Introdução

A mortalidade neonatal é parte da mortalidade infantil. Esta tem sido definida como óbito ocorrido nos primeiros 28 dias de vida, e está associada, principalmente, a infecções congênitas ou adquiridas após o nascimento. Essas infecções afetam fortemente as causas de óbito e aborto em países não industrializados.^{1 , 2} Chlamydia trachomatis é a causa de grande parte das infecções bacterianas sexualmente transmissíveis em todo o mundo.³ A prevalência da infecção por C. trachomatisdurante a gravidez é variável: nos Estados Unidos, representa entre 2% e 13,7%; no Brasil, entre 2,7 e 10%⁴ e, no México, varia entre 4% e 28%.⁵ Ela está relacionada à ruptura prematura de membranas, corioamnionite, parto prematuro e desenvolvimento de oftalmia e pneumonia neonatal. Também está relacionada a altas taxas de baixo peso ao nascer e mortalidade perinatal.⁴ As manifestações clínicas variáveis apresentam tosse paroxística entrecortada, rinorreia prodromal e histórico de conjuntivite, taquipneia e febre. Os achados mais frequentes em radiografias de tórax são infiltrado intersticial dos campos pulmonares bilaterais, hiperinflação e atelectasia.⁶

O risco de transmissão vertical de C. trachomatis foi calculado entre 60% e 70%, e ocorre durante a passagem do bebê pelo canal do parto. Entretanto, há algumas evidências de que a transmissão vertical também possa ocorrer dentro do útero, pois os recém-nascidos por cesariana também se encontravam infectados e com membranas intactas.^{6 - 9}

Recentemente, Rours et al.¹⁰ demonstraram a presença do DNA de clamídia na placenta de prematuros e encontraram uma associação do DNA com o grau e progresso de inflamação tecidual. Atualmente, não há um bom modelo experimental disponível para infecções por Chlamydia durante a gravidez que forneceria conhecimento dos efeitos da Chlamydia sobre a gravidez e sua associação com óbito neonatal.

Além dos tecidos pulmonar e conjuntivo de recém-nascidos, também foi encontrada Chlamydia nos tecidos dos sistemas intestinal, geniturinário, do miocárdio e nervoso.^{11 - 13} A presença de Chlamydia nesses outros tecidos sugere que ela possui uma capacidade invasiva. O presente estudo visou detectar o DNA de clamídia em diferentes tecidos de neonatos diagnosticados com "infecção sem um patógeno isolado" e que vieram a óbito durante a primeira semana de vida. Estudamos, também, neonatos cuja causa evidente de óbito não foi infecciosa. Adicionalmente, buscamos identificar os genótipos de Chlamydiaenvolvidos nesses neonatos que desenvolveram infecção precoce.

Métodos

Resultados

Dos 73 casos disponíveis, 18 foram escolhidos aleatoriamente. Contudo, não foi possível localizar todos os órgãos de interesse em três casos, e os resultados do estudo da placenta não estavam disponíveis para um caso. A tabela 1 descreve os resultados dos 14 casos de mortalidade infantil estudados, as características perinatais dos recém-nascidos e os dados maternos mais relevantes. Quatro casos atenderam aos critérios de infecção ou infecção sistêmica neonatal (casos 1, 3, 4 e 8). Os casos 1 e 8 foram negativos para culturas bacterianas e fúngicas realizadas durante a vida ou após a morte. No primeiro dia de vida, no caso 3, Staphylococcus haemolyticus foi isolado por meio de hemocultura. No caso 4, o recém-nascido sobreviveu apenas uma hora, e não foram realizadas culturas microbiológicas correspondentes.

A busca intencional pelo DNA de Mycoplasma e Chlamydia nos tecidos post-mortem utilizando a reação em cadeia da polimerase resultou na amplificação do gene omp1 da C. trachomatis de 129 bp em cinco neonatos. Ele foi amplificado em dois ou mais órgãos nos casos 1, 2, 3 e 4, e apenas no rim, no caso 6. No caso 8, um produto de 715 bp, correspondendo a Mycoplasma, foi amplificado em tecidos do pulmão e do rim (imagem não mostrada).

DNA de clamídia foi encontrado em tecidos dos casos 2 e 9, porém, sem correlação clínica ou histopatológica indicando infecção. Esses casos apenas apresentaram prematuridade, barotrauma e hemorragia pulmonar. Adicionalmente, a amplificação dos fragmentos 1142 bp e 879 bp na análise do RFLP de amostras positivas para DNA de clamídia foi atingida apenas nos casos 1, 3 e 4 (fig. 1). A análise do RFLP das amostras, quando a amplificação do fragmento 879 bp foi obtida, apenas possibilitou a identificação do genótipo D da C. trachomatis (caso 1; fig. 2). Nos casos 2 e 6 não foi possível amplificar o fragmento 1142 bp, e foi confirmada a presença de DNA de clamídia no tecido do fígado, por meio da reação em cadeia da polimerase em tempo real, apenas no caso 2 (imagem não mostrada).

