Introdução

A experimentação animal é uma ferramenta importante para o conhecimento da fisiopatologia de diversas doenças, considerando que sua utilização permitiu a descoberta e o avanço no desenvolvimento de tratamentos, métodos de prevenção e diagnóstico, relevantes para a saúde humana.¹ O uso de animais, respeitando os preceitos éticos, supera limitações existentes na experimentação humana e proporciona a investigação rápida de doenças, com eficácia e custos menores.²

A doença renal crônica (DRC) é uma patologia com elevadas morbidade e mortalidade e vem apresentando aumento progressivo nas taxas de incidência e prevalência nos últimos anos. Entre 2000 e 2010, houve um aumento de 115% de pacientes em diálise no país, totalizando, em 2011, 91.314 doentes.³ A DRC caracteriza-se pela presença de lesão renal, que pode ser evidenciada pela redução da função renal, avaliada pela taxa de filtração glomerular (TFG), ou presença de proteinúria, ambos persistindo por três meses.⁴ No Brasil, segundo o Censo da Sociedade Brasileira de Nefrologia, no ano de 2009 mais de 77 mil pacientes iniciaram programa de hemodiálise como terapia de substituição da função renal³ e os gastos do Sistema Único de Saúde corresponderam a mais de 1,5 bilhão de reais neste mesmo ano.^5,6

A preocupação com a prevalência crescente e a gravidade da DRC, incentiva as pesquisas envolvendo modelos animais, com a finalidade de encontrar alternativas para o tratamento da doença, melhorar as condições de vida dos pacientes e reduzir sua mortalidade. Os protocolos experimentais para a utilização desses modelos devem ser bem definidos e efetuados a partir do conhecimento prévio dos procedimentos e dos parâmetros a serem estudados.² Tais práticas são fundamentais para a confiabilidade dos resultados experimentais, de forma que a análise e interpretação dos dados possibilitem sua utilização em benefício dos seres humanos.⁷

A avaliação laboratorial mais utilizada para mensurar a função renal é feita a partir da TFG, que pode ser realizada por métodos considerados padrão-ouro, mas que envolvem injeção de fármacos e a sua excreção.⁸ Na rotina clínica e de experimentação animal, estima-se a TFG por meio de métodos que dependem das dosagens de creatinina urinária, creatinina sérica e fluxo urinário em 24 horas.⁹ Outra medida bastante utilizada na avaliação da função renal é a quantificação da proteinúria - excreção urinária de proteína - que pode ser avaliada pela técnica de microalbuminúria de 24 horas, proteinúria de 24 horas (PT 24 horas) ou pela relação proteína/creatinina (rP/C) ou albumina/creatinina em amostra isolada de urina.¹⁰ Para melhor atender os objetivos da pesquisa, é necessário adequar os procedimentos e técnicas utilizadas para aferir tais parâmetros e definir valores de referência para os animais normais.¹¹ O conhecimento desses valores contribui para a avaliação das modificações patológicas e para a avaliação dos resultados obtidos nos procedimentos experimentais.¹²

Considerando o interesse nos modelos experimentais de doença renal e a necessidade de ampliar os estudos de padronização biológica de modelos animais, o presente trabalho foi conduzido com o objetivo de padronizar a avaliação da função renal de ratos (Rattus norvegicus), da colônia do biotério do Centro de Biologia da Reprodução (CBR) da Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF).

Métodos

Resultados

No experimento Coleta de urina, o volume urinário e a média da depuração da creatinina do grupo G12 foram inferiores quando comparados aos do grupo G24. Todos os outros parâmetros não apresentaram diferenças entre os dois grupos (Tabela 1).

O experimento Jejum comparou os resultados do grupo G12 com os do grupo JE12; este permaneceu em jejum durante as 12 horas de coleta de urina nas gaiolas metabólicas. Com relação ao consumo, observou-se a diminuição da ingestão de água dos animais submetidos ao jejum. Já a média do volume de urina foi maior para esses animais (Tabela 2).

