Prevalência das inversões nos íntrons 1 e 22 do gene do fator VIII e inibidores em pacientes do sul do Brasil

Prevalência das inversões nos íntrons 1 e 22 do gene do fator VIII e inibidores em pacientes do sul do Brasil

Autores:

Maria Cristina S. M. Corrêa,
Euripides Ferreira,
Marcelo T. A. Veiga,
Eliane Bandinelli,
Clévia Rosset

ARTIGO ORIGINAL

Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial

versão impressa ISSN 1676-2444versão On-line ISSN 1678-4774

J. Bras. Patol. Med. Lab. vol.55 no.6 Rio de Janeiro nov./dez. 2019 Epub 02-Mar-2020

http://dx.doi.org/10.5935/1676-2444.20190053

INTRODUÇÃO

O tratamento da hemofilia consiste na reposição endovenosa do fator deficiente. A formação de inibidores [anticorpos policlonais da classe de imunoglobulina G (IgG)] contra o fator exógeno é a complicação mais grave da terapia de reposição em pacientes com hemofilia®. Os pacientes acometidos passam a não responder à infusão do fator deficiente e apresentam episódios hemorrágicos de difícil controle.

Entre 10% e 30% dos pacientes com hemofilia A desenvolvem inibidores ao tratamento, enquanto a incidência entre aqueles com hemofilia B é muito mais baixa, ao redor de 1%-5%(2). A produção de inibidores é influenciada por fatores tanto genéticos quanto não genéticos(3,4). Os principais fatores genéticos são o tipo de mutação que causou a doença e a suscetibilidade genética das moléculas de superfície celular envolvidas na resposta imune, como as moléculas do complexo principal de histocompatibilidade, os receptores de linfócitos T e os receptores de citocinas, assim como várias moléculas imunomoduladoras(5).

As mutações associadas ao risco mais elevado de desenvolvimento de inibidores são aquelas que impedem a síntese da proteína endógena (mutações nulas) e estão relacionadas com o fenótipo grave da doença. Essas são as grandes deleções, mutações nonsense e (para hemofilia A) mutações de inversão nos íntrons 1 e 22(5,6).

Estima-se que mais de 40% dos casos graves de hemofilia A sejam causados por inversões no gene do fator VIII(7).

OBJETIVOS

O objetivo deste estudo foi estabelecer a prevalência das inversões nos íntrons 1 e 22 do gene do fator VIII em uma amostra de pacientes com hemofilia A do estado do Paraná, Brasil, correlacionando essas mutações com a presença de inibidores contra o fator VIII e sua quantificação na mesma população.

MÉTODO

Os participantes do estudo tinham hemofilia A e foram cadastrados no Centro de Hematologia e Hemoterapia do estado do Paraná. Procurou-se selecionar pacientes de famílias diferentes porque indivíduos hemofílicos de uma mesma raiz familiar exibem a mesma mutação causadora da doença. Trata-se de um estudo experimental observacional, analítico e transversal.

Os inibidores foram detectados por meio do teste de mistura. O método de Bethesda foi utilizado para quantificar inibidores e classificar amostras como de baixa/alta resposta; isto é, quando os inibidores tivessem níveis persistentes < 5 unidades Bethesda (UB)/ml ou acima de 5 UB/ml em resposta à exposição a um fator exógeno, respectivamente. Essa classificação correlaciona-se com a severidade clínica, uma vez que os pacientes com < 5 UB/ml geralmente respondem a um aumento na dose de fator infundida, enquanto aqueles com mais de 5 UB/ml necessitam do uso de um agente de by-pass para o controle dos episódios de sangramento(2).

A reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando transcrição reversa foi aplicada para identificar a inversão no íntron 22(8); a PCR rápida, para identificar a inversão no íntron 1(9).

As frequências de prevalência obtidas neste estudo foram comparadas com aquelas de artigos publicados no PubMed nos últimos 10 anos, mediante a seleção de estudos com o maior número de participantes. O teste de frequência qui-quadrado (c2) foi aplicado com um a de 5%, e simulações aleatórias de Monte Carlo foram realizadas nas situações em que os pressupostos do teste de frequência não foram atendidos. Os testes foram realizados por meio da plataforma R. A diferença estimada entre variáveis categóricas foi feita usando o teste exato de Fischer, com um nível de significância mínimo de 5%.

A pesquisa foi conduzida de acordo com a Declaração de Helsinki Revisada em 2008, tendo sido aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa. Os pacientes assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Um total de 45 pacientes com hemofilia A severa foi testado para inversão no íntron 22, sendo 39 não aparentados; 84 participantes foram testados para inversão no íntron 1, sendo 77 não aparentados. A prevalência de inversão no íntron 22 entre indivíduos não aparentados foi 41% e não exibiu diferença significativa (c2 = 1,13; p = 0,3)(10). A prevalência de inversão no íntron 1 entre pacientes não aparentados foi 2,6% e também não mostrou diferença significativa (c2 = 0,05; p = 1,18)(11).

