Treinamento físico reverte alterações no diâmetro de mitocôndrias hepáticas de ratos diabéticos induzidos pela Aloxana

Autores:

Gabriel Keine Kuga,

Rafael Calais Gaspar,

Vitor Rosetto Muñoz,

Susana Castelo Branco Ramos Nakandakari,

Leonardo Breda,

Bruna Marina Sandoval,

Flávio Henrique Caetano,

José Alexandre Curiacos de Almeida Leme,

José Rodrigo Pauli,

Ricardo José Gomes

ARTIGO ORIGINAL

Einstein (São Paulo)

versão impressa ISSN 1679-4508versão On-line ISSN 2317-6385

Einstein (São Paulo) vol.16 no.3 São Paulo 2018 Epub 06-Ago-2018

http://dx.doi.org/10.1590/s1679-45082018ao4353

INTRODUÇÃO

O diabetes mellitus (DM) é uma doença caracterizada pela secreção ou ação insuficiente da insulina, classificada em dois tipos principais – os tipos 1 e 2. O DM tipo 1 (dependente de insulina) está relacionado à deficiência de insulina devido a mecanismos que reduzem sua concentração sérica. Já o DM tipo 2 (não dependente de insulina) caracteriza-se pela resistência à insulina (quando tal hormônio não age corretamente), mesmo em alta concentração sérica.^¹

A insulina é um hormônio anabólico polipeptídico com importante papel no metabolismo de proteínas, carboidratos e lipídeos. Em casos de deficiência de insulina ou sua ação ineficiente, há um comprometimento na captação de glicose e aminoácidos, levando à hiperglicemia pelo aumento de gliconeogênese, lipólise e degeneração de diversos tecidos − especialmente o renal, o cardiovascular, o ósseo e o hepático.^¹,² No fígado, o DM reduz o armazenamento de glicogênio, altera secreção de diversos hormônios como o fator de crescimento semelhante à insulina (IGF) e induz alterações morfológicas.^³-⁵ Além disso, quando não há controle metabólico adequado, o DM provoca esteatose hepática devido à acumulação de lipídeos no fígado.^⁵,⁶

Por outro lado, o exercício físico é um componente essencial do tratamento de DM tipos 1 e 2, por incluir diversos parâmetros metabólicos, como glicogênio muscular durante a atividade física, contribuição lipídica para o metabolismo energético, número e tamanho de mitocôndrias musculares, sensibilidade à insulina e importantes enzimas responsáveis pela mobilização e oxidação de lipídeos.^⁷-⁹ Ainda, o exercício físico contribui para a captação de glicose e aminoácidos periféricos, ajuda na preservação do armazenamento de glicogênio muscular, e reduz o catabolismo proteico típico do DM tipo 1.^{²,¹⁰,¹¹}

A Aloxana é uma droga muito usada em modelos experimentais na indução de DM tipo 1, por destruir as células beta-pancreáticas, causando alterações na homeostase glicêmica dos animais (por exemplo, hiperglicemia, redução de glicogênio hepático e redução de insulina circulante).^{³,⁵,¹²,¹³} Além disso, a indução de DM pela Aloxana oferece um cenário experimental para a investigação dos efeitos do exercício físico como intervenção terapêutica para esta doença.^{³,⁵,¹²,¹³}

OBJETIVO

Investigar os efeitos de um protocolo de exercício físico nos aspectos metabólicos e ultraestruturais do tecido hepático de animais diabéticos experimentais.