As médias das dosagens de creatinina no soro e ureia de G12 e JE12 não foram diferentes do ponto de vista estatístico. Porém, os valores de creatinina na urina dos animais do grupo G12 apresentaram-se mais altos, enquanto os valores de depuração da creatinina foram mais baixos quando comparados aos valores apresentados pelos animais do grupo JE12. Isso se deve à interferência da creatinina sérica que foi menor no grupo JE12, mesmo não apresentando diferença estatística. A diferença entre os valores de PT 24 horas foi significativa, entretanto, não houve diferença entre a rP/C dos dois grupos (Tabela 2).

No experimento Desproteinização, foram utilizadas 18 amostras de urina coletadas dos animais dos grupos G24, G12 e JE12. E, para as avaliações no soro, foram utilizadas 24 amostras sendo estas dos grupos G24, G12, JE12 e D24. Todas as amostras foram analisadas sem o processo de desproteinização (amostras usuais) e com o processo de desproteinização (amostras desproteinizadas). Não houve diferença estatística entre os valores de creatinina na urina e depuração da creatinina utilizando amostras com e sem desproteinização (Tabela 3). Houve forte correlação entre os valores de creatinina na urina, (r = 0,957, p < 0, 001) (Figura 1A). Pelo gráfico de Bland-Altman, também não se observou evidência de viés na comparação entre creatinina na urina usual e a creatinina na urina desproteinizada, uma vez que os dados individuais se distribuíram aleatoriamente abaixo e acima da linha média central (Figura 1B).

Figura 1 Análise do experimento Desproteinização. A: Correlação entre a creatinina na urina usual e a creatinina na urina desproteinizada. Reta e intervalo de confiança de 95% da regressão, N = 18; B: Gráfico de Bland-Altman para determinação do grau de concordância entre a creatinina na urina usual e a creatinina na urina desproteinizada, N = 18; C: Correlação entre a creatinina no soro usual e a creatinina no soro desproteinizado. Reta e intervalo de confiança de 95% da regressão, N = 24; D: Gráfico de Bland-Altman para determinação do grau de concordância entre a creatinina no soro usual e a creatinina no soro desproteinizado, N = 24. 

As médias das dosagens de creatinina no soro não foram diferentes entre as amostras usuais e as amostras desproteinizadas, que apresentaram grande variabilidade (Tabela 3). Os valores de creatinina foram concordantes entre si (r = 0,501, p = 0,013) (Figura 1C), porém, pela análise de Bland-Altman, observou-se evidência de viés na comparação entre creatinina no soro usual e a creatinina no soro desproteinizado (Figura 1D).

Devido à discrepância das dosagens de creatinina sérica nas amostras desproteinizadas, foram realizadas novas dosagens em um grupo com IRA, que sabidamente apresentariam creatinina elevada no soro. Esse experimento foi chamado de Métodos de análise, em que foram realizadas duas análises: uma em analisador automático pelo método espectrofotométrico e outra em leitora de ELISA. Houve perda de dois animais do grupo IR24. Não houve diferença estatística entre as amostras usuais e amostras desproteinizadas em nenhum dos equipamentos utilizados (Tabela 4). Também não apresentaram correlação: as amostras de soro usual e desproteinizadas analisadas por espectrofotometria (r = 0,713, p = 0,287) e as amostras de soro usual e desproteinizadas analisadas por ELISA (r = 0,926, p = 0,074). Na comparação dos resultados dos dois equipamentos, não houve correlação significante e não foi encontrada diferença significativa, seja entre as amostras usuais (r = 0,930, p = 0,70) ou entre as amostras desproteinizadas (r = 0,610, p = 0,390).

Para padronizar as dosagens de proteinúria, foi calculada a PT 24 horas e a rP/C de todas as amostras de urina coletadas. A média de PT 24 horas foi de 11,92 ± 6,58 mg/dL e a média da rP/C foi de 1,26 ± 0,72. Houve forte correlação entre os valores de PT 24 horas e rP/C quando avaliados pela correlação de Pearson (r = 0,94, p < 0,001) (Figura 2A). O gráfico de Bland-Altman mostrou que a rP/C é sistemática e linearmente superestima a PT 24 horas (Figura 2B). Ainda assim, por meio do modelo de regressão, foi obtida uma equação que permitiu estimar a PT 24 horas utilizando a rP/C; PT 24 horas = (8,6113 + rP/C) + 1,0869.

