Introdução

O Brasil é o maior consumidor de agrotóxicos do mundo. Esse posto, atingido em 2008, em grande parte à custa da indústria agrícola, movimentou, entre 2010 e 2011, uma receita de US$ 8,5 bilhões e um consumo de 936 mil toneladas, o que representou 19% do mercado global de agrotóxicos nesse período ^1,2. Os principais grupos profissionais expostos aos agrotóxicos são os trabalhadores do setor agropecuário, saúde pública, firmas desinsetizadoras, transporte e comércio, indústrias de formulação e síntese e área veterinária ³. O controle de vetores urbanos é uma importante fonte de contaminação ocupacional e ambiental, utilizando os mesmos princípios ativos de agrotóxicos. Os setores público e privado atuam em diversos ambientes, sendo responsáveis pela manipulação, transporte, inutilização e descarte de embalagens ^4,5.

A exposição crônica a agrotóxicos pode acometer inúmeros sistemas. Doenças hematológicas, dermatológicas, pulmonares, neurológicas, câncer, malformações congênitas, entre outras podem estar associadas a essa exposição ³. O tremor é o distúrbio do movimento mais frequente na população em geral, sendo que o tremor essencial é uma das doenças neurológicas de maior prevalência ^6,7. Essa prevalência na população geral é estimada em torno de 0,4%, podendo variar conforme sexo e etnia, e tende a aumentar com a idade, podendo chegar a 6,3% entre indivíduos ≥ 65 anos e 21,7% entre aqueles com ≥ 95 anos ^8,9. Já a taxa de incidência foi estimada entre 23,7 e 616 por 100 mil ¹⁰. Um estudo brasileiro realizado em uma cidade do interior de Minas Gerais observou uma prevalência de 7,4% de tremor essencial em indivíduos com ≥ 64 anos ¹¹.

As conexões entre as regiões do córtex cerebral e subcortical, assim como os sistemas piramidal e extrapiramidal, são parte obrigatória para a compreensão dos mecanismos envolvidos no tremor essencial. As áreas motoras 4 e 6 de Brodmann, localizadas na região frontal do córtex cerebral, associadas, entre outras funções, à noção de posição e movimento do corpo comunicam-se com as regiões subcorticais por meio de complexos circuitos ¹². Dois dos principais circuitos são o córtico-estriado-tálamo-cortical e o circuito córtico-ponto-cerebelo-rubro-cortical ¹³. Por sua vez, o estriado é composto pelos núcleos caudado e putâmen ¹⁴. Essas e outras numerosas outras estruturas fazem parte dos núcleos da base cerebral. Esses circuitos juntamente com o triângulo de Guillain-Mollaret responderão pelas bases fisiológicas do tônus muscular, equilíbrio e coordenação motora nos seres humanos ¹². O mau funcionamento dessas estruturas irá propiciar inúmeros quadros neurológicos relacionados ao amplo espectro dos distúrbios de movimento.

Ainda que atualmente os sistemas motores possam ser classificados como lateral e medial, historicamente e de forma bastante superficial, o sistema piramidal é responsável pelos movimentos voluntários, e o extrapiramidal pelos movimentos automáticos ^13,14. Esses sistemas trabalham em conjunto, regulando inúmeras ações. O triângulo de Guillain-Mollaret é parte do segundo circuito. É um subcircuito composto pelo núcleo rubro (mesencéfalo), feixe central do tegmento, núcleo olivar inferior (ponte), núcleo denteado (cerebelo), retornando ao núcleo rubro ¹². São conexões que, dentro da estrutura anatômica, lembram um formato triangular.

Estudos em modelo animal observaram quadros de tremor postural após a estimulação do núcleo olivar inferior ¹⁵. Em indivíduos portadores de tremor essencial, foram observadas alterações histopatológicas na região cerebelar, caracterizada por perda e edema axonal das células de Purkinje (células torpedo) e no tronco cerebral, incluindo a presença de corpúsculos de Lewy ¹⁶. Essas alterações também não foram encontradas em todos os portadores da doença e, em uma parcela de pacientes, não foi observada qualquer alteração. A presença do corpúsculo de Lewy e a possibilidade de sobreposição entre o tremor essencial e a doença de Parkinson falariam a favor de uma doença degenerativa, mas ainda não há consenso sobre isso ^16,17.

