Redução do Marcador Inflamatório TNF-α após Consumo de Semente de Linhaça por Coelhos Hipercolesterolêmicos

Redução do Marcador Inflamatório TNF-α após Consumo de Semente de Linhaça por Coelhos Hipercolesterolêmicos

Autores:

Maynara Leonardi Schuh Martins,
Aniely Bacelar Rocco de Lima,
Ana Flavia Champoski,
Pamela Cristiani Pereira,
Fernando Martins,
Carlos Tanizawa,
Leonardo Précoma,
Patrícia Campelo,
Luiz César Guarita-Souza,
Dalton Bertolim Précoma

ARTIGO ORIGINAL

International Journal of Cardiovascular Sciences

versão impressa ISSN 2359-4802versão On-line ISSN 2359-5647

Int. J. Cardiovasc. Sci. vol.31 no.2 Rio de Janeiro mar./abr. 2018

http://dx.doi.org/10.5935/2359-4802.20180002

Introdução

A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica marcada por disfunção endotelial que afeta a camada íntima das artérias de médio e grande calibre.1 Este processo ocorre lentamente ao longo de décadas e tem o potencial de evoluir para lesões mais avançadas que podem romper e desencadear a formação de trombo, potencialmente levando ao infarto agudo do miocárdio e morte.2

Vários fatores estão implicados na etiologia da aterosclerose, incluindo elevação persistente de lipoproteínas séricas aterogênicas (como a lipoproteína de baixa densidade [LDL-C]), que estão associadas com fatores de estilo de vida como hábitos alimentares inadequados, sedentarismo e obesidade, além de deposição dessas lipoproteínas na túnica média.2,3

Muitos produtos alimentares com propriedades funcionais/nutracêuticas têm sido estudados com o objetivo de impedir o desenvolvimento de placas ateroscleróticas e promover efeitos cardiovasculares positivos. Esses produtos contêm fibras alimentares, fitoesteróis, ácidos graxos ômega 3, antioxidantes e polifenóis,4 o que pode diminuir significativamente o efeito de fatores ateroscleróticos. Um destes produtos é a linhaça (Linum usitatissimum L.).

A composição nutricional da linhaça compreende gorduras (41%), fibras alimentares (28%), proteínas (21%), umidade (7,7%), cinzas (3,5%) e açúcares solúveis (1 – 2%)5,6 e seu conteúdo lipídico inclui 51 – 55% de ácido alfa-linoleico.7 Além disto, a linhaça é a fonte mais rica da lignana secoisolariciresinol-diglicosídeo (SDG), que tem propriedades antioxidantes e antiaterogênicas potentes.

Com base nestas considerações, o estudo das propriedades funcionais da linhaça torna-se essencial para a comunidade científica e a população em geral. O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos potenciais da linhaça na aterogênese em coelhos submetidos a uma dieta rica em colesterol (contendo 0,25% de colesterol) com uso de ovos liofilizados. Para este fim, foi realizada análise do perfil lipídico e análise imunohistoquímica de marcadores inflamatórios em segmentos aórticos de coelhos.

Métodos

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da PUC-PR sob o protocolo de número 720/2012 e foi conduzido no Laboratório de Cirurgia Experimental do Hospital Angelina Caron (HAC), no Laboratório de Patologia Experimental da PUC-PR e no Biotério da PUC-PR.

Animais

Trinta coelhos New Zealand (Oryctolagus cuniculus) machos, brancos, com peso aproximado de 3 kg e idade média de 4 meses foram selecionados para o experimento. O cálculo do tamanho da amostra foi baseado no estudo de Prim et al., 8 Os coelhos foram mantidos no biotério da PUC-PR em um macroambiente com ciclos luz/escuro de 12/12 horas, mudanças de ar fresco e temperatura controlada entre 19°C e 23°C. Os animais foram identificados individualmente e mantidos em gaiolas individuais limpas diariamente.