Figura 1 RC de fragmento de 879 bp do gene omp1 da Chlamydia trachomatis. Amostras desparafinizadas de órgãos da autópsia. F, fígado; P, pulmões; R, rins; C, cérebro; C-, Controle negativo; C+, Controle positivo. (Números pertencentes à classificação institucional de casos.) 

Figura 2 Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de Restrição (RFLP). Genótipo D do gene omp1 de Chlamydia trachomatis. Amostra: fígado do caso 1. Padrão da cepa: Chlamydia trachomatis UW-3/Cx (ATCC VR 885D). O produto de 879 bp foi restrito com Alu I. M, Marcador de peso molecular. 

Todos os casos foram intubados por via endotraqueal e receberam suporte ventilatório durante o período de vida. Foram encontrados seis casos de ruptura prematura de membranas. Dentre eles, foi comprovado DNA de clamídia em dois neonatos (casos 1 e 3), e os mesmos permaneceram in utero com a ruptura das membranas por oito a seis dias, respectivamente. As características clínicas de todos os casos podem ser vistas na tabela 2.

As causas de óbito nos casos restantes (casos 5 a 7 e 9 a 14) não foram associadas à infecção: quatro (29%) vieram a óbito devido a causas relacionadas ao nascimento prematuro; três (21%) devido a anomalias congênitas estruturais não compatíveis com vida; um devido à hydrops fetalis de origem não imunológica com pré-eclâmpsia grave; e um devido á isoimunização materno-fetal pelo Rh. Todos esses casos apresentaram resultados negativos da reação em cadeia da polimerase para C. trachomatis e Mycoplasma spp, com exceção do caso 6, mencionado anteriormente.

Discussão

As infecções graves ainda são a principal causa de morbimortalidade neonatal em regiões em desenvolvimento. Dentre os casos de mortalidade infantil, 3/4 ocorrem durante a primeira semana de vida e, em muitos casos, a causa do óbito permanece desconhecida.²³

Infecção por clamídia na fase perinatal e neonatal pode produzir várias doenças, incluindo conjuntivite, nasofaringite, pneumonite e, com menos frequência, rinite, otite do ouvido médio, miocardite e encefalite.⁴ Contudo, a descoberta de resíduos genéticos dessa bactéria intracelular em tecidos orgânicos é bem rara na literatura médica.²⁴ Neste estudo, foi encontrado DNA de clamídia em mais de dois órgãos em quatro casos (casos 1, 2, 3 e 4), o que sugere o potencial de infecção multivisceral por esse patógeno. Um desses casos foi o 2, no qual o neonato nasceu prematuramente por cesariana e veio a óbito devido à extensão do pneumotórax. O caso 2 não apresentou dados histopatológicos de inflamação nos pulmões ou na placenta; contudo, a repetição do achado de DNA de clamídia no cérebro e fígado desse recém-nascido mostra uma forte suspeita de infecção sistêmica por C. trachomatis. Devido à falta de determinação dos critérios histopatológicos, esse caso sugere que todo o espectro da patogênese por C. trachomatis ainda não é completamente conhecido.

Em momento algum foram realizados estudos de diagnóstico com relação à infecção por Chlamydia ou Mycoplasmanesses pacientes. Isso ocorreu, provavelmente, devido ao curto período de vida. Da mesma forma, as mães não foram testadas para patógenos atípicos durante a gravidez. A ausência de estudos sobre a infecção por C. trachomatis nessas mulheres ocorreu, provavelmente, em virtude do baixo ou nenhum controle médico durante a gestação: seis (43%) mulheres não fizeram controle médico, cinco (36%) passaram por apenas duas ou três consultas, e três (21%) passaram por cinco e seis consultas pré-natais.

A causa de óbito no caso 8 dessa série correspondeu a uma infecção sistêmica por Mycoplasma hominis. Ficou evidenciado que esse patógeno produz infecções graves em fetos e recém-nascidos, e que pode ser transmitido verticalmente. Dentre as infecções causadas por Mycoplasma hominis destacam-se pneumonia, que evolui rapidamente para displasia broncopulmonar, e infecções sistêmicas com prognósticos ruins, caso não detectadas e tratadas a tempo.²⁵ Essa situação também pode ocorrer com as infecções causadas por C. trachomatis.

A reação em cadeia da polimerase é o método mais sensível e rápido para detectar patógenos microbianos em espécimes clínicos, em especial, a Chlamydia e o Mycoplasma, que de difícil cultivo in vitro. A aplicação desse método em espécimes clínicos possui várias possíveis armadilhas devido à presença de inibidores e contaminação. Além disso, a sensibilidade e especificidade deste ensaio dependem dos genes-alvo, das sequências dos iniciadores, das técnicas utilizadas, dos procedimentos de extração do DNA e dos métodos de detecção do produto amplificado. Contudo, nosso grupo de investigação padronizou a reação em cadeia da polimerase aplicada anteriormente neste estudo.²⁴ Além disso, as amostras positivas no ensaio foram confirmadas por reação em cadeia da polimerase em tempo real, e esse método oferece várias vantagens técnicas gerais, incluindo probabilidades reduzidas de variabilidade e contaminação, bem como monitoramento on-line, e não há necessidade de análises pós-reação.