Quatro dos principais neurotransmissores envolvidos nesses sistemas são o ácido gama-amino-butírico (GABA), a dopamina, a acetilcolina e o ácido glutâmico. Eles atuam no controle excitatório e inibitório desses circuitos. É possível que receptores beta-adrenérgicos também estejam envolvidos, todavia o sistema gabaérgico tem papel importante na fisiopatogenia do tremor essencial, haja vista que as principais opções para o tratamento do tremor essencial incluem medicamentos com esse mecanismo de ação ^18,19.

Os grupos químicos de agrotóxicos organoclorados, organofosforados e piretroides possuem mecanismos próprios de neurotoxicidade. Os inseticidas organoclorados alteram a eletrofisiologia da membrana neuronal e suas enzimas relacionadas com a Na+-ATPase e K+-ATPase, modificando a cinética do fluxo dos íons Na+ e K+ ^20,21. O DDT (diclorodifeniltricloroetano) atua no prolongamento da abertura dos canais de sódio. Quando esses canais estão fechados, há pouca ou nenhuma ação. Já o lindano e os ciclodienos atuam na inibição de fluxo dos canais de cloro regulados pelo GABA ^20,21. Os inseticidas organofosforados atuam primariamente na inibição da acetilcolinesterase (AChE), acumulando acetilcolina nos terminais pré-sinápticos ^20,21. O acúmulo de acetilcolina na fenda sináptica hiperestimula receptores colinérgicos do tipo muscarínico e nicotínico. Também há a inibição da butirilcolinesterase (BuChE), conhecida como falsa colinesterase, o que também contribui para a deflagração do processo ^20,21. Os piretroides ligam-se à subunidade alfa do canal de sódio e lentificam a abertura e o fechamento do canal de sódio, mantendo-o em um estado de hiperexcitabilidade constante. As diferenças no tempo de abertura dos canais de sódio é que serão a base de diferenciação entre os dois tipos de reações possíveis de ocorrer nesse grupo químico ^20,21. A reação tipo I ou síndrome T afeta os canais de sódio, causando descargas neuronais repetidas e um período maior de repolarização ^20,21. Clinicamente, caracteriza-se por agressividade, aumento da resposta aos estímulos externos, tremores generalizados ou prostração ^20,21. A reação tipo II produz maior atraso na inatividade do canal de sódio, levando à persistente despolarização da membrana, sem descargas repetitivas ^20,21. Clinicamente, caracteriza-se por hipersialorreia, tremor, coreoatetose e crises convulsivas ^20,21.

Já os biolarvicidas têm ação na produção de endotoxinas proteicas que, quando ingeridas pela larva do mosquito, provocam a sua morte ²². A benzoilureia inibe o crescimento dos insetos, impedindo a formação da quitina. Esse é um elemento essencial do exoesqueleto com função de proteção mecânica. Caso consiga eclodir, induz à malformação e à esterilidade nos insetos adultos ²³.

Estudos em modelo animal in vivo e in vitro verificaram a ação dos agrotóxicos em diversos neurotransmissores envolvidos nesses circuitos cerebrais. Há um mecanismo de autorregulação, com o objetivo de manter o seu perfeito funcionamento. Apesar de a via gabaérgica ter um papel potencial na fisiopatogenia do tremor essencial, seguramente não é o único mecanismo envolvido. O tremor essencial, assim como a doença de Parkinson, doença de Alzheimer e a esclerose lateral amiotrófica, são doenças neurológicas crônicas. A indução de doenças neurológicas e outras doenças crônicas pelos agrotóxicos tem sido aventada por meio de diversos mecanismos.

Os inseticidas organofosforados são metabolizados inicialmente pelo citocromo P-450 (CYP450) através da dessulfuração oxidativa, em que há oxidação de P = S (forma tions) para P = O (forma oxons), resultando na formação de metabólitos com maior toxicidade ^20,21. A paraoxonase-1 (PON1) é uma das principais fosfodiesterases responsáveis por hidrolizar os oxons. Outras co-enzimas do complexo CYP450 envolvidos na metabolização dos oxons são a CYP2B6, CYP2C19 e CYP3A4 ²⁴. É provável que variações genéticas dessas enzimas metabolizadoras de xenobióticos possam alterar sua atividade catalítica e aumentar a concentração de oxons, tanto no soro quanto nos tecidos alvo. A presença de polimorfismos da PON1 na região de codificação (PON1Q192R e PON1L55M) resulta em menor atividade catalítica e redução dos níveis proteicos ²⁴. A glutotiona-S-transferase (GST), a BuChE e as carboxilesterases (CEs) também possuem importante papel catalítico das oxons e, assim como a GST, polimorfismos genéticos podem influenciar nesse processo ²⁵.