MÉTODOS

Animais experimentais

Foram utilizados ratos machos Wistar com 70 dias de idade. Os animais foram mantidos em ambiente a 25°C, com ciclo claro/escuro de 12 horas, e receberam ração Purina para roedores e água ad libitum. Diabetes mellitus for induzido por meio de injeção intravenosa de Aloxana monoidratada (35mg.kg^-1 peso corporal; Sigma^®).^{⁴,¹²,¹⁴} Após 5 dias, amostras sanguíneas foram obtidas dos ratos alimentados, para determinar a concentração plasmática de glicose. Os ratos que não apresentavam diabetes (glicose <14,7mmolL^-1) ou que apresentam diabetes grave (glicose >35,5mmolL^-1) foram excluídos do estudo.^¹² Este procedimento foi feito de acordo com o Comitê de Ética em Pesquisa com Animais da Universidade de Campinas (processo 4513-1/2017). Para o experimento, os ratos foram divididos aleatoriamente nos seguintes grupos, cada um com dez animais: Controle Sedentário (CS), Controle Treinado (CT), Diabético Sedentário (DS) e Diabético Treinado (DT). O número de animais utilizados para a análise está demonstrado na legenda das figuras.

Protocolo de exercício físico

O protocolo de exercício físico consistiu em natação durante 60 minutos por dia, 5 vezes por semana, durante 6 semanas consecutivas. Após um período de adaptação ao ambiente aquático de 5 dias, cargas com peso equivalente a 2,5% do peso corporal foram afixadas ao peitoral dos animais. Todas as sessões de natação começaram às 8h e foram realizadas em um tanque (100cm x 70cm x 60cm), com água a 31°C±1°C, e profundidade de 40cm.

Eutanásia e perfil bioquímico sanguíneo

Ao final do período experimental, todos os ratos ficaram em repouso durante 48 horas após a última sessão de exercícios, sem jejum prévio. Após a eutanásia, amostras sanguíneas foram coletadas em tubos de vidro sem anticoagulantes, para avaliação de diversos parâmetros. Todas amostras sanguíneas foram centrifugadas a 3.000rpm durante 10 minutos e foram feitas as seguintes análises a partir das amostras séricas: glicose sérica pelo método enzimático colorimétrico,^¹⁵ insulinemia (radioimunoensaio, kit Coat-A-Count, Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, Estados Unidos), e proteína total sérica e albumina.^¹⁶

A laparotomia foi feita para extrair fragmentos do fígado, para medição de glicogênio, proteína total e DNA. Foram feitos os seguintes protocolos: o conteúdo de glicogênio foi obtido de acordo com o método descrito por Dubois et al.,^¹⁷ o teor de proteína total, pelo método de Lowry et al.,^¹⁸ e o DNA, conforme Giles et al.,^¹⁹ Também foi avaliada a proporção proteína/DNA, para medir o metabolismo proteico no fígado.

Rotina para microscopia eletrônica

Fragmentos do lobo esquerdo do fígado (de três animais por grupo) foram fixados em Karnovsky modificado por 3 horas e, então, colocados em 5mL de glutaraldeído 50% e 95mL de tampão fosfato 0,1M. O tratamento das amostras para este procedimento foi previamente descrito^⁴ e adaptado do método de Reynolds.^²⁰ As amostras foram analisadas e fotografadas no microscópio eletrônico de transmissão Philips CM10. O diâmetro mitocondrial foi medido utilizando-se o programa AUTOCAD^®.

Análise estatística

Todos os resultados foram expressos como média±desvio padrão e analisados utilizando-se a análise de variância (ANOVA), com o teste post hoc de Bonferroni. O nível de significância foi estabelecido em 5%.

RESULTADOS

A tabela 1 mostra a evolução do peso corporal em todos os grupos. Após a quarta semana do período experimental, o Grupo DS apresentou peso corporal menor do que o Grupo CS. Ao final do treinamento físico, o Grupo CT apresentou peso corporal mais alto do que o Grupo DS. Estes dados indicam que o DM induziu a perda de peso corporal.

Tabela 1 Evolução do peso corporal de ratos em todos os grupos durante o período experimental (6 semanas)

Parâmetro	Grupos	Semana 1	Semana 2	Semana 3	Semana 4	Semana 5	Semana 6
Peso corporal (g)	CS	298±30	322±41	324±53	351±29	364±69	379±55
	CT	290±32	305±55	316±55	316±33	337±55	352±43
	DS	256±38	264±47	274±47	280±61*	275±65*	277±49*^†
	DT	250±39	290±32	301±56	309±54	316±58	327±54

Resultados expressos como média±desvio padrão. * p<0,05 versus Grupo CS; ^† p<0,05 versus Grupo CT.