Atualmente, nossa capacidade de detectar infecções como C. trachomatis, Mycoplasma e Ureaplasma(infecções que afetam a saúde das populações mais vulneráveis: recém-nascidos e mulheres grávidas) nos permitirá identificar a alta frequência por meio da qual esses micro-organismos produzem rupturas de membranas, nascimentos prematuros e doenças neonatais que podem se tornar graves, e até mesmo fatais.⁶ Portanto, acreditamos que no futuro será necessário reavaliar as políticas públicas de atendimento pré-natal.

Nesta série, cinco de 14 casos receberam tratamento antimicrobiano empírico. O esquema antibiótico administrado em dois dos recém-nascidos que vieram a óbito com infecções sistêmicas por C. trachomatis (casos 1 e 3) consistiu de aminoglicosídeos e beta-lactâmicos, tratamento normalmente utilizado quando há suspeita de infecção congênita, pois ele abrange quase todas as possibilidades etiológicas de infecção neonatal adquirida in utero.²⁶ Contudo, os gêneros Chlamydia e Mycoplasmanão estão incluídos em seu espectro antimicrobiano.²⁷ A profilaxia ocular pode não conseguir prevenir conjuntivite neonatal por clamídia, assim como não impede colonização ou infecção nos pulmões; o único meio de prevenir infecção por clamídia em recém-nascidos é o tratamento das mães infectadas.

O caso 1 não apresentou desenvolvimento de bactérias ou fungos nas culturas realizadas, e o caso 2 foi classificado como contaminado, pois a amostra do fluido cerebrospinal foi obtida após o óbito, e desenvolveu as espécies polimicrobianas Providencia rettgeri e Enterobacter gergoviae, que não são conhecidas como produtoras de infecções neonatais. O caso 3 foi uma cesariana com seis dias de ruptura prematura das membranas e corioamnionite materna. No nascimento, foi obtida uma amostra de sangue do cordão umbilical, que mostrou o desenvolvimento da bactéria Staphylococcus haemolyticus. Essa bactéria faz parte da flora cutânea e não é um patógeno que produz infecções neonatais congênitas.²⁸ Além disso, o tratamento com ampicilina e amicacina não abrange Staphylococcus haemolyticus, sendo caracteristicamente multirresistente. Essas premissas dão base à nossa conclusão de que essas amostram foram contaminadas.

Os sorotipos da C. trachomatis com capacidade invasiva elevada podem infestar diversos tecidos de indivíduos adultos e causar linfogranuloma (L1, L2, L2a e L3). Neste estudo, mostramos que a infecção por C. trachomatis, no caso 1, ocorreu em virtude do genótipo D, que é um dos sorotipos com prevalência mais elevada em todo o mundo nas infecções do trato geniturinário da população sexualmente ativa.²⁷ O genótipo D é um dos poucos sorotipos de C. trachomatis com uma citotoxina que possui grande homologia com a família de citotoxinas amplas (LCTs) produzidas por Clostridium difficile. Essas LCTs causam diversos efeitos citopáticos nas células hospedeiras, pois sua atividade de glicosiltransferase modifica as moléculas reguladoras intracelulares, como a de ligação ao GTP da superfamília Ras.²⁹ Adicionalmente, as LCTs, de maneira geral, interferem na organização e na dinâmica da actina no citoesqueleto e no tráfego intracelular.³⁰ O efeito citopático produzido pela citotoxina do sorotipo D de C. trachomatis resulta no arredondamento das células infectadas devido à despolimerização da actina. Isso pode ajudar a explicar, em parte, a capacidade de o sorotipo D infectar e disseminar vários órgãos nesses recém-nascidos nos quais foi encontrado DNA de clamídia. Contudo, os mecanismos pelos quais a infecção por C. trachomatis é disseminada em diferentes órgãos ainda devem ser identificados.

Este estudo apresenta a possibilidade de infecção por C. trachomatis em vários órgãos de fetos e recém-nascidos, o que pode estar associado à mortalidade infantil. Contudo, são necessários estudos adicionais para confirmar esse achado.

O achado de DNA de clamídia em mais de um órgão de autópsia pode não ser a forma mais aceita para diagnosticar infecção sistêmica ou estabelecer a causa de óbito. Contudo, em nossa opinião, a descoberta de três sequências diferentes do DNA de C. trachomatis por meio de reação em cadeia da polimerase convencional e em tempo real e a identificação em um caso do genótipo C. trachomatisenvolvido fornecem uma comprovação suficiente para investigações futuras utilizando melhores recursos adicionais. A imuno-histoquímica fortaleceria a comprovação apresentada neste estudo, porém, infelizmente não pudemos realizar imuno-histoquímica em nossas amostras.