A predisposição genética ao tremor essencial é um fator que tem sido estudado ao longo dos anos. A história familiar pode ser encontrada em uma prevalência com variações extremas. A presença do gene LINGO1 em diversas populações está associada a maior chance em desenvolver essa doença ²⁶. Em modelo animal, a inibição do LINGO1 promoveu a persistência de neurônios e oligodendrócitos, a regeneração axonal, a diferenciação oligodendrocitária, a remielinização e a melhora funcional dos ratos ²⁶. Independente das discussões sobre os polimorfismos do LINGO1 e da sua associação com doença familiar ou esporádica, este parece ser o gene mais associado à doença.

Está bem estabelecido o potencial neurotóxico da via colinérgica em intoxicações agudas por organofosforados. Entretanto, estudos têm apontado que alguns organofosforados podem causar neurotoxicidade, mesmo em doses baixas o suficiente para não ativarem a via colinérgica e seus metabólitos oxons ²⁴. Estudos in vitro indicam que o diazinon-oxon é capaz de reduzir o número de dendritos, enquanto o clorpirifós-oxon inibe a síntese de DNA em células germinativas de glioma e rompe a diferenciação celular glial, afetando a integridade da rede de microtúbulos ²⁴. Esse efeito foi observado em concentração nanomolar, que é muito menor do que o necessário para inibir significativamente a atividade da enzima AChE ²⁴. Por outro lado, o padrão de expressão das variações não enzimáticas da AChE tem um papel na neurotoxicidade pelos organofosforados. As isoformas mais abundantes são a AChE-S (enzima de membrana multimérica) e a isoforma monomérica solúvel “readthrough” (AChE R). A primeira teria capacidade neurotóxica e a segunda, atividade reparadora e protetora ²⁴.

A mitocôndria tem sido considerada um provável alvo no processo neurodegenerativo causado pela exposição crônica e em níveis baixos a organofosforados ^24,27. O organofosforado pode elevar a recaptação do cálcio mitocondrial que compromete a função dos complexos I e II e diminui a transferência de elétrons para o citocromo oxidase (complexo IV) ^24,27. Esse processo pode causar a peroxidação lipídica, elevar a proteína carbonil, estimular a formação de 8-hidroxideoxiguanosina e a oxidação proteica e do DNA mitocondrial. Esses eventos afetam a síntese de ATP ^24,27. Como resultado da quebra da capacidade transmembrana mitocondrial, o citocromo c é liberado pela mitocôndria para o citosol e diversas caspases são ativadas, levando ao estresse oxidativo, e, consequentemente, à morte por apoptose celular ^24,27.

Danos genéticos e modificações epigenéticas estão mais associadas ao câncer do que ao desenvolvimento de doenças neurológicas. Coletivamente, a exposição crônica a agrotóxicos em doses baixas, a metabolização pela via não colinérgica, os polimorfismos genéticos das enzimas que degradam os oxons, a predisposição genética ao tremor essencial, o comprometimento mitocondrial levando ao estresse oxidativo e a consequente apoptose celular de neurônios gabaérgicos podem contribuir para o desenvolvimento do tremor essencial.

O tremor essencial acomete mãos e antebraços, mas pode se manifestar em outras partes do corpo ^17,28. A frequência do tremor essencial varia entre 4Hz e 12Hz, e é inversamente proporcional à idade com pacientes mais velhos, exibindo frequências mais baixas ^17,28. A presença de história familiar varia conforme o estudo, podendo chegar a até 80% em alguns levantamentos. Existem diversos genes já identificados e potencialmente associados à doença ²⁶. Em 2009, a descoberta de uma variação do gene LINGO1 foi associada ao tremor essencial na Islândia. Tal associação também foi observada em populações na Áustria, na Alemanha e nos Estados Unidos ²⁶. Clinicamente, o tremor essencial tende a ter uma evolução lenta durante os anos, e algumas comorbidades podem estar associadas. Dentre elas, têm sido descritas alterações cognitivas, transtornos de humor e da marcha ¹⁶. Alguns estudos observaram que indivíduos com tremor essencial têm quatro vezes mais chance de desenvolver parkinsonismo ¹⁶. São doenças distintas com mecanismos e patologias diferenciadas, entretanto é frequente haver sobreposição dessas doenças, o que torna o seu diagnóstico e tratamento desafiadores.