CS: Controle Sedentário; CT: Controle Treinado; DS: Diabético Sedentário; DT: Diabético Treinado.

Avaliamos se DM e treinamento físico modulavam os parâmetros séricos dos animais. Os animais diabéticos apresentaram níveis mais altos de glicose e níveis mais baixos de insulina, confirmando o estado patológico. Não foram encontradas diferenças entre os Grupos Controle nem entre os Grupos Treinados para estes parâmetros (glicose e insulina). Todos os grupos apresentaram níveis similares em relação aos níveis séricos de proteína total e albumina (Tabela 2).

Tabela 2 Parâmetros séricos de ratos em todos os grupos após período experimental de 6 semanas

Parâmetros séricos	CS	CT	DS	DT
Glicose, mg/dL	117±13	121±15	439±99*^†	413±91*^†
Insulina, mUI/mL	15,2±2,9	16,3±3,4	11,8±2,1*^†	11,5±2,9*^†
Proteína total, g/100mL	6,58±0,53	6,36±0,36	6,48±0,72	6,34±0,39
Albumina, g/100mL	4,63±0,93	4,39±0,8	4,21±0,8	4,32±1

Resultados expressos como média±desvio padrão. ^* p<0,05 versus Grupo CS; ^† p<0,05 versus Grupo CT.

CS: Controle Sedentário; CT: Controle Treinado; DS: Diabético Sedentário; DT: Diabético Treinado.

Também foram analisados os parâmetros hepáticos (Tabela 3). O Grupo DS demonstrou teor mais baixo de glicogênio do que os outros grupos, confirmado o estado catabólico dos animais diabéticos. Não foram encontradas diferenças entre os grupos para proteína total e DNA. No entanto, o Grupo CT apresentou a razão proteína/DNA mais alta do que o CS.

Tabela 3 Parâmetros hepáticos de ratos em todos os grupos após período experimental de 6 semanas

Parâmetros hepáticos	CS	CT	DS	DT
Glicogênio, mg%	5,2±1,2	6,2±1	2±0,5*^†‡	5±1,8
Proteína total, mg%	2,2±0,38	2,8±0,62	3±0,77	3±1,1
DNA, mg%	0,18±0,01	0,14±0,04	0,18±0,04	0,18±0,03
Proteína/DNA	12±2,8	20±6,4*	17±3,5	17±5,9

Resultados expressos como média±desvio padrão. ^* p<0,05 versus Grupo CS; ^† p<0,05 versus Grupo CT; ^‡ p<0,05 versus Grupo DT.

CS: Controle Sedentário; CT: Controle Treinado; DS: Diabético Sedentário; DT: Diabético Treinado.

A figura 1 destaca a ultraestrutura do tecido hepático do Grupo CS, expondo o fígado destes animais com características estruturais normais, como as cristas mitocondriais, o retículo endoplasmático rugoso e liso, os peroxissomos, a baixa quantidade de lipídeos e o envoltório nuclear aparentemente normal. O Grupo CT apresentou características estruturais semelhantes às do Grupo CS, mas foi encontrado um número aparentemente mais alto de peroxissomos em volta da mitocôndria (Figura 2).

(A) Micrografia representativa do tecido hepático de rato do Grupo Controle Sedentário. Esta micrografia mostra a abundância de mitocôndrias (m) ao redor do núcleo (N) e entre o retículo endoplasmático liso (rl). Observe certa abundância de poros nucleares (seta) (10.250x). (B) Micrografia representativa do tecido hepático de rato do Grupo Controle Treinado. Esta micrografia mostra a abundância de peroxissomos (P) entre as mitocôndrias (m) e o retículo endoplasmático liso (rl). Também é visível a presença de material com aspectos lipídicos (L), porém sem a delimitação característica de gotículas típicas (14.500x).