Figura 2 Análise do experimento Métodos de análise - Estimativa da proteinúria de 24 horas. A: Correlação entre a proteinúria de 24 horas e a relação proteína/creatinina. Reta e intervalo de confiança de 95% da regressão, N = 59; B: Gráfico de Bland-Altman para determinação do grau de concordância entre a proteinúria de 24 horas e a relação proteína/creatinina, N = 59. 

Discussão

Diferentes metodologias são empregadas na coleta e processamento dos fluidos de animais experimentais e o refinamento tecnológico nas pesquisas científicas tem gerado uma redução importante no número de animais utilizados, reduzindo também a variabilidade dos resultados finais.² O presente estudo mostrou que fatores como a coleta de urina de 24 horas, o período de jejum antes da coleta de sangue e a preparação das amostras são procedimentos importantes e relevantes na avaliação da função renal e que devem ser padronizados para obtenção de resultados confiáveis.

A TFG é a medida mais utilizada para avaliação qualitativa e quantitativa da capacidade excretora do rim, e é mais fielmente obtida na prática clínica a partir da depuração da creatinina, realizada em urina coletada no período de exatas 24 horas.²⁰ O experimento Coleta de urina mostrou que a média do volume de urina dos ratos do grupo G24, foi de 10,9 ± 2,2 ml, concordante com valores descritos por outros autores, que variam de 8 a 11 ml.^21-23 O volume de diurese é influenciado pela variação da ingestão hídrica devido às mudanças de temperatura, umidade, estado de saúde e atividade sexual.^22,24 Observou-se que no grupo G12 o volume de urina reduziu-se à metade devido à redução da permanência dos animais nas gaiolas metabólicas e à diminuição da ingestão hídrica com relação ao grupo G24. Mesmo tendo hábitos noturnos, cerca de 57% do volume de urina desses roedores pode ter sido excretado durante o dia. Em um estudo utilizando ratos Wistar machos, resultados similares foram encontrados para o grupo controle, sendo relatada parte da diurese durante o dia (4,6 ± 0,5 ml).²⁵ O consumo de ração e ingestão hídrica médios para ratos são, respectivamente, de 5 g e 10 ml para cada 100 g de peso do animal, existindo ainda forte correlação quanto mais alimento é consumido mais água é ingerida.²⁴ O consumo de ração dos grupos observados por 24 horas e 12 horas foi semelhante ao relatado previamente, mantendo inclusive o padrão de maior ingesta durante a noite.^22,24,25

A depuração da creatinina é realizada utilizando o fluxo urinário e os valores das dosagens de creatinina na urina e no soro.⁹ A concentração da creatinina em amostra de urina coletada em um período de 12 horas foi semelhante aos valores encontrados no grupo de 24 horas. Resultados de colônias brasileiras relatam valores em urina coletada por 24 horas variando em torno de 67,2 mg/dL em animais jovens a 75 mg/dL em ratos adultos, semelhantes aos encontrados neste estudo.^11,17 Mesmo com a concentração da creatinina urinária semelhante, os animais do grupo G24 apresentaram depuração da creatinina superior aos do G12, consequência do menor volume urinário obtido, mesmo após a correção, com duplicação, pelo tempo de coleta, e da menor creatinina sérica. Porém, a diferença encontrada entre os valores de creatinina no soro dos grupos G24 e G12 não representa diferença do ponto de vista biológico, uma vez que os valores médios encontrados estão próximos aos valores descritos como normais. Estudos prévios encontraram valores de 0,83 ± 0,07 ml/min e de 0,74 ± 0,01 ml/min, na depuração da creatinina em ratos adultos, nos levando a supor que tais variações podem ser decorrentes de fatores ambientais, estresse, fatores genéticos ou até mesmo de variáveis metodológicas.^17,21

A PT 24 horas dos dois grupos (G24 e G12) são semelhantes aos encontrados na literatura.^26,27 Além disso, como não houve diferença entre a rP/C de um grupo para outro, sugere-se que os valores encontrados na urina de 12 horas podem ser usados na avaliação da proteinúria.

Mediante a redução da ingestão de sais, proteínas e carboidratos contidos na ração, ocorrem modificações nos mecanismos fisiológicos que regulam a homeostase hídrica, o que leva os animais a ingerirem menor volume de líquidos.²⁸ Os animais do grupo JE12 não foram alimentados durante um período prolongado de 12 horas, o que resultou na diminuição de aproximadamente 70% da ingestão de líquidos com relação ao grupo G12. Apesar disso, houve aumento significativo do volume de diurese dos animais submetidos ao jejum, sem caracterizar, porém, anormalidade, uma vez que a diurese (7,9 ± 2,6 ml) e a ingestão hídrica (5,8 ± 2,6 ml) são semelhantes aos descritos.^{11,14,15,21-23}

O número de horas de jejum é definido de acordo com o exame a ser realizado e essa necessidade decorre do fato de que a alimentação pode alterar a composição sanguínea momentaneamente induzindo um possível erro na leitura das amostras.²⁹ Dois exames muito empregados no monitoramento da função renal são as dosagens de creatinina e ureia no soro, que apresentam variações em função de fatores fisiológicos, como ingesta e catabolismo proteico.³⁰ Apesar do jejum não ser claramente recomendado para a dosagem de creatinina no soro, foram observados valores maiores no grupo sem jejum, mas mantendo-se dentro da faixa de normalidade. Esta diferença não é representativa de detecção de disfunção renal, visto que foram encontrados na literatura valores semelhantes para animais de grupos controle. Em experimentos de padronização, o valor de referência de creatinina no soro dos animais normais foi de 0,50 ± 0,07 mg/dL, sendo os ratos machos adultos, mantidos por 12 a 15 horas de jejum.^11,12 Em outros estudos, os animais normais apresentaram média de 0,60 ± 0,10 mg/dL³¹ e 0,60 ± 0,02 mg/dL³² de creatinina sérica, demonstrando que pequenas variações intraespécies e entre colônias podem existir.

O jejum também não influenciou os valores de ureia. Valores próximos aos encontrados neste estudo foram descritos na literatura, em estudos que submeteram ratos machos, adultos e saudáveis a 12 horas de jejum.^12,32 Também foram encontrados na literatura valores mais altos para animais nessas mesmas condições de saúde, porém não submetidos ao jejum.³¹

As dosagens de creatinina sérica não foram significativamente alteradas pelo jejum, porém, a creatinina na urina foi inferior, o que alterou também os cálculos de depuração da creatinina. A hipótese é de que a ração presente nas gaiolas do grupo G12 possa ter contaminado os coletores de urina e terem sido lidas como creatinina. Já havia sido relatado que partículas de alimentos são derramadas enquanto os animais permanecem nas gaiolas metabólicas.³³ Foi relatado também o oferecimento da ração em forma de pó na tentativa de diminuir a contaminação dos coletores com partículas de alimento.²⁵ A ausência de ração durante as 12 horas noturnas para o grupo JE12 pode ser a causa da diminuição dos valores de creatinina na urina. Apesar disso, tais valores não caracterizaram alterações importantes do ponto de vista biológico de função renal, e foram semelhantes aos valores encontrados na literatura.^11,17 O mesmo pode ser dito para os valores de PT 24 horas.

A dosagem de creatinina é um teste vantajoso, porém, os valores de creatinina sérica não aumentam significativamente até que a função seja consideravelmente comprometida.^34,35 Além disso, existem algumas substâncias que podem ser erroneamente lidas como creatinina (corpos cromógenos); algumas dessas normalmente estão presentes no sangue ou na urina, ou são encontradas apenas em estados de doença.³⁶

Diversas abordagens têm sido apresentadas na tentativa de reduzir as interferências sofridas pelos fluidos corporais.³⁷ Neste estudo foi avaliada a interferência de proteína no experimento Desproteinização. As amostras de urina usual apresentaram média mais alta de creatinina com relação às amostras de urina desproteinizada. Apesar de não haver diferença significativa entre as médias, foi observada redução de menos de 5 mg/dL de creatinina na urina usual para da urina desproteinizada, caracterizando a possível existência de substâncias proteicas interferentes na urina usualmente utilizada. Além disso, a correlação e a ausência de viés entre urina usual e urina desproteinizada permitiram supor que o procedimento de desprotenização eliminou tais interferentes e possibilitou mensurar dosagens mais fidedignas de creatinina na urina. Entretanto, não houve diferença do ponto de vista biológico, mostrando que tal interferência se comporta de maneira sistemática para todos os animais.

Em contrapartida, os resultados encontrados nas amostras de soro foram contrários aos das amostras de urina. Esperávamos que a desproteinização eliminasse as substâncias interferentes, sendo assim, o soro desproteinizado apresentaria valores mais baixos de creatinina, porém, isso não ocorreu. Não houve diferença significativa entre as amostras e a correlação foi positiva, porém, houve aumento das médias de creatinina, de amostras usuais em relação às amostras desproteinizadas. Esse aumento não foi linear para todas as amostras isoladamente, o desvio padrão foi diversas vezes mais alto, mostrando que o procedimento de desproteinização se comportou de maneira diferente para cada amostra. A diferença entre soro usual com relação ao soro desproteinizado para algumas amostras era positiva, em outras, era negativa, indicando que o procedimento de desproteinização não foi eficiente, produzindo resultados não comparáveis. Observou-se evidência de viés sistemático e linear na comparação entre creatinina no soro usual e do soro desproteinizado, revelando a ineficiência da desproteinização das amostras de soro. Em um estudo que também utilizou o método de desproteinização, foram encontrados valores mais baixos de creatinina sérica de ratos adultos normais (0,36 ± 0,02 mg/dL).¹⁷ Quanto aos valores médios da depuração da creatinina, não houve diferença significativa entre amostras usuais e desproteinizadas, provavelmente devido à falta de linearidade das amostras desproteinizadas, o desvio padrão foi muito mais alto para este grupo.

Após comprovar que a desproteinização em soro usual não foi linear, decidiu-se aplicar o método em soro de animais com IRA que sabidamente apresentariam creatinina sérica elevada, tendo em vista que, em condições de doença, as dosagens de creatinina podem sofrer ação de interferentes.³⁶

Foram utilizados dois equipamentos de leitura, o analisador automático pelo método espectrofotométrico e a leitora de ELISA, teoricamente com eficiência superior de capacidade de leitura. Os valores lidos, porém não foram diferentes, levando a crer que não haveria necessidade do uso do equipamento mais preciso. Os valores de creatinina encontrados nas amostras dos animais com IRA, analisados pelos dois aparelhos, estão de acordo com trabalhos que também utilizaram o modelo de IRA.^14,38 Sendo assim, a desproteinização das amostras de soro não trouxe informação significativa na interpretação dos resultados das dosagens de creatinina.

Estudos em humanos tentam facilitar a forma de coleta de urina, propondo a coleta de amostra única e estimando a PT 24 horas por meio da rP/C. Nestes estudos e após anos de aplicação clínica, os valores são utilizados sem necessidade de correção.^19,39 Em animais,^27,40 como encontrado no presente estudo, verifica-se, porém, que a relação entre os valores não é a mesma. Aplicando o modelo de regressão linear, foi encontrada a relação matemática entre as duas variáveis, criando, assim, uma forma prática de estimar nestes animais a PT 24 horas a partir dos resultados de uma amostra de urina. Esta equação proporcionará maior bem-estar animal, pois permitirá a redução da permanência dos animais em gaiolas metabólicas. Permitindo, em alguns casos, a coleta pontual de urina em um período específico do dia sem que os animais sejam alimentados, evitando a contaminação pela ração.

Uma das limitações deste estudo foi a unidade amostral reduzida de 4 a 6 animais por grupo. Não havendo um consenso do número de animais para padronização de técnicas de avaliação, o tamanho da amostra foi baseado em relações matemáticas determinando o número de animais necessários para alcançar significância para p < 0,05. Outra limitação existente se refere às divergências entres estudos sobre a realização da técnica de desproteinização.

Conclusões

A partir dos dados apresentados foi possível concluir que, para os ratos da colônia do Centro de Biologia da Reprodução:

A avaliação da função renal deve ser realizada com a coleta da urina de 24 horas.

O jejum se mostrou desnecessário, assim como o procedimento de desproteinização.

Foi comprovada a viabilidade da leitura por espectrofotometria.

A partir dos valores de rP/C, foi proposta uma equação prática para estimar a PT 24 horas neste grupo de animais, permitindo a coleta pontual de urina e evitando a contaminação pela ração.

A definição da metodologia de avaliação da função renal possibilitará a produção de evidências científicas de melhor qualidade, além de aprimorar o número e o bem-estar dos animais envolvidos na experimentação.