Cultura de células

A linhagem de glioblastoma humano (GBM) U87MG (ATCC® HTB-14^TM) foi mantida em meio DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) inativado pelo calor, 100 unidades/ml de penicilina e 100 pg/ml de estreptomicina. As células foram mantidas em atmosfera úmida com 5% de CO₂ a 37°C.

Plaqueamento e realização da ranhura

A linhagem celular U87MG foi tripsinizada, contada em diferentes concentrações de células (0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 e 3 x 10⁵ células/500 pl) e foram semeadas em placas de 24 poços. Após 24 horas de incubação a 37°C, as monocamadas foram arranhadas, criando uma fenda sem células, utilizando uma ponta de micropipeta estéril sob um ângulo de cerca de 90 graus para manter a largura do fenda limitada. Para determinar o tamanho apropriado da ranhura, três diferentes tamanhos de pontas de micropipeta (1000, 200 e 10 pl) foram utilizados. O meio foi removido e os poços foram lavados duas vezes com meio sem soro (500 pl) para remover as células no sobrenadante.

Ensaio de ranhura

O paclitaxel 10 (Sigma)⁽¹⁵⁾ e a colchicina 1 (Sigma)⁽¹⁶⁾ foram diluídos em meio DMEN/F12 e utilizados como controles positivos do ensaio na presença de (10%) ou ausência de SFB, utilizando 1,5 x 10⁵ células/500 pl/poço para formar a monocamada de células. Células tratadas com meio (500 pl) suplementadas com ou sem soro foram utilizadas como controle negativo.

Quantificação da ranhura

A área da ranhura foi fotografada utilizando um microscópio invertido (Bel Photonics inv100) antes da adição da droga (tempo0), bem como após 24 h do tratamento, utilizando uma objetiva que permite a visualização de ambas as bordas da ferida com aumento de 40x. As imagens foram salvas como arquivos *.tif para obter o mesmo campo durante a aquisição da imagem. Os pontos de referência foram feitos desenhando uma linha reta, com uma caneta marcadora de ponta ultrafina, no fundo externo dos poços da placa. A marca de referência foi colocada fora do campo de imagem de captura, mas dentro do campo de visão microscópio. Duas áreas da fenda, acima e abaixo da linha guia, foram medidas em cada poço em 0 e 24 h de tratamento utilizando o software Image J (Software 1.48q, Rayne Rasband, National Institutes of Health, EUA; http://rsb.info.nih.gov/ij/⁽¹⁷⁾. O software Image J foi utilizado para detectar automaticamente a posição da extremidade da borda⁽¹⁸⁾ e todo o procedimento foi descrito no Material Suplementar. O fechamento da ranhura (%) foi quantificado utilizando a mudança percentual na área de medição normalizada dividida pela área aberta original de acordo com: % fechamento da ranhura = [A (0) - A (t)/A (0)] x 100¹⁸ onde a área no tempo zero (0) e a área após o tempo de incubação (t) foram utilizadas para calcular a porcentagem de fechamento da ranhura.

Análise estatística

Os resultados foram expressos como porcentagem do fechamento da ferida, considerando a área medida no tempo zero como 0%. As comparações entre os tratamentos foram realizadas utilizando o teste de análise de variância (Anova) seguido de comparação múltipla do teste de Dunnett (foram avaliados três conjuntos de dados), utilizando células não tratadas como controle. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP) e o valor de p < 0,05 foi considerado significativo. Os gráficos e as análises estatísticas foram realizados utilizando o software GraphPad Prism, versão 5.0 (San Diego, CA, EUA).

Padronização do ensaio de ranhura utilizando células U87MG

Os passos realizados no ensaio de ranhura in vitro foram descritos na Figura 1. A densidade ideal para a linhagem celular U87MG foi 1,5 e 2 x 10⁵ células (Figura 2A). Abaixo dessa densidade de células, a confluência era menor que 90% e, acima disso, as células começaram a se sobrepor e se desprenderam da placa durante o experimento. Diferentes concentrações de células também foram arranhadas com três tamanhos de ponta de micropipeta. O objetivo era criar uma zona livre de células com bordas retas por meio da monocamada de células a ser visualizada e fotografada após 24 horas. A densidade celular tem grande influência para uma ranhura homogênea. À medida que a concentração celular aumentava, as bordas da ranhura começavam a formar aglomerados de células que podiam atrapalhar a quantificação da ranhura e também, com a menor concentração de células, entalhes eram criados na borda da superfície da ferida (Figura 2B). Em 1,5 e 2 x 10⁵ células, as três pontas da micropipeta foram eficientes para realizar a ferida (Figura 2B), diferindo apenas na área (p < 0,05). As áreas da ranhura foram respectivamente f.908, 2.508 e 2.787 mm¹ para pontas de micropipeta branca (f0 pl), amarela (200 pl) e azul (f000 pl). Mesmo na presença de soro (Figura 3A e 3B), as lacunas realizadas com ponta de micropipeta branca não foram totalmente fechadas após 24 horas de incubação; optou-se por realizar os experimentos utilizando a ponteira branca, pois ela apresentava a menor área riscada entre as duas outras pontas testadas nos poços.