Figura 1 Ultraestrutura do tecido hepático do Grupo Controle Sedentário

(A) Micrografia representativa do tecido hepático de rato do Grupo Diabético Sedentário. Destaca-se a aparência alterada do núcleo (N) e grandes gotículas lipídicas (L). Além disso, notamos a presença de irregularidades na membrana interna (o) do envoltório nuclear, bem como a presença de retículo endoplasmático liso ao redor do núcleo, e retículo endoplasmático rugoso em menor quantidade (14.500x). (B) Micrografia representativa do tecido hepático de rato do Grupo Diabético Treinado. Retículo endoplasmático liso vacuolado (rl) localizado entre as mitocôndrias (m). É notável também a presença de glicogênio (g) e figuras mielínicas (f) (21.000x).

Figura 2 Características estruturais do Grupo Controle Treinado

Foram encontradas alterações estruturais no Grupo DS, como a ocorrência de ondulações na membrana interna do envoltório nuclear. Além disso, os hepatócitos apresentaram mais retículos endoplasmáticos, maior quantidade de gotículas lipídicas e cristas mitocondriais ocultas.

Assim como o Grupo DS, o Grupo DT apresentou as mesmas alterações estruturais, confirmando os efeitos do DM. Porém, foi observada quantidade aparentemente maior de glicogênio ao redor das mitocôndrias no Grupo DT, o que sugeriu efeito do exercício físico nesta característica.

Finalmente, a figura 3 mostra o diâmetro mitocondrial dos grupos estudados. A análise estatística revelou aumento significativo (p>0,05) do diâmetro mitocondrial nos Grupos Diabéticos (DS e DT) em comparação aos controle (CS e CT). O Grupo DT apresentou redução do diâmetro mitocondrial comparado ao DS, sugerindo efeitos do exercício físico. As figuras 4A e 4B ilustram as alterações mitocondriais entre os Grupos Sedentários (CS e DS) pela técnica ultraestrutural.

Resultados expressos como média±desvio padrão. ^a p<0,05 versus Grupo CS; ^b p<0,05 versus Grupo CT; ^d p<0,05 versus Grupo DT.

Figura 3 Diâmetro mitocondrial (mm×10-3) de ratos dos Grupos Controle Sedentário (CS), Controle Treinado (CT), Diabético Sedentário (DS) e Diabético Treinado (DT) após o período experimental (6 semanas; n=10 ratos por grupo)

(A) Micrográfico representativo do tecido hepático de rato do Grupo Controle Sedentário. Observa-se grande quantidade de retículos endoplasmáticos rugosos (rr), além de peroxissomos (P) e mitocôndrias (m) (41,000x). (B) Micrográfico representativo do tecido hepático de rato do Grupo Diabético Sedentário. Nota-se a presença de grandes vesículas de retículo liso (rl), alguns ribossomos (r), figuras mielínicas e mitocôndrias com largos diâmetros (41.000x).

Figura 4 Mitocôndrias dos Grupos Sedentários

DISCUSSÃO

O exercício físico é um componente essencial do tratamento de DM e seus respectivos deficits metabólicos. No presente estudo, os resultados obtidos para o Grupo DS estão de acordo com o que clinicamente esperado no contexto do DM, que inclui ganho de peso reduzido, hipoinsulinemia e hiperglicemia.^¹ Essa condição é consequência da disfunção das células beta das Ilhotas de Langerhans devido à administração de Aloxana.

O protocolo de exercício físico aplicado não reduziu a glicose sérica dos animais diabéticos. Há estudos prévios que demonstram melhor reação das células musculares e adiposas à insulina após o exercício físico, devido ao aumento do teor de transportadores de glicose (GLUT-4) e sua translocação para a membrana.^⁹ Após o exercício físico, observamos melhoras nos passos iniciais da via de sinalização da insulina, começando com o aumento na associação entre o substrato do receptor de insulina (SRI-1) e a fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K),^⁷,²¹ o que leva a uma melhor sensibilidade à insulina. Ademais, a contração muscular mobiliza o GLUT-4 em uma via independente da ação da insulina, contribuindo para maior captação de glicose.^²² Porém, em nosso estudo, o treinamento físico não apresentou efeito na glicose sérica dos animais diabéticos, talvez devido à duração do treinamento.

