Introdução

Fatores de transcrição constituem uma família de proteínas muito diversa, envolvida na ativação ou supressão da transcrição de um gene, em um determinado momento. Durante o desenvolvimento, os fatores de transcrição são responsáveis por direcionar o destino das células individuais. Várias linhas de evidência demonstraram o papel dos genes do fator de transcrição no desenvolvimento craniofacial e também as variantes desses genes desempenhando um papel crucial na etiologia da fenda labial não sindrômica com ou sem fenda palatina (FLNS/P).^1,2 O fator regulatório interferon-6 (IRF6) é um fator de transcrição que codifica o domínio de ligação ao DNA hélice -giro- hélice e o domínio de ligação à proteína menos conservado. Nos seres humanos, nove IRFs foram relatados e a análise da composição da sequência de aminoácidos mostrou 89% de similaridade entre IRF6 e IRF5, que desempenham um papel na ativação do interferon e na supressão tumoral.³ A hibridização in situ de embriões de ratos demonstrou que o IRF6 tem alta expressão nas bordas medianas das prateleiras palatinas emparelhadas imediatamente antes e durante a sua fusão. A expressão de IRF6 também foi detectada em folículos capilares, rugas palatinas, germes dentários, ducto tireoglosso, genitália externa e na pele de todo o corpo.⁴ Pesquisas recentes mostraram que os camundongos com IRF6 mutante exibem uma epiderme hiperproliferativa que não sofre diferenciação terminal, o que leva a múltiplas adesões epiteliais que podem ocluir a cavidade oral e resultar em fenda palatina.⁵

O Fator Regulatório Interferon-6 (IRF6) está localizado no cromossomo 1q32.2 e é um dos genes candidatos associados com ambos os tipos de fendas sindrômicas e não sindrômicas.^6-8 Além disso, vários estudos de associação do genoma inteiro, GWAS, (do inglês Genome-Wide Association Studies) identificaram IRF6 como um locus associado com fendas orais.^9,10 Esse gene contém 10 exons e, entre eles, os exons 1, 2 e 10 não são codificadores. A proteína codificadora do IRF6 contém um total de 517 aminoácidos e contém um domínio N-terminal de ligação ao DNA hélice- giro- hélice e um domínio C-terminal SMIR (Fator de ligação regulador de interferon). Estudos em seres humanos mostraram que alelos comuns em IRF6 eram associados à FLNS/P em diferentes populações.¹¹

Nosso estudo anterior indicou que haplótipos de dois polimorfismos de genes IRF6 estão associados à FLNS/P.¹² Neste estudo, estendemos nosso trabalho anterior para avaliar a associação entre Intron-6 dbSNP208032210:g.G>C (rs2235375) polimorfismo de nucleotídeo único com o risco de fenda labial não sindrômica com ou sem palato em uma população do sul da Índia.

Método

O Comitê de Ética da Instituição da Universidade Sri Ramachandra, Chennai, Índia, aprovou o projeto do estudo (Ref: IEC-NI / II / OCT / 25/60 datado de 12.01.2012). Consentimento informado foi obtido dos pais ou responsável legal quando o paciente era menor de idade. O estudo incluiu 176 casos de FLNS/P (77 do sexo feminino e 99 do sexo masculino) e 173 controles (77 do sexo feminino e 96 do sexo masculino). Os participantes do estudo foram recrutados do Centro de Fendas e Craniofacial da Universidade Sri Ramachandra, Chennai, Índia. Dois cirurgiões avaliaram independentemente o fenótipo da fenda, e os casos com retardo mental ou quaisquer outras anomalias foram excluídos do estudo. Dos 176 casos de FLNS/ P, 104 tinham fenda labial com fenda palatina (FL/P; 76 unilateral e 28 bilaterais), 40 tinham apenas fenda labial (FLI) e 29 apenas fenda palatina isolada (FPI). Ambos os casos de FLI e FPI eram unilaterais e nenhum dos pacientes tinha parentes afetados. Indivíduos pareados por idade e gênero sem histórico familiar de fenda foram recrutados como controles. Foi coletada uma amostra de sangue periférico de 3 mL de cada indivíduo e o DNA foi extraído utilizando-se um procedimento padrão.¹³ A genotipagem do IRF6 rs2235375 SNP foi realizada pela KBioscience usando KASPar.^14,15 A genotipagem de polimorfismo de nucleotídeo único através do sistema KASPar envolve PCR alelo-específica utilizando os oligonucleotídeos FRET quencher cassette (tabela 1). Com base na fluorescência obtida, os dados de chamada de alelos foram visualizados graficamente como um gráfico de dispersão usando o SNPViewer (http://www.lgcgenomics.com). O equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) foi avaliado em ambos os casos e grupos de controle usando o teste do qui-quadrado. As frequências alélicas foram estimadas pelo método de contagem de genes.¹⁶ A comparação das frequências de genótipos e alelos entre os casos e os grupos de controle foi analisada pelo teste do qui-quadrado. O odds ratio e os intervalos de confiança de 95% foram calculados utilizando genótipos e alelos de tipo selvagem como grupo de referência.