Leiria et al. (2009)(12) estudaram 107 pacientes com hemofilia A também no sul do Brasil, mas no estado do Rio Grande do Sul, e relataram uma prevalência de 46% e 3% para inversões nos íntrons 22 e 1, respectivamente.

A prevalência de inibidores em pacientes aparentados e não aparentados com inversão no íntron 22 foi 26,3% e não mostrou diferença significativa (c2 = 0,01;p = 0,9)(10). Entretanto, uma diferença significativa (c2 = 26; p < 0,01) foi observada entre pacientes com inversão no íntron 1(11).

Embora não utilizados neste estudo, aplicativos para a construção de heredogramas, como o Sistema de Elaboração e Gerenciamento de Heredogramas (SEGH), podem facilitar a classificação dos pacientes em aparentados e não aparentados e tornar a coleta de amostras dos não aparentados mais efetiva, uma vez que na presença de múltiplos membros familiares acometidos, a coleta adequada de história familiar é tarefa árdua(13).

Em relação ao comportamento dos inibidores nos 45 pacientes testados para inversão no íntron 22, a prevalência de inibidores nos pacientes com e sem inversão (19 e 26 pacientes, respectivamente) foi muito semelhante: 26,3% (n = 5) e 26,9% (n = 7), respectivamente. Desse modo, nenhuma diferença foi observada na distribuição da inversão no íntron 22 de acordo com a presença de inibidor (p = 1) (Figura 1), nem em relação ao grau de resposta (p = 0,41) (Figura 2). Os dois pacientes com inversão no íntron 1 não apresentaram inibidor.

FIGURA 1 Inversão no íntron 22 e comportamento dos inibidores contra o fator VIII (positivo/negativo) 

FIGURA 2 Inversão no íntron 22 e taxa de resposta aos inibidores (alta/baixa) 

As causas do desenvolvimento do inibidor permanecem indefinidas em relação aos vários fatores etiológicos possíveis.

CONCLUSÃO

A inversão no íntron 22 do gene do fator VIII não esteve associada ao maior risco de desenvolvimento de inibidores na amostra analisada, enquanto o pequeno número de pacientes com inversão no íntron 1 não permitiu a aplicação de um teste estatístico para determinar sua associação com o risco de desenvolvimento de inibidores.

REFERÊNCIAS

1 Castaldo G, D'Argenio V, Nardiello P, et al. Haemophilia A: molecular insights. Clin Chem Lab Med. 2007; 45(4): 450-61.
2 Ministério da Saúde. Secretaria de Atenção à Saúde, Departamento de Atenção Especializada. Manual de Hemofilia. 2. ed. Brasília: Editora do Ministério da Saúde; 2015.
3 Iorio A, Barbara AM, Makris M, et al. Natural history and clinical characteristics of inhibitors in previously treated haemophilia A patients: a case series. Haemophilia. 2017; 23(12): 255-63.
4 Lovgren KM, S0ndergaard H, Skov S, Wiinberg B. Non-genetic risk factors in haemophilia A inhibitor management - the danger theory and the use of animal models. Haemophilia. 2016; 22(5): 657-66.
5 Astermark J. Why do inhibitors develop? Principles of and factors influencing the risk for inhibitor development in haemophilia. Haemophilia. 2006; 12(3): 52-60.
6 Oldenburg J, Picard JK, Schwaab R, Brackmann HH, Tuddenham EGD, Simpson E. HLA genotype of patients with severe haemophilia A due to intron 22 inversion with and without inhibitors of factor VIII. Thromb Haemost. 1997; 77(2): 238-42.
7 Payne AB, Miller CH, Kelly FM, Soucie JM, Hooper WC. The CDC hemophilia A mutation project (CHAMP) mutation list: a new online resource. Hum Mutat. 2013; 34(2): E2382-91.
8 Rossetti LC, Radic CP, Larripa IB, De Brasi CD. Genotyping the haemophilia inversion hotspot by use of inverse PCR. Clin Chem. 2005; 51(7): 1154-8.
9 Bagnall RD, Waseem N, Green PM, Gianelli F. Recurrent inversion breaking intron 1 of the factor VIII gene is a frequent cause of severe haemophilia A. Blood. 2002; 99(1): 168-74.
10 Margaglione M, Castaman G, Morfini M, et al. The Italian AICE-genetics hemophilia A database: results and correlation with clinical phenotype. Haematologica. 2008; 93: 722-8.
11 Schröder J, El-Maarri O, Schwaab R, Müller CR, Oldenburg J. Factor VIII intron-1 inversion: frequency and inhibitor prevalence. J Thromb Haemost. 2006; 4(5): 1141-3.
12 Leiria LB, Roisenberg I, Salzano FM, Bandinelli E. Introns 1 and 22 inversions and factor VIII inhibitors in patients with severe haemophilia A in southern Brazil. Haemophilia. 2009; 15: 309-13.
13 Corrêa LA. Desenvolvimento de uma aplicação web para construção de heredogramas e gerenciamento de dados de pacientes [thesis]. Curitiba: Faculdades Pequeno Príncipe; 2012.
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