Período experimental e distribuição de grupos

O estudo foi realizado ao longo de 12 semanas (84 dias). Os animais foram mantidos em gaiolas individuais e randomizados em três grupos de acordo com o tratamento dietético. O grupo controle (G1, n = 10) recebeu uma dieta padrão para coelhos (Nuvital® Nutrientes S.A. Colombo, PR, Brasil). O grupo randomizado para uma dieta rica em colesterol (G2, n = 10) recebeu uma dieta padrão para coelhos (Nuvital®) mais 0,25% de colesterol a partir de ovos liofilizados. O grupo randomizado para uma dieta rica em colesterol mais linhaça (G3, n = 9) recebeu uma dieta padrão para coelhos (Nuvital®), 0,25% de colesterol a partir de ovos liofilizados e 8 g de linhaça moída por kg de peso corporal.

Preparação da alimentação complementar

A dieta rica em colesterol oferecida aos grupos G2 e G3 durante todo o período experimental continha 0,25% de colesterol, que foi adicionado com o objetivo de induzir lesões ateroscleróticas na aorta. Para este efeito, 5 kg de ração padrão (Nuvital®), pesada e moída para cada grupo de animais foi adicionada a 1.800 g de ovo em pó diluído em 2.000 mL de água.

A concentração de linhaça foi de 8 g por kg de peso corporal. As sementes foram moídas em um processador de alimentos e armazenadas sob refrigeração antes de serem adicionadas aos alimentos.

A alimentação para os grupos G2 e G3 foi complementada com ovos liofilizados. Esta mistura foi processada com utilização de um triturador de carne industrial (Poli®, modelo PCP-22LR-N, boca #10, Siemsen, Brusque, SC, Brasil). Para o grupo G3, a mistura foi complementada com a linhaça moída. Após a mistura ter sido triturada, foi transformada em pelotas, que foram aquecidas em um forno elétrico por 10 minutos a uma temperatura de 180°C.

O preparado alimentar foi armazenado sob refrigeração até o uso.

Preparação dos animais e coleta da amostra

Os animais foram anestesiados e sangue foi coletado de acordo com o método descrito por Précoma et al.,9 e Alessi et al.,10 Xilazina (Coopazineâ; Schering-Plough-Coopers, Cotia, SP, Brasil) a 5 mg/kg misturada com cetamina (Vetanarcolâ, König, Mairinque, SP, Brasil) a 30 mg/kg foi administrada por via intramuscular na região da coxa dos coelhos. Análises bioquímicas realizadas nos dias 1 e 84 incluíram colesterol total (CT), LDL-C, lipoproteína de alta densidade (HDL-C) e triglicérides (TG), que foram avaliados com equipamento automatizado (ADVIA 1200, Siemens Healthcare Diagnostics, Inc. Newark, EUA) e kits comerciais.

Análise histológica

A aorta torácica foi removida ao nível da bifurcação aortoilíaca após toracotomia e laparotomia mediana. Seções transversais com 2 a 3 mm de espessura foram cortadas a partir de diferentes segmentos aórticos. Cada segmento foi identificado, montado em um micrótomo (Leica® RM2145, Leica Microsystems Nussloch GmbH, Alemanha) para processamento durante a noite e desidratado com etanol em concentrações seriadas (70%, 80% e 90%). As amostras de tecido foram posteriormente diafanizadas por 12 horas em xilol contendo concentrações seriadas de parafina. Blocos de parafina foram obtidos através da incorporação das amostras em parafina quente com utilização de um inclusor (Leica® EG1160, Leica Microsystems Nussloch GmbH, Alemanha), de acordo com o procedimento padrão.

Os blocos de parafina foram cortados em seções de 5 µm com utilização do micrótomo (Leica® RM 2145). Cada seção foi corada com hematoxilina e eosina (HE) e orceína (coloração para tecido elástico) de acordo com técnicas convencionais e montada em lâminas permanentes.

Blocos com quatro segmentos de aorta foram preparados por meio de seleção de um segmento proximal perto do arco aórtico (ponto 1), um segmento localizado na aorta torácica (ponto 2), um segmento proximal na aorta abdominal (ponto 3) e um segmento distal da aorta abdominal (ponto 4). Estes segmentos foram selecionados de acordo com os achados histológicos na coloração com HE.