A espectroscopia cerebelar por ressonância magnética (RM), a tomografia por emissão de pósitrons (PET-Scan), a ultrassonografia transcraniana, a eletroneuromiografia e o acelerômetro não foram capazes de predizer o diagnóstico do tremor essencial ^28,29. Ainda continua a ser um quadro neurológico de diagnóstico eminentemente clínico. Fatores ambientais têm sido associados ao tremor essencial. Alcaloides beta-carbolínicos (harmine e harmane) e chumbo têm sido associados à doença ^27,30. Estudos experimentais e clínicos envolvendo os inseticidas dos grupos químicos organoclorado, organofosforado e piretroide também parecem estar associados ao tremor ^{31,32,33,34,35,36}. Em agricultores norte-americanos, o Agricultural Health Study observou uma prevalência de 5% de tremor em uma população de 18.782 trabalhadores; ressalve-se que eram sinais e sintomas, e não diagnóstico de tremor essencial ³⁷. No entanto, ainda pouco se sabe sobre a relação entre a exposição a agrotóxicos e essa doença.

O objetivo deste estudo foi avaliar a associação entre exposição crônica a agrotóxicos e presença de tremor essencial entre guardas de endemias do Estado do Rio de Janeiro, Brasil.

Metodologia

Resultados

A Tabela 1 apresenta as principais características da população de casos e controles. A frequência de tremor essencial entre homens e mulheres foi de 73% e 27%, respectivamente. A idade média da população estudada foi de 49 (DP = 7) anos, sendo a diferença entre casos (média = 50,8; DP = 6,9) e controles (média = 48,5; DP = 6,9) estatisticamente significativa (p = 0,03). O tempo médio de aplicação foi de 18 (DP = 5,7) anos e o número médio de horas aplicadas foi de 36.021 (DP = 18.318). Não foi observada associação significativa entre as variáveis sociodemográficas e tremor essencial (Tabela 1).

A Tabela 2 apresenta as estimativas das OR de tremor essencial em função do número de horas aplicadas de agrotóxicos. Não foi observada diferença significativa segundo tremor essencial e o gradiente dose-resposta. Já as estimativas das OR de tremor essencial entre guardas de endemias em função da quantidade de agrotóxicos aplicada podem ser observadas na Tabela 3. A OR entre tremor essencial e o gradiente dose-resposta nos trabalhadores que aplicaram tanto organofosforado em bombas quanto na forma granulada (temefós) também não foi significativa. Outro grupo químico largamente utilizado pelos trabalhadores foi a benzoilureia, cuja aplicação também não apresentou diferença significativa, bem como o uso de inseticidas das classes organoclorado, piretroide e biológico.

A Tabela 4 mostra as estimativas de tremor essencial em função do tempo de aplicação de agrotóxicos. Trabalhadores que aplicaram agrotóxicos por 16 a 16,9 anos foram aqueles que apresentaram a maior chance para a doença, mesmo quando ajustado por sexo e idade (OR ajustada = 4,60; IC95%: 1,29-16,41) ou por sexo, idade, etilismo, tabagismo e coexposição ocupacional a metais e/ou solventes (OR ajustada = 4,91; IC95%: 1,34-18,03).

Discussão

São poucos os estudos que avaliaram a relação entre tremor e exposição a agrotóxicos. O estudo sobre a saúde dos agricultores norte-americanos realizado nos estados de Iowa e Carolina do Norte, entre 1993 a 1997, ainda é a principal referência no que se refere a essa relação ³⁷. Baseado em questionários autoaplicados, estimou uma prevalência de tremor em 5% daqueles trabalhadores ³⁷. Após ajuste pelas covariáveis selecionadas, foi encontrada OR elevada de tremor em agricultores expostos a organofosforado, organoclorado e fumigantes ³⁷, embora o tremor como sinal clínico não necessariamente significa tratar-se de tremor essencial.

O estudo realizado em agricultores canadenses também observou uma OR elevada de tremor naquela população ³⁸. Apesar do possível confundimento devido à coexposição a metais (chumbo e mercúrio), aqueles agricultores apresentaram maior chance de desenvolver tremor quando comparado a dois grupos controles ³⁸. Por outro lado, o estudo realizado em controladores de pragas e vetores de empresas privadas do Estado da Carolina do Norte não observou associação significativa ³⁹. Apesar do referido estudo também ter utilizado dois controles distintos, a presença de trabalhadores jovens e com pouco tempo de aplicação de agrotóxicos pode ter influenciado na ausência de associação significativa ³⁹. Da mesma forma, em outro estudo, realizado entre agricultores sul-africanos ⁴⁰, também não foi observada associação entre tremor e exposição a agrotóxicos. Nesse estudo, apesar de utilizarem dois indicadores distintos para estimar a exposição acumulada a agrotóxicos, a pouca idade dos agricultores envolvidos e o baixo tempo de aplicação podem ter contribuído para a ausência de associação ⁴⁰. Por fim, a exposição a agrotóxicos organoclorados também não esteve associada ao aumento de chance de tremor essencial em estudo caso-controle realizado em Manhattan, cidade de Nova York (Estados Unidos) ⁴¹.

Os resultados do presente estudo precisam ser interpretados à luz das potenciais limitações inerentes ao desenho adotado. Nesse sentido, a amostragem por conveniência, o tamanho reduzido da amostra, os possíveis erros de classificação não diferenciais, a utilização de controles também expostos a agrotóxicos são, por exemplo, algumas dessas limitações que podem ter acarretado distorções das estimativas de associação entre a exposição a agrotóxicos e tremor essencial.

Foi observado, neste estudo, um predomínio masculino em uma proporção de 2,7 homens para cada mulher. Esse predomínio masculino também foi observado nos estudos avaliados ^38,39,40,41. É possível que a exigência física ainda influencie nessa proporção. Em média, a idade dos trabalhadores portadores de tremor essencial foi de 51 anos, e está abaixo da média da maioria dos estudos que avaliam essa doença ^8,9,11,37,41. A precocidade da doença é um aspecto frequentemente encontrado em doenças ocupacionais. Os trabalhadores estudados eram bastante experientes e, em sua grande maioria, já haviam passado por inúmeras campanhas e múltiplas exposições químicas. No momento da confirmação diagnóstica, a maioria dos casos de tremor essencial era leve a moderado, com o tempo médio de início da doença de 5,3 anos, e poucos trabalhadores tinham a indicação de tratamento medicamentoso.

O tempo de aplicação de inseticidas/larvicidas ≥ 11 anos e a coexposição ocupacional a metais e/ou solventes foram aspectos ocupacionais relevantes para a doença. Já o alcoolismo, tem conhecido efeito deletério sobre o sistema nervoso central e periférico. Casos de alcoolismo foram excluídos da amostra. Semelhante a outros resultados na literatura, observamos que o etilismo estava associado ao tremor essencial ^42,43. A literatura ainda discute o real papel do etilismo social para essa doença, haja vista que clinicamente pequenas doses de álcool podem minimizar o tremor e, nos primórdios dos critérios de classificação, era considerado um sinal clínico para o seu diagnóstico ^42,43. Foi observado um potencial efeito protetor do tabagismo nos trabalhadores portadores de tremor essencial. Esse efeito protetor é corroborado pela literatura vigente ⁴⁴. Em modelo experimental de parkinsonismo em ratos, a nicotina apresentou-se como protetor neuronal por meio da indução de fatores neurotróficos ⁴⁵.

A quantidade de horas aplicadas de inseticidas e larvicidas (≥ 33.001 horas) também apresentou importante relação com o tremor essencial. A utilização de índices como horas, dias-acumulados e cargas aplicadas para estimar exposições, especialmente as ocupacionais, é uma técnica eficaz e comumente empregada em estudos dessa natureza ^{37,40,46,47,48}. Apesar da ausência de significância estatística da OR de tremor essencial dos modelos apresentados entre casos e controles (Tabelas 2 e 3), possui potencial promissor para a estimativa de gradiente dose-resposta e, ao mesmo tempo, agrega conceitos clínicos e toxicológicos básicos para a compreensão dos fenômenos envolvidos.

O aumento na OR de tremor essencial em função do tempo de aplicação de agrotóxicos mostrou-se mais evidente entre aqueles trabalhadores com 16 e 16,9 anos de aplicação, coincidindo com o período em que foram utilizados inseticidas e larvicidas do grupo químico organofosforado. Considerando os resultados de estudos em modelo animal, estudos clínicos e toxicológicos desses agentes, é possível que haja um sinergismo entre os diversos grupos químicos de agrotóxicos no desenvolvimento do tremor essencial. Todavia, não é possível afirmar com o desenho empregado a exposição combinada a outras classes de agrotóxicos, tampouco os “ingredientes inertes” presentes em sua composição.

Conclusões

Considerando a amostra da população de guardas de endemias lotados no Estado do Rio de Janeiro, avaliada entre agosto de 2010 e setembro de 2012, concluímos que o tempo de aplicação de agrotóxicos pode estar associado ao desenvolvimento de tremor essencial nessa categoria profissional.