Não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos para proteína total sérica e albumina, sugerindo que os animais diabéticos não apresentam níveis de desidratação que poderiam interferir em outros resultados. Sabe-se que uma consequência do DM é aumento da pressão osmótica de fluídos extracelulares, o que leva à transferência de fluidos, que, por sua vez, pode causar desidratação.^² A hiperglicemia também leva à perda de glicose via urina e diurese osmótica, resultando na depleção de fluidos orgânicos. A proteinúria diabética está relacionada ao aumento de filtração glomerular de proteínas e diminui a reabsorção tubular, considerando-se que estes fatores são influenciados pelo grau de controle metabólico do diabético.^²³,²⁴ Apesar da hiperglicemia, nossos resultados indicam que não houve um nível de desidratação que pudesse interferir em resultados bioquímicos e morfológicos.

No presente estudo, não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos para medidas de proteína total e DNA. Porém, houve aumento significativo na razão proteína/DNA do tecido hepático no Grupo CT, sugerindo que o protocolo de treinamento físico favoreceu a redução do catabolismo de proteínas hepáticas.^⁴ No entanto, o Grupo DS apresentou redução no armazenamento de glicogênio hepático em comparação aos Grupos Controles. Isso é corroborado por resultados prévios encontrados na literatura.^¹⁰,¹² Confirmando o efeito terapêutico do exercício físico no diabetes, encontramos armazenamento restaurado de glicogênio hepático no Grupo DT em comparação ao Grupo DS. Estudo conduzido por Leme et al.,^³ também demonstrou aumento no glicogênio hepático em animais diabéticos submetidos a protocolo de exercício físico em comparação aos sedentários. Em nosso trabalho, o protocolo de treinamento físico foi eficiente na restauração do armazenamento de glicogênio hepático nos animais diabéticos e no aumento da razão proteína/DNA no fígado.

As análises ultraestruturais do fígado revelaram as alterações estruturais promovidas pelo DM, com destaque para aumento no diâmetro mitocondrial. Nossos resultados corroboram os achados de Kozyritskiĭ et al.,^²⁵ que relataram aumento no número de mitocôndrias, redução de retículo endoplasmático rugoso e proliferação do retículo endoplasmático liso. Além disso, há o aparecimento de corpos similares aos lisossomos e vacúolos autofágicos no citoplasma dos hepatócitos dos ratos diabéticos. O retículo endoplasmático liso é responsável por diversas funções, dependendo do tipo de célula ao qual pertence. Nos hepatócitos, esta organela age nos lipídeos e no metabolismo do colesterol, contribuindo para o processo de desintoxicação. Sabe-se também que ribossomos livres e aderidos nas cisternas do retículo endoplasmático rugoso estão relacionados à síntese de proteínas celulares.^²⁶ Petersen^²⁷ também encontrou anormalidades mitocondriais em animais diabéticos, sugerindo que esta hiperfunção mitocondrial pode ocorrer em uma tentativa de prevenir esteatose hepática. Da mesma forma, Lucchesi et al.,^²⁸ relataram a diminuição no número de organelas intracitoplasmáticas e a degeneração de mitocôndrias, após as análises ultraestruturais dos hepatócitos de animais diabéticos. As mitocôndrias hepáticas têm papel importante na patogênese da esteatose hepática – uma comorbidade comum em pacientes diabéticos.^²⁹,³⁰

