Superexpressão de CDC7 em tumores malignos de glândulas salivares correlaciona-se com a diferenciação dos tumores

Superexpressão de CDC7 em tumores malignos de glândulas salivares correlaciona-se com a diferenciação dos tumores

Autores:

Zohreh Jaafari-Ashkavandi,
Mohammad Javad Ashraf,
Ali Asghar Abbaspoorfard

ARTIGO ORIGINAL

Brazilian Journal of Otorhinolaryngology

versão impressa ISSN 1808-8694versão On-line ISSN 1808-8686

Braz. j. otorhinolaryngol. vol.85 no.2 São Paulo mar./abr. 2019 Epub 29-Abr-2019

http://dx.doi.org/10.1016/j.bjorl.2017.11.004

Introdução

Os tumores de glândulas salivares (TGS) são tumores relativamente raros e diversos que representam 3% a 6% de todas as neoplasias de cabeça e pescoço.1 Esses tumores consistem em diferentes subtipos benignos e malignos com um amplo espectro histopatológico que podem se sobrepor uns aos outros; no entanto, com um comportamento e tratamento clínico diferentes, o adenoma pleomórfico (AP), o carcinoma mucoepidermoide (CME) e o carcinoma adenoide cístico (CAC) são os TGS benignos e malignos mais comuns. A cirurgia é a principal forma de tratamento e nos tumores malignos a quimiorradioterapia adjuvante pode ser necessária. Hoje, há muita expectativa em encontrar novos tratamentos anticâncer com base na terapia com alvos moleculares. As principais moléculas que participam do crescimento e da divisão celulares são candidatas promissoras para esse objetivo. Elas podem afetar uma ampla variedade de vários tipos de tumores com alta taxa de proliferação.2

A proteína Cell Division Cycle-7 (CDC7) é uma serina-treonina quinase, originalmente relatada na levedura em brotamento, desempenha um papel fundamental na reprodução do DNA, principalmente através da ativação do complexo MCM e regulação do ponto de verificação da fase S no ciclo celular.3,4 A subunidade regulatória de CDC7 é Dbf4/ativador das fases S.5 A superexpressão de CDC7 também foi correlacionada com a inativação de P535 e foi encontrada em muitas linhagens e tecidos de células tumorais humanas, inclusive câncer de mama, cólon e pulmão, melanoma e carcinoma de células escamosas orais (CCEO); entretanto, essa proteína tem expressão muito baixa ou indetectável em tecidos normais.2,5-10

Tem sido demonstrado que a superexpressão de CDC7 foi correlacionada com um prognóstico ruim em pacientes com linfoma de células B.11 Além disso, contribui para a resistência aos agentes prejudiciais ao DNA e para o aumento da sobrevivência da linhagem celular do CCEO.9 A CDC7 tem sido um marcador terapêutico no carcinoma de ovário.12 Portanto, a CDC7 é um potencial e promissor candidato a marcador da inibição do crescimento celular, porque indica a reprodução do DNA antes de ela começar.4,6,13 Dessa forma, sugere-se a avaliação da função da CDC7 em qualquer tumor específico. Que seja de nosso conhecimento, não há pesquisas focadas na expressão de CDC7 e sua importância nos TGS. Este estudo teve como objetivo avaliar a taxa de expressão de CDC7 e sua correlação com os parâmetros clínico-patológicos dos TGS benignos e malignos mais comuns.

Método

Amostras de tecido

Neste estudo retrospectivo transversal, foram incluídas amostras de 46 pacientes que consistiram de 14 AP, 15 CAC, 12 CME e cinco glândulas salivares normais (GSN). Os casos foram obtidos do arquivo do Departamento de Patologia de 2009 a 2014. Todos os casos apresentavam diagnóstico definido e tecido epitelial adequado. Foram excluídos os casos com inflamação grave. Os dados gerais, inclusive a idade e o sexo do paciente, bem como o local do tumor, tamanho, grau e estadiamento, foram obtidos a partir das fichas médicas dos pacientes.

Imunohistoquímica

Foram obtidas seções de tecido de 4 µm a partir de blocos fixados em formalina e embebidos em parafina. Após desparafinização e reidratação, a recuperação do antígeno foi feita com tampão Tris em PH = 8 a 121 °C durante 20 minutos. A atividade endógena da peroxidase foi bloqueada com peróxido de hidrogênio a 3% durante 30 minutos. Em seguida, as seções foram incubadas com anticorpo primário (anticorpo policlonal anti-CDC7, 1:50, Genetex Company, EUA) por 60 minutos. O sistema Envision foi introduzido como anticorpo secundário e a amostra foi lavada em PBS. A solução cromogênica usada foi 3,3' diaminobenzidina tetra-hidrocloreto (DAB). Finalmente, as lâminas foram coradas com hematoxilina de Mayer. Uma seção de nódulo linfático normal foi usada como controle positivo e a mesma seção, omitiu-se o anticorpo primário, como controle negativo.

Os tecidos corados foram avaliados por microscopia ótica e as células com núcleos marrons foram consideradas positivas. Em cada caso, pelo menos 1000 células foram contadas em três campos microscópicos e a porcentagem de células positivas foi anotada. A intensidade da coloração foi avaliada e marcada como 1-leve ou 2-moderada/severa, em comparação com o controle positivo. A média da expressão de CDC7 foi classificada como: 1) células positivas < 5%, 2) 5% -10% e 3) > 10%. O escore final foi obtido com a multiplicação da intensidade e do escore percentual. Os dados foram analisados ??pelos testes de Kruskal-Wallis, Tukey e Dunn e correlação de Spearman. Um valor de p < 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

Os pacientes constituíam-se de 18 do sexo masculino e 28 do feminino com média de 49,4 ± 15. Os dados gerais relacionados a todos os grupos do estudo são mostrados na tabela 1.

Tabela 1 Informações gerais de todos os grupos de estudo 

Grupo (n) AP (14) CME (12) CAC (15) GSN (5) Total (46)
Idade 39,4 ± 14 60,6 ± 12 49,7 ± 12 49 ± 14 49,4 ± 15,1
(M/F) 5/9 7/5 4/11 2/3 18/28
Local (Maior/Menor) 11/2 10/2 6/8 1/4 28/16
Grau (1, 2, 3) - 3, 0, 8 5, 10, 0 - 8, 10, 8
Estágio (1, 2, 3, 4) - 1, 3, 2, 5 1, 3, 4, 5 - 2, 6, 6, 10
Tamanho (1, 2, 3, 4) - 1, 5, 2, 3 1, 4, 3, 5 - 2, 9, 5, 8

AP, adenoma pleomórfico; CAC, carcinoma adenoide cístico; CME, carcinoma mucoepidermoide; GSN, glândulas salivares normais.Os dados clínicos de alguns casos não estavam disponíveis.

Nas GSN, dois espécimes exibiram uma coloração nuclear limitada a células acinares e ductais, com intensidade fraca a moderada. Quase todos os tumores, exceto um CME, mostraram expressão nuclear positiva de CDC7.

Os AP apresentaram expressão de CDC7 nas células epiteliais e ductais (fig. 1 A-B), uma média de 2,3 ± 1,2 e 71% dos casos mostraram coloração fraca.

Figura 1 Expressão nuclear fraca de CDC7 no adenoma pleomórfico (A, × 200 e B, × 400). 

As células epidermoides dos CME mostraram coloração com a CDC7 (fig. 2 A-B) e a maioria dos casos (74%) apresentou expressão moderada/severa com média de 32,1 ± 14,3. As células mucosas e claras não apresentaram coloração. Todos os casos de CAC exibiram expressão de CDC7 moderada/severa com uma média de 9,7 ± 3 (fig. 3 A-B).

Figura 2 Expressão grave de CDC7 em células epidermoides de carcinoma mucoepidermoide de alto grau (A, × 200; B, × 400). 

Figura 3 Expressão nuclear grave de CDC7 no carcinoma adenoide cístico (A, × 200; B, × 400). 

Os detalhes sobre a expressão média de CDC7, intensidade de coloração e escore final são mostrados na tabela 2. O teste de Kruskal-Wallis mostrou diferença significante entre os grupos na expressão de CDC7 (p = 0,000). O teste de Dunn mostrou significância entre o AP e o CME, bem como entre o AP e CAC (p = 0,000 e p = 0,004). No entanto, não houve diferença significante entre os grupos CME e CAC. Além disso, os escores finais dos grupos foram significantemente diferentes, de acordo com o teste de Kruskal-Wallis (p = 0,000).

Tabela 2 Escores de intensidade e expressão média de CDC7 em todos os grupos de estudo 

AP CME CAC GSN
Escore médio de CDC7
1 5 0 0 2
2 9 1 7 0
3 0 10 7 0
Escore de intensidade
1 10 (71,4) 2 (18,2) 0 0
2 4 (28,6) 9 (81,8) 15 (100) 2 (100)

AP, adenoma pleomórfico; CAC, carcinoma adenoide cístico; CME, carcinoma mucoepidermoide; GSN, glândulas salivares normais.

O AP apresentou escores significantemente menores da média de CDC7, em comparação com CME e também com grupos de CAC, com o teste de Dunn (p = 0,000 e p = 0,02, respectivamente). No entanto, os grupos CME e CAC foram estatisticamente semelhantes (teste de Dunn, p = 0,26).

Os escores finais também foram diferentes entre os grupos de acordo com os resultados do teste de Kruskal-Wallis (p = 0,000) (tabela 3). O teste de Dunn mostrou que os escores finais do grupo AP foram significantemente menores do que nos dois tumores malignos (p = 0,000); no entanto, os grupos CME e CAC não apresentaram diferenças (p = 1).