FIGURA 1 Etapas para realizar o ensaio de cicatrização de ranhura in vitro 1. Tripsinização e contagem de culturas de células; 2. semeadura de placas com vários poços; 3. as células puderam realizar ligações, se espalhar e formar uma monocamada confluente de 90% em um período de 24 horas; 4. fabricação das ranhuras; 5. lavagem dos poços com PBS gelado e aplicação de droga em meio com ou sem SFB; 6. desenho de uma linha reta no fundo das placas; 7. tempo de captura de imagem e medição do vão – 0 h; 8. tempo de incubação e captura de imagens e medição do vão – 24 h; 9. análise de dados.PBS: solução salina tamponada com fosfato; SFB: soro fetal bovino. 

FIGURA 2 Monocamada celular U87MG e padronização do ensaio de ranhuras in vitro A) As células U87MG foram plaqueadas em diferentes densidades e, após 24 horas de incubação, foram fotografadas para observação da confluência das monocamadas celulares. Em 0,5 e 1 × 105 células por poço, a monocamada celular apresentou baixa confluência e, em 2,5 e 3 × 105 células por poço, as células começaram a se sobrepor; B) a monocamada foi então arranhada com três tamanhos de pontas de micropipeta. As densidades celulares de 1,5 e 2 × 105/500 μl apresentaram confluência ideal para a realização do ensaio. 

FIGURA 3 Fechamento in vitro da área de ferida do ensaio de ranhura após 24 horas de tratamento com colchicina ou paclitaxel na presença ou ausência de soro As células U87MG cells foram plaqueadas a 1,5 × 105 células/poço e tratadas por 24 horas com 1 μM de colchicina ou 1 μM de paclitaxel diluído em DMEN/F12 com (A) ou sem (B) o soro. As imagens foram capturadas por câmera acoplada ao microscópio Bel inv 100, com ampliação de 40× antes do tratamento (tempo 0) e após 24 horas de tratamento e comparadas com o controle negativo sem drogas. As imagens foram analisadas no software Image J para avaliar a ranhura por quantificação das áreas ocupadas pela lesão. O gráfico mostra os valores médios e o erro padrão de três experimentos em quadruplicados. Teste Anova seguido pelo teste Dunnett post-hoc test; ***p < 0,001.Anova: análise de variância; SFB: soro fetal bovino. 

Colchícina e paclitaxel como controles no ensaio de ranhura

0 ensaio de ranhura foi realizado utilizando os fármacos colchicina e paclitaxel diluídos em meio com (Figura 3A) ou sem (Figura 3B) SFB (f0%). Ambas as drogas foram capazes de inibir a migração celular na presença ou ausência de soro (p < 0,05) e, a presença de soro não teve influência na área da ferida (p >0,05).

Monocamada de células U87MG e padronização do ensaio de ranhura

Embora o ensaio de ranhura in vitro seja uma fenda reta, a falta de padronização em sua execução dificulta a comparação de resultados e a reprodução de experimentos. 0 número necessário de células para formar uma monocamada confluente de 90%^(9-21) precisa ser determinado de acordo com o tipo de célula e o tamanho dos poços da placa. A linhagem celular escolhida para o estudo foi U87MG, uma linhagem estabelecida de glioblastoma humano, caracterizada por sua alta taxa de proliferação e migração^(22-23), com tempo de duplicação da população de aproximadamente 34 h (ATCC, 2012) e tamanho de 12-14 pm (http://bionumbers.hms.harvard.edu). Na literatura, o ensaio de ranhura foi descrito com diferentes tipos celulares, como células de fibroblastos^(24,25) e células cancerígenas, incluindo glioblastoma^(26-28), câncer de mama^(20,21-29), e câncer de ovário^(30-32). Além disso, foi encontrada uma elevada variação no número de células utilizadas para obter a monocamada celular a ser riscada, como 1 x 10^5(21,30), 2 x 10^5(29,33) e 1 x 10^6(19,34). Outros autores descreveram que as células foram plaqueadas para obter uma confluência de 90% em placas de múltiplos poços^(19-21). O uso de células U87MG no ensaio de ranhura também foi encontrado na literatura⁽³⁵⁾, porém utilizando placas de seis poços. O ensaio de ranhura pode ser realizado em qualquer configuração de placa disponível. A utilização de placas de 24 poços obtém uma triagem rápida em comparação com placas de 12 ou seis poços. Essas abordagens minimizam os custos de teste, reduzindo as quantidades de composto de teste e reagente utilizados. O intervalo ideal de densidade de linha celular U87MG foi 1,5 e 2 x 10⁵, correspondendo a 80-107 x 10³ células/cm². Embora essa densidade possa ser utilizada como referência, o ensaio deve ser ajustado de acordo com o tipo de célula particular a ser estudado.