Indivíduos diabéticos frequentemente apresentam esteatose ou glicogenose. A esteatose pode progredir para fibrose e cirrose, ao contrário da glicogenose, que não evolui para estas patologias, mas que pode sinalizar a necessidade de um melhor controle glicêmico.^³¹ O acúmulo de lipídeos em células hepáticas pode levar à esteatose, com subsequente evolução para cirrose.^⁵ Em nosso estudo, não observamos a ocorrência de glicogenose em hepatócitos, porém encontramos grande acúmulo de lipídeos no fígado dos animais diabéticos, o que pode preceder o início da esteatose. Também observamos a ocorrência de mudanças na massa de cromatina e no envólucro nuclear de animais diabéticos. Doi et al.,^³² também encontraram ondulações nucleares, alterações na massa de cromatina e núcleo com contorno irregular em animais diabéticos. Em humanos, Schmid et al.,^³³ demonstraram que indivíduos diabéticos possuem redução na síntese de adenosina trifosfato (ATP) hepática, o que está relacionado à resistência à insulina, com possível deficiência nas concentrações de mitocôndrias hepáticas.^⁴

Com relação ao Grupo DT, a análise estatística demonstrou que o diâmetro mitocondrial neste grupo foi menor do que no Grupo DS, sugerindo que o protocolo de exercício físico utilizado pode ter contribuído para a diminuição na hiperfunção mitocondrial. Poucos estudos investigaram as mudanças estruturais no tecido hepático de sujeitos diabéticos e a influência da atividade física nessas alterações. No entanto, sabe-se que uma dieta com alto teor de gordura e a falta de exercício físico estão associadas a alterações hepáticas ultraestruturais e à prevalência de esteatose hepática.^³⁴ Além disso, Lima et al.,^³⁵ verificaram que o exercício físico crônico promoveu melhoras no aparato antioxidante e redução no estresse oxidativo nas mitocôndrias hepáticas, exercendo efeito protetor.

Em humanos, a patogênese do DM está relacionada à deficiência de células beta-pancreáticas.^³⁶,³⁷ No presente estudo, embora o desencadeador patogênico seja diferente (indução por administração de Aloxana), é importante notar que o treinamento físico atenuou as alterações metabólicas e morfológicas causadas pelo diabetes. Nosso modelo experimental de DM foi semelhante ao DM tipo 1, que ocorre em humanos – trata-se de uma doença caracterizada pela destruição autoimune de células beta-pancreáticas secretoras de insulina.^³⁷ Embora os benefícios do exercício físico para DM tipo 1 em estudos com animais estejam bem descritos na literatura,^³⁸ recente estudo clínico relatou os efeitos protetores do exercício físico na função de linhagens de células beta humanas recém-diagnosticadas com DM tipo 1.^³⁷ Estes achados reforçam a importância do treinamento físico como intervenção não farmacológica contra o DM. Há relatos de DM tipo 1 em humanos que apresentam alterações no metabolismo hepático;^³⁹ porém, são necessárias mais pesquisas com estes pacientes, para investigar as alterações mitocondriais e o possível efeito protetor do exercício físico.

Os resultados obtidos em nosso trabalho destacam alguns aspectos relevantes. Um deles é o dano causado pelo DM aos hepatócitos, o que é evidenciado pela análise ultraestrutural do fígado, que apresentou diversas alterações, como a redução do retículo endoplasmático rugoso. Isso pode indicar baixa síntese de proteína hepática, diâmetro mitocondrial aumentado, hiperfunção mitocondrial e aumento do acúmulo de gotículas lipídicas − fatos esses que comumente associados à esteatose hepática. Outro importante achado do nosso estudo foi a influência da atividade física no fígado. Este aspecto foi evidenciado pelos seguintes fatores: o aumento da razão proteína/DNA do órgão no Grupo CT, e a restauração do glicogênio hepático e a redução do diâmetro mitocondrial no Grupo DT. Enfim, este estudo oferece evidências sobre o papel do exercício físico como estratégia terapêutica contra os danos causados ao fígado pelo DM.

CONCLUSÃO

O diabetes mellitus experimental reduziu o teor do glicogênio e aumentou o diâmetro mitocondrial no fígado. O protocolo de treinamento físico aumentou a razão proteína/DNA no tecido hepático dos Grupos Controles, e recuperou o teor do glicogênio hepático e o diâmetro mitocondrial nos Grupos Diabéticos. Portanto, o treinamento físico com a natação promoveu importantes adaptações metabólicas e morfológicas em animais diabéticos.

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