Análise imunohistoquímica

A técnica de arranjo em matriz de amostras teciduais (tissue microarray; TMA) foi utilizada para a análise imunohistoquímica. As amostras foram incubadas com anticorpos monoclonais contra a molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) a uma diluição de 1:50 e misturadas com anticorpo monoclonal contra o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) por 1 hora. Os anticorpos foram detectados por incubação das lâminas com o substrato 3,3-diaminobenzidina (DAB; DakoCytomation A/S, Glostrup, Dinamarca). Contracoloração foi realizada com hematoxilina de Mayer, seguida por desidratação da amostra com diferentes concentrações de etanol a 100% e desparafinizadas com xilol. As lâminas foram montadas com bálsamo do Canadá. O protocolo descrito acima foi padronizado em nosso departamento. Controles positivos e negativos foram utilizados para cada reação.

Os cortes histológicos foram digitalizados com um scanner (Axio Scan Z1, Zeiss, Jena, Alemanha) e as imagens foram analisadas com o programa Image-Pro Plus®, versão 4.5. O método de morfometria de cores foi aplicado, colorindo em rosa as áreas com imagens positivas de anticorpos e em marrom aquelas com imagens negativas. Os dados foram transferidos para uma planilha do Excel e submetidos à análise estatística.

Análise estatística

Os resultados estão expressos como média, mediana, valor mínimo e máximo e desvio padrão. A suposição de normalidade das variáveis foi avaliada através do teste de Kolmogorov-Smirnov. As variáveis que não satisfizeram a suposição de normalidade foram analisadas com o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. Os valores de p abaixo de 0,05 foram considerados estatisticamente significantes. Os dados foram analisados com o programa estatístico IBM SPSS, versão 20.0.

Resultados

Ocorreu um óbito no grupo G3 na semana experimental 12, resultando em um total de 29 coelhos na amostra final do estudo.

Perfil lipídico

Colesterol total

Os níveis séricos de CT foram significativamente mais altos nos grupos G2 e G3 em comparação com o G1. Este resultado demonstra que a dieta foi eficaz em aumentar os níveis de colesterol nos coelhos (Tabela 1).

Tabela 1 Média, mediana, valor mínimo e máximo, desvio padrão e valores de p para o colesterol total nos três grupos 

Variável Grupo n Média Mediana Mínimo Máximo Desvio padrão Valor de p*
Colesterol total (basal) Controle (G1) 10 35,60 34,00 14,00 69,00 15,13
Colesterol (G2) 10 24,60 24,50 12,00 43,00 9,51
Linhaça (G3) 9 28,33 24,00 15,00 54,00 13,51 0,174
Colesterol total (final do estudo) Controle (G1) 10 23,64 21,50 8,90 57,00 15,72
Colesterol (G2) 10 62,09 24,54 12,90 336,00 100,23
Linhaça (G3) 8 36,21 34,20 16,40 72,00 17,32 0,204
Diferença (final do estudo - linha de base) Controle (G1) 10 -11,96 -13,50 -31,00 6,00 12,50
Colesterol (G2) 10 37,49 2,55 -28,00 305,00 97,79
Linhaça (G3) 9 3,86 3,00 -19,00 18,00 10,83 0,029

*Teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, p < 0,05.

LDL-colesterol e HDL-colesterol

Não houve diferenças significativas nos níveis de LDL-colesterol e HDL-colesterol entre os grupos (Tabelas 2 e 3). No entanto, os níveis séricos de LDL-colesterol na análise bioquímica foram mais altos no grupo G2 ao final do experimento. O aumento no LDL-colesterol no grupo G3 foi cerca de seis vezes inferior ao do G2. Os níveis de HDL-colesterol aumentaram nos grupos G1 (12,93 mg/dL), G2 (82,26 mg/dL) e G3 (12,03 mg/dL), com o maior aumento observado no G2.