Para simular ferimentos em um tecido, a abordagem mais comum é criar uma lacuna arranhando uma monocamada confluente com uma ponta de pipeta, agulha ou outra ferramenta pontiaguda. O tamanho das pontas das micropipetas utilizadas para produzir a ferida também apresentou variação^(26,35-37). Todos os três tamanhos de ponta mostraram-se eficientes para realizar a ferida como relatado anteriormente^(26,35-37). No entanto, à medida que a concentração celular aumentava, as feridas se tornavam menos homogêneas, formando aglomerados celulares nas bordas da ferida. Como a ranhura é criada manualmente, pode ser difícil gerar ferimentos reprodutíveis. É importante inclinar a pipeta corretamente, assim como aplicar uma pressão consistente para criar uma largura de fenda consistente. Também é importante lavar duas vezes com solução salina tamponada com fosfato ou meio soro livre antes do tratamento e a aquisição da imagem serem iniciados. A lavagem removerá os detritos das células danificadas ou mortas, particularmente após arranhões mecânicos.

Para reduzir o risco de proliferação celular e comprometer o estudo da migração, uma dose baixa do inibidor da proliferação mitomicina C pode ser utilizada. Mitomicina C (2-10 ml para parar a proliferação de 2-5 h antes de retirar), um antibiótico antitumoral que provoca cross-linking de ácido desoxirribonucleico (DNA) e inibição da síntese de DNA, pode ser utilizado para parar a mitose em várias etapas. No entanto, a dose precisa ser cuidadosamente otimizada para evitar efeitos tóxicos que possam afetar a migração celular. O método mais comum para suprimir a proliferação celular em ensaios de ranhura é o uso de baixas concentrações de SFB ou ausência completa no meio celular (privação de soro). No entanto, a duração da privação de soro e as concentrações de soro necessárias precisam ser rigorosamente determinadas para cada linhagem celular estudada, uma vez que as células primárias não toleram a privação sérica, bem como as linhagens celulares estabelecidas.

As drogas escolhidas para serem testadas foram colchicina e paclitaxel. Ambos são fármacos conhecidos com atividade sobre os microtúbulos^(38,39) e têm ação comprovada na migração^(39,40) e na proliferação celular^(41,42). Na literatura, há uma grande variação, tanto na concentração quanto no tempo de exposição desses fármacos testados em diferentes tipos celulares. Na padronização do ensaio de ranhura, as concentrações de 1 pM para colchicina⁽⁴³⁾ e 1 pM para paclitaxel⁽⁴⁴⁾ foram estabelecidas utilizando-se, como base, a literatura. Tanto a colchicina como o paclitaxel demonstraram ser uma boa escolha de controles positivos para a realização do ensaio de ranhura, mesmo na presença de 10% de soro.

Quantificação da ranhura

A migração celular pode ser quantificada utilizando a distância média da largura da ranhura entre as suas extremidades. Muitas medidas são necessárias devido à irregularidade das bordas e essa quantificação manual pode ser muito demorada. A largura da ferida (mm) deve diminuir à medida que a migração celular progride ao longo do tempo. A migração celular também pode ser medida utilizando as áreas da ranhura. A área da ranhura pode ser calculada rastreando manual ou automaticamente a área livre de células em imagens capturadas utilizando o software de domínio público Image J (NIH, Bethesda, MD). Diferentes tipos de fórmulas matemáticas foram utilizados para avaliar o fechamento da fenda em diferentes períodos de tempo. Alguns usam fórmulas cujos resultados são apresentados utilizando escalas métricas. As unidades de medida de comprimento podem gerar ambiguidades ao converter as proporções de uma imagem digital (representada por pixels) para mm. Portanto, a representação de um resultado que não utiliza unidades baseadas na medida de comprimento, como a utilizada neste estudo, pode contornar o problema. Em condições normais, a área da ferida (mm ou pixel) diminuirá com o tempo [área da ferida = A (0) -A (t)/t]. Alternativamente, a migração pode ser expressa como a alteração percentual na área de medição normalizada para a área aberta original [fechamento da ferida % = A (0) - A (t)/A (0) x 100].

A quantificação da ranhura manual utilizando software de imagem proporciona maior precisão nos valores da área da fenda, levando em consideração as diferentes irregularidades nas bordas proporcionadas pela implementação da medida manual ou automática. Outros softwares, além do Image J, são utilizados pela literatura e também têