38,1 ± 3,24/38,32 ± 2,94 0,55/0,51
Após uso de ácido bórico em pó 37,44 ± 2,63/37,25 ± 4,25 -/- -/-
3º dia 37,52 ± 2,62/37,24 ± 2,62 37,96 ± 2,58/37,46 ± 2,40 1,00/0,76
40º dia -/37,68 ± 2,75 -/37,59 ± 2,62 -/0,96

DP, desvio-padrão; EOAPD, emissões otoacústicas - produto de distorção; SPL, nível de pressão sonora (do inglês, sound pressure level).

aTeste U de Mann Whitney (p < 0,05 foi considerado significante).

Tabela 2 Comparação (p-valores a) das amplitudes de EOAPD para as frequências de 2, 3, 4, 6 e 8 kHz das orelhas direitas dos ratos no Grupo B 

Comparação 2 kHz 3 kHz 4 kHz 6 kHz 8 kHz
I-II 0,73 0,07 0,76 0,36 0,72
I-III 0,09 0,37 0,54 0,28 0,51
I-IV 0,92 1,00 0,51 0,54 0,58
I-V 0,54 0,51 1,00 0,61 0,68
II-III 0,44 0,44 0,96 0,84 0,88
II-IV 0,51 0,07 0,57 0,44 0,59
II-V 0,41 0,20 0,88 0,51 0,88
III-IV 0,22 0,37 0,72 0,24 0,88
III-V 0,10 0,92 0,96 0,28 0,88
IV-V 0,41 0,51 0,48 0,44 0,80

I, primeiro dia, antes da perfuração; II, primeiro dia, após perfuração; III, primeiro dia, após a aplicação de ácido bórico em pó; IV, seguimento no 3º dia; V, seguimento no 40º dia.

aTeste de soma de postos de Wilcoxon (p < 0,05 foi considerado significativo).

Os achados histopatológicos nos grupos foram os seguintes (fig. 1): no Grupo A, observou-se um aumento moderado das células inflamatórias em ambas as orelhas em oito ratos e na orelha direita em dois ratos (p > 0,05). No Grupo B, não houve aumento de células inflamatórias em oito ratos, mas houve um ligeiro aumento de células inflamatórias na orelha direita em dois ratos (p > 0,05). No Grupo A, observou-se leve atividade fibroblástica na orelha direita em três ratos (p > 0,05). No Grupo B, observou-se leve atividade fibroblástica na orelha direita em apenas um rato (p > 0,05). Não foi observada fibrose no Grupo A. Observou-se fibrose leve na orelha direita em três ratos no Grupo B (p > 0,05). As alterações histológicas dos grupos estão resumidas na tabela 3. Não houve diferença estatisticamente significativa nos achados histológicos entre a mucosa da orelha direita e esquerda dos ratos em ambos os grupos.

Figura 1 Inflamação moderada (setas brancas), atividade fibroblástica leve (setas pretas) e fibrose leve (seta vermelha) em um dos ratos do Grupo B (40 dias) (Tricrômico 400 ×). 

Tabela 3 Alterações histológicas após tratamento com ABP nas orelhas direita e esquerda em ambos os grupos 

Direito/esquerdo Ausentes Leves Moderadas Graves p-valorc
Células inflamatóriasa -/2 10/8 -/- -/- 0,47
Atividade fibroblásticaa 7/10 3/- -/- -/- 0,21
Fibrosea -/- -/- -/- -/- -
Células inflamatóriasb 8/10 2/- -/- -/- 0,14
Atividade fibroblásticab 9/10 1/- -/- -/- 0,99
Fibroseb 7/10 3/- -/- -/- 0,21

a3º dia (Grupo A).

b40º dia (Grupo B).

cTeste exato de Fisher (p < 0,05 foi considerado significante).