Tabela 2 Média, mediana, valor mínimo e máximo, desvio padrão e valores de p para o LDL-colesterol nos três grupos 

Variável Grupo n Média Mediana Mínimo Máximo Desvio padrão Valor de p*
LDL-colesterol (basal) Controle (G1) 10 8,64 8,45 2,90 18,10 5,61
Colesterol (G2) 10 7,83 6,30 1,20 27,10 7,60
Linhaça (G3) 9 11,92 7,40 4,50 27,30 7,94 0,305
LDL-colesterol (final do estudo) Controle (G1) 10 21,57 16,45 3,90 81,00 21,49
Colesterol (G2) 10 90,09 32,00 7,50 348,00 123,47
Linhaça (G3) 8 26,95 22,00 2,40 93,00 29,82 0,145
Diferença (final do estudo - linha de base) Controle (G1) 10 12,93 11,65 -5,70 63,50 19,71
Colesterol (G2) 10 82,26 21,95 4,90 341,80 124,45
Linhaça (G3) 9 12,03 0,50 -27,30 79,40 30,61 0,085

*Teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, p < 0,05.

Tabela 3 Média, mediana, valor mínimo e máximo, desvio padrão e valores de p para o HDL-colesterol nos três grupos 

Variável Grupo n Média Mediana Mínimo Máximo Desvio padrão Valor de p*
HDL-colesterol (basal) Controle (G1) 10 19,29 16,45 10,30 37,30 8,60
Colesterol (G2) 10 17,15 17,70 9,80 25,40 5,78
Linhaça (G3) 9 15,79 13,40 7,70 33,50 8,35 0,475
HDL-colesterol (final do estudo) Controle (G1) 10 21,55 22,50 1,00 41,90 12,80
Colesterol (G2) 10 48,76 25,65 4,30 290,70 85,99
Linhaça (G3) 8 28,16 26,25 4,20 60,00 17,71 0,780
Diferença (final do estudo - linha de base) Controle (G1) 10 2,26 -2,15 -13,30 14,90 10,39
Colesterol (G2) 10 31,61 9,00 -15,30 278,70 87,50
Linhaça (G3) 9 9,24 8,00 -16,50 46,60 17,48 0,570

*Teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, p < 0,05.

Triglicérides

A dieta não aumentou os níveis de TG nos grupos do estudo. Além disso, os níveis de TG no G3 reduziram cerca de 70% (Tabela 4). Ao final do estudo, os resultados indicaram diferenças significativas nos níveis de TG entre G1 e G3 (p = 0,034) e entre G2 e G3 (p = 0,015).

Tabela 4 Média, mediana, valor mínimo e máximo, desvio padrão e valores de p para os triglicérides nos três grupos 

Variável Grupo n Média Mediana Mínimo Máximo Desvio padrão Valor de p*
Triglicérides (basal) Controle (G1) 10 65,30 50,00 36,00 206,00 50,87
Colesterol (G2) 10 59,50 56,50 25,00 146,00 32,74
Linhaça (G3) 9 79,44 78,00 32,00 149,00 38,20 0,308
Triglicérides - (final do estudo) Controle (G1) 10 67,50 65,00 7,00 228,00 63,27
Colesterol (G2) 10 64,60 44,50 20,00 204,00 53,31
Linhaça (G3) 8 22,50 14,00 11,00 53,00 15,26 0,042
Diferença (final do estudo - linha de base) Controle (G1) 10 2,20 13,50 -56,00 47,00 33,98
Colesterol (G2) 10 5,10 -17,50 -98,00 148,00 66,92
Linhaça (G3) 9 -59,44 -63,00 -149,00 16,00 48,12 0,022

*Teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, p < 0,05.

Análise imunohistoquímica

A imunohistoquímica foi utilizada para investigar a presença da molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) e TNF-α nos quatro segmentos da aorta.

Os resultados indicaram que os níveis de ICAM-1 só aumentaram no segmento aórtico 4 no grupo G3, porém não houve diferença significativa em relação aos níveis medianos (Figura 1).

Figura 1 Média dos níveis da molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) no segmento aórtico 4 dos animais em cada grupo. 

Um resultado semelhante foi encontrado para o TNF-α, ou seja, o nível desse marcador foi significativamente mais elevado no segmento aórtico 4 (Figura 2). Os níveis de TNF-α no grupo G3 foram semelhantes aos do grupo controle, enquanto que os níveis no grupo G2 foram maiores do que o dobro em relação ao grupo controle (p < 0,05).

Figura 2 Média dos níveis de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) no segmento aórtico 4 dos animais em cada grupo. 

Discussão

A aterosclerose é uma doença cardiovascular importante e a compreensão do seu desenvolvimento é necessária para a sua prevenção e tratamento. Este conhecimento pode ser adquirido através de modelos experimentais. Neste contexto, vários estudos em animais têm demonstrado que uma dieta rica em gorduras conduz à obesidade, hipercolesterolemia e outras complicações como lesões endoteliais.11 O protocolo experimental do presente estudo foi um modelo precoce de aterosclerose e envolveu a adição de 0,25% de colesterol a partir de ovos liofilizados à dieta de coelhos com o objetivo de causar lesões ateroscleróticas.12 A utilização de coelhos como modelo experimental atende os objetivos do presente estudo porque esses animais desenvolvem lesões aórticas rapidamente.

Este estudo avaliou as alterações bioquímicas e imunoquímicas causadas por uma dieta rica em colesterol com e sem linhaça, considerada um alimento funcional.

O aumento no CT encontrado à análise bioquímica dos grupos G2 e G3 não era esperado no tratamento com linhaça. Um resultado semelhante foi obtido por Dupasquier et al., 13 que não observaram alterações de CT em animais que receberam uma dieta com 10% de linhaça. Este resultado inesperado pode ser explicado por vários fatores, incluindo a concentração de linhaça utilizada, a forma de administração da linhaça (sementes moídas), aquecimento do alimento para incorporação de componentes e a duração do consumo das sementes. Resultados anteriores indicaram que os ácidos alfa-linoleico e linoleico são sensíveis à luz, aquecimento e oxigênio, e sofrem oxidação quando exposto a temperaturas entre 120°C e 270°C.14 Por conseguinte, o processo de produção de alimentos contendo linhaça no presente estudo podem ter provocado uma redução do nível destes ácidos, comprometendo sua função nutracêutica.

Os níveis de LDL-colesterol aumentaram nos grupos tratados com a dieta rica em colesterol; no entanto, os níveis permaneceram semelhantes entre esses grupos. Resultados semelhantes foram obtidos em um estudo em seres humanos envolvendo o consumo de linhaça, no qual os níveis de CT e LDL-colesterol permaneceram inalterados,15 embora o período experimental de 4 semanas pode não ter sido suficiente para causar esta redução. Zheng et al.,16 realizaram um ensaio clínico randomizado em indivíduos com diagnóstico de hipercolesterolemia e utilizaram extrato de lignana de linhaça durante um período de 8 semanas. Os níveis de LDL-colesterol no grupo que recebeu 600 mg do extrato reduziram entre as semanas 6 e 8. Os autores concluíram que o extrato de lignana diminuiu a concentração de colesterol de maneira dose-dependente. Um estudo investigou o efeito da ingestão de fitoesterol e indicou que os níveis de colesterol no sangue reduziram após 4 semanas.17 Além disso, os níveis de colesterol permaneceram inalterados entre as semanas 8 e 12,18,19 o que sugere que fatores sazonais podem ter afetado os resultados.

No presente estudo, o CT aumentou em todos os grupos testados. Estudos têm mostrado que lignanas presentes na linhaça reduzem o colesterol sérico. Este efeito está provavelmente relacionado às suas propriedades antioxidantes, fornecidas pela lignana secoisolariciresinol-diglicosídeo (SDG), enterolactona e enterodiol, que inibem a peroxidação de ácidos graxos poli-insaturados in vitro e favorecem a diminuição dos níveis de colesterol.20 Uma hipótese para explicar a discrepância entre os resultados do presente estudo e outros na literatura é a alta concentração de colesterol ingerida. Outra hipótese é a duração da dieta funcional (8 semanas), o que pode ter sido demasiadamente curta para induzir uma redução significativa do LDL-colesterol e CT.

No presente estudo não houve diferença nos níveis de HDL-colesterol observados entre os três grupos. Níveis mais elevados de HDL-colesterol aumentam a proteção contra a formação de placas ateroscleróticas no coração. Estudos demonstraram que o consumo de linhaça a 15% esteve fortemente associado à proteção contra inflamação, estrógenos e genotoxicidade.21

Os resultados que consideramos mais fascinantes foram os relacionados aos níveis de TG. Houve uma diminuição significativa (aproximadamente 70%) neste parâmetro bioquímico no grupo G3, o que demonstra que a administração de alimentos contendo linhaça (um alimento funcional que contém principalmente ácidos graxos ômega 3, fibras e lignana) foi eficaz na redução dos níveis de TG. Este resultado está alinhado com os de estudos anteriores e sugere que a suplementação com ômega 3 através do consumo de linhaça ajuda a reduzir os níveis de TG, possivelmente através da redução de partículas de quilomícrons remanescentes e inibição da síntese e secreção de lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL-colesterol) pelo fígado.22

Cintra et al.,23 testaram o efeito do consumo de uma dieta rica em gordura e baseada em linhaça em ratos Wistar e observaram uma redução nos níveis de CT e TG, maior excreção fecal de lipídios e menor deposição de colesterol no fígado. Esse resultado foi semelhante ao obtido por Bhathena et al.,23

A imunohistoquímica foi utilizada para investigar a presença de dois marcadores envolvidos com inflamação, uma molécula de adesão celular (ICAM-1) e uma citocina pró-inflamatória (TNF-α). Vários estudos têm utilizado o ICAM-1 como um marcador de inflamação. Em um estudo com 60 coelhos (10 em um grupo controle e 50 em um grupo com aterosclerose), os animais alimentados com uma dieta rica em gordura apresentaram níveis mais elevados de ICAM-1 na aorta comparados com os do grupo controle (p < 0,01), o que indica um papel para a ICAM-1 como preditora de doença cardiovascular.25

A importância do presente estudo reside na análise do ICAM-1 em quatro segmentos da aorta. Os resultados indicaram um aumento nos níveis de ICAM-1 em todos os grupos de animais e todas as seções de tecido; no entanto, os resultados não foram estatisticamente significantes. Um resultado semelhante foi obtido em um estudo animal realizado por Prim et al.,8 em 2012 e em estudos em humanos, que também mostraram reduções não significativas nos níveis dos marcadores ICAM-1 e VCAM-1.26

Devemos salientar que nenhuma atividade anti-inflamatória foi observada no grupo que recebeu a linhaça (G3), sugerindo que os resultados do efeito anti-inflamatório dos ácidos graxos ômega 3 são contraditórios. Além disso, os resultados da ICAM-1 sugerem que esta atividade é dependente da duração do consumo de ácidos graxos ômega 3.

Os resultados da análise do TNF-α indicaram uma diferença significativa entre os grupos. Os níveis de TNF-α estiveram mais elevados no grupo G1 do que no G3. Este resultado demonstrou um efeito da linhaça, mas não foi estatisticamente significativo. Além disso, os níveis de TNF-α aumentaram no G2, o que indica que este marcador está associado com estresse e inflamação. Um resultado semelhante foi observado em um estudo anterior,27 no qual os níveis elevados de TNF-α estiveram associados com eventos coronarianos recorrentes após infarto do miocárdio.

Níveis do marcador inflamatório TNF-α reduziram significativamente no grupo G3 (grupo da linhaça), o que favorece a hipótese de que os componentes da linhaça possam reduzir a atividade anti-inflamatória e antiaterogênica. Um estudo anterior observou uma diminuição dos níveis de TNF-α após o consumo de ácidos graxos ômega 3 pela maioria dos pacientes.28

Conclusão

Os resultados do presente estudo estão alinhados com a literatura e mostraram uma redução no desenvolvimento de aterosclerose no grupo alimentado com uma dieta funcional.

Os resultados obtidos no grupo da linhaça mostraram alterações significativas nos níveis séricos de TG e diminuição dos níveis de TNF-α na análise imunohistoquímica. Esses achados corroboram as observações de estudos anteriores que demonstraram a linhaça como tendo uma forte tendência para agir efetivamente na redução dos níveis de TNF-α, evitando assim lesão e desenvolvimento de placas ateroscleróticas na íntima das artérias coronárias.

No entanto, várias diferenças podem surgir quando alterações são feitas no experimento ou protocolo de estudo. Por isso, sugerimos que mais estudos sejam conduzidos comparando diretamente estas sementes funcionais.

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