Tabela 3 Escore final de todos os grupos de estudo (Intensidade × escore médio) 

Escores 1 2 3 4 6
CME 1 0 2 0 9
CAC 0 0 1 5 7
AP 0 7 0 2 0
GSN 0 2 0 0 0
Total 1 9 3 7 16

AP, adenoma pleomórfico; CAC, carcinoma adenoide cístico; CME, carcinoma mucoepidermoide; GSN, glândulas salivares normais.

Os tumores de alto grau apresentaram aumento significante da expressão de CDC7 em comparação com os graus baixos e intermediários. O teste de correlação de Spearman mostrou que a expressão de CDC7 foi correlacionada com os graus dos tumores (p = 0,000), mas não com estágio tumoral ou idade e gênero do paciente (p > 0,05).

Discussão

No presente estudo, descrevemos a expressão de CDC7 em AP, CME e CAC e também sua superexpressão em TGS malignos em comparação com glândulas normais e benignas. Vários estudos anteriores já revelaram que a CDC7 tem um papel básico na proliferação celular, tumorigênese e progressão maligna,6 ao ativar a reprodução do DNA.5,8 Nossos achados apoiam estudos prévios feitos em várias linhagens celulares e tecidos de câncer humano. Melling et al. demonstraram a superexpressão da proteína CDC7 em câncer colorretal em associação com a superexpressão de P53 e como marcador prognóstico favorável.2 Bonte et al. também mostraram que a CDC7 é muito baixa ou indetectável no tecido normal, mas apresenta superexpressão nas linhagens celulares humanas de câncer de mama, cólon e de pulmão.5 Um estudo mostrou aumento do nível de RNA de CDC7 na linhagem celular de câncer de mama com transformação maligna e também em células hiperproliferantes em menor grau em comparação com células primárias normais.6 O aumento da expressão de CDC7 tem sido um marcador de CCEO e contribuiu para a resistência ao material prejudicial ao DNA.9 A CDC7 e a subunidade bf4 formam um complexo que atua como uma proteína quinase ativa em todos os organismos.14 O alvo principal dessa atividade complexa é o complexo MCM. As células MCM positivas fortes indicam uma atividade alta de CDC7.11 A MCM2-7 foi considerada como fator de iniciação de reprodução e como um novo biomarcador diagnóstico e prognóstico para vários tipos de câncer humano. A expressão de MCM foi relatada nos tumores que apresentaram superexpressão de CDC7, como o CCEO, linhagem celular e tecido de câncer de mama e também TGS.15-18 A MCM2 e a MCM3 representaram uma superexpressão em TGS malignos em comparação com os benignos,17,18 os quais indiretamente apoiam a superexpressão de CDC7 em nossas amostras.

Também foi demonstrado que a superexpressão de CDC7 estava correlacionada com a mutação do gene TP53. A inibição da CDC7 pode induzir a morte celular através de uma via dependente do P53.19 Bonte et al. encontraram uma correlação entre a perda de P53 e a superexpressão de CDC7 em algumas linhagens de células cancerígenas.5 Além disso, em outro estudo, a expressão de CDC7 foi relacionada à positividade para P53 no câncer colorretal.2 A CDC7 foi um alvo terapêutico para câncer de mama com P53 mutante.6 Estudos anteriores sobre TGS apresentaram maior expressão de P53 em TGS malignos em comparação com AP, o que indiretamente apoia nossos achados.20

O presente estudo mostrou uma correlação positiva entre a expressão de CDC7 e graus tumorais. No entanto, nossos dados não mostraram diferença significante entre CAC e CME na expressão de CDC7. Embora o CAC seja um tumor de grau alto com comportamento mais agressivo em comparação com o CME, em nossas amostras a maioria dos espécimes de CME era de tumores de alto grau. Em concordância com nossos resultados, o aumento da expressão de CDC7 foi associado à perda de diferenciação de tumores, instabilidade genômica e desenvolvimento de fenótipo agressivo no câncer de mama.6 Além disso, os cânceres colorretais e de ovário de grau alto apresentaram maior expressão de CDC7.2,12 Essa associação da expressão de CDC7 com a diferenciação torna essa proteína um alvo potencial adequado para abordagens terapêuticas e prognósticas. No entanto, em contraste com essas pesquisas, nossos casos, limitados aos que apresentavam dados completos sobre o estágio clínico, não apresentaram correlação significante com a expressão da proteína.

O presente estudo revelou a coloração nuclear de CDC7 em todos os espécimes positivos, o que reforça a função da CDC7 na reprodução do DNA. Estudos anteriores demonstraram acumulação proteica nos núcleos celulares durante a fase G1.21

Conclusão

Os presentes achados demonstraram expressão de CDC7 nos TGS benignos e malignos mais comuns e superexpressão nos malignos. A correlação positiva dessa proteína com a diferenciação tumoral demonstra que ela pode atuar como um potencial marcador prognóstico e terapêutico.

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