Resultados

A distribuição dos genótipos e alelos da variante IRF6 rs2235375 em ambos os casos e grupos de FLNS/P são apresentados na tabela 2. As proporções de genótipos foram 30,1% GG, 49,7% GC, 20,2% CC nos casos e 40,9% GG, 44,3% GC, e 14,8% CC nos controles. A frequência do alelo C foi 45,1% nos casos e 36,9% nos controles. As frequências do genótipo IRF6 rs2235375 eram distribuídas de acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg entre os controles (p = 0,519). Diferença significante nas frequências de alelos foi encontrada entre os grupos controle e os FLNS/P (tabela 3). Odds ratio e IC de 95% foram calculados para avaliar o risco relativo de fendas orais ao comparar as frequências genotípicas de casos e controles em modelos codominantes, dominantes e alélicos (tabela 3). Um risco significantemente maior de FLNS/P foi encontrado para o genótipo homozigoto (CC vs. GG; OR = 1,86; IC 95%: 1,0-3,47; p = 0,047). Um risco aumentado de FLNS/P também foi encontrado em modelos dominantes (GC + CC vs. GG; OR = 1,19; IC 95% 1,03-2,51; p = 0,034) e alélicos (C vs. G; OR = 1,40; IC 95%; 1,04 -1.90; p = 0,028). Na análise de subgrupos, a variante IRF6 rs2235375 mostrou risco significantemente aumentado de FPI em três modelos diferentes (tabela 3).

Discussão

Nossos achados mostram claramente que o IRF6 rs2235375 desempenha um papel predominante no desenvolvimento de FLNS/P. Este estudo fornece evidências confirmatórias para as variantes que foram relatadas anteriormente, como sendo associadas à FLNS/P. O papel do IRF6 foi identificado durante o desenvolvimento embrionário, mas sua função reguladora ainda precisa ser esclarecida.^5,17 No momento da fusão do palato, ocorre a degradação do epitélio da borda medial (EBM) e o aumento da expressão do IRF6 foi observado na EBM durante este processo.^18,19 Os padrões de expressão do desenvolvimento de ortólogos do IRF6 em camundongos e pintinhos revelaram presença de expressão do IRF6 na fusão do ectoderma formando o lábio superior e o palato primário em ambos os ratos e pintinhos, mas apenas no desenvolvimento do palato secundário do camundongo.²⁰

Uma meta-análise de 20 estudos de caso-controle publicados demonstrou que rs2235371 e rs642961 são antagonistas entre si na atribuição do risco de FLNS /P.²¹ O alelo "A" de um polimorfismo funcional (rs2235371; 820G > A) contribuiu para um aumento do risco de FLNS/P na população chinesa.²² De maneira inversa, o alelo "G" foi sobre-transmitido em poucos estudos.¹¹ Poucas análises baseadas em haplótipos confirmaram que o rs2235371 estava associado à FLNS / P.^23-25 Em contraste com isso, o SNP rs2235371, não mostrou associação com fendas orais em algumas populações.^26-29 Demonstramos anteriormente que o alelo G do IRF6 rs2235371 é sobre-transmitido em pacientes Indianos com fendas, mas o genótipo 820GG contribuiu apenas para um risco menor.³⁰ Há poucos estudos de associação disponíveis para o SNP rs642961, mas os resultados foram inconsistentes. Foi observada associação significante entre rs642961 e FLNS/ P.^26,31-34 Em contraste com os estudos acima mencionados, nenhuma associação foi relatada por vários estudos.^29,35-37

Os estudos de associação do genoma inteiro, e seus estudos de replicação de seguimento estabeleceram o IRF6 como um dos genes candidatos para a patogênese da FLNS/ P.³⁸ O polimorfismo analisado nesse estudo (rs2235375) está localizado no intron-6 do IRF6. Este polimorfismo demonstrou uma associação positiva entre essa variante e FLNS/ P em várias populações, como a italiana,⁷ europeia-americana,²⁵ norueguesa,³⁹ chilena,²⁸ chinesa⁴⁰ e brasileira.⁴¹

Conclusão

Em conclusão, os resultados do presente estudo indicam que o polimorfismo IRF6 rs2235375 está associado à FLNS/P em uma população do sul da Índia.