Discussão

Agentes tópicos podem ser usados isoladamente ou com medicamentos sistêmicos para tratar infecções crônicas da orelha média e da orelha externa.11,12 Muitos estudos têm investigado os efeitos do ácido bórico e outras soluções ototópicas que têm características semelhantes. Ozcan et al.13 relataram que uma solução de ácido bórico a 4% preparada com álcool a 70% é uma opção de tratamento eficaz e barata para a otomicose e da dor local. Em um estudo conduzido por Minja et al.14 foi relatado que uma solução de ácido bórico preparada com álcool a 70% foi eficaz e segura em crianças com diagnóstico de otite média supurativa. Ozturkcan et al.6 investigaram o efeito das soluções de ácido bórico no Potencial Evocado Auditivo de Tronco Encefálico (Peate) em cobaias. Eles relataram que uma solução de ácido bórico a 4% preparada com 70% de álcool tem um efeito ototóxico, enquanto que a solução é mais segura se for preparada com água destilada. Aktas et al.15 investigaram o efeito ototóxico da solução de ácido bórico preparada com diferentes concentrações de álcool (60% e 40%) através do Peate em cobaias albinas jovens. Eles relataram que uma solução de ácido bórico a 4% preparada com 60% de álcool teve um efeito negativo na audição das cobaias. Eles também verificaram que um aumento na concentração da solução de ácido bórico causou ototoxicidade adicional. Entretanto, Ozdemir et al.16 demonstraram que a aplicação tópica de ácido bórico em soluções alcoólicas na orelha média de ratos era segura para a orelha interna. Em seu estudo, a audição foi avaliada por EOAPD. Além das soluções de ácido bórico, a solução de Burow, que consiste em diferentes concentrações de subacetato de alumínio, é frequentemente usada como antisséptico. Serin et al.17 estudaram os efeitos de soluções de Burow a 4% e 13% na audição de cobaias com Peate e não encontraram efeito ototóxico. Gultekin et al.1 investigaram os efeitos da solução de Castellani, que tem propriedades antibacterianas e antifúngicas, e não encontraram efeito ototóxico em orelhas internas de ratos com EOAPD.

Estudos anteriores avaliaram a ototoxicidade de uma solução de ácido bórico a 4% (4 g/100 mL) preparada com água destilada ou álcool.6,13-16 Entretanto, não encontramos estudo prévio que tenha examinado o efeito do ABP na orelha interna e mucosa da orelha média. Outro uso comum do ABP é sua insuflação nas cavidades timpânicas úmidas e na orelha externa. Usaram-se 35 mg de forma pura de ABP (concentração de 100%), enquanto outros estudos, acima mencionados, usaram solução de ácido bórico a 4%.

A ototoxicidade refere-se à lesão que ocorre na orelha interna devido à administração de medicamentos ou produtos químicos e resultando em perda auditiva neurossensorial.1 Estudos com EOAPD têm sido frequentemente usados para investigar ototoxicidade. A EOAPD é um método não invasivo para avaliar as células ciliadas externas, que produzem emissões otoacústicas (EOAs)18 Entretanto, as EOAs podem ser afetadas pela presença de fluido na cavidade da orelha média ou uma perfuração na membrana timpânica.19 Quando mais da metade da membrana timpânica é perfurada, as EOAs não podem ser medidas devido à perda auditiva condutiva.20 Portanto, nesse estudo, as membranas timpânicas foram parcialmente perfuradas (menos de um quarto da membrana timpânica) com a ajuda de um instrumento cirúrgico e o ABP foi aplicado com uma seringa de 2,5 cc com agulha de calibre 22.

Em nosso estudo, não foram observadas diferenças significativas entre os níveis de EOAPD das orelhas que receberam ABP e aqueles que não receberam ABP em todas as frequências em ambos os grupos.

Inflamação moderada e atividade fibroblástica na mucosa da orelha média foram observadas três dias após a aplicação de ABP no Grupo A. Consideramos que a inflamação leve, detectada no Grupo A, era causada pelos efeitos traumáticos da perfuração iatrogênica. Nenhuma fibrose foi observada no terceiro dia após o tratamento no Grupo A. O exame histológico da mucosa da orelha média no 40° dia revelou que o ABP causou inflamação leve, que diminuiu ao longo do tempo no Grupo B. Essas alterações levaram à fibrose leve na mucosa da orelha direita de apenas três ratos no Grupo B.

Conclusão

Demonstramos que o ABP causou alterações histológicas leves na mucosa da orelha média em ratos. Usamos o teste de EOAPD para investigar os efeitos ototóxicos do ABP na orelha interna de ratos e observamos que o ABP não tem efeitos ototóxicos sobre a função das células ciliadas externas cocleares. O teste de EOAPD pode ser considerado para investigar a ototoxicidade de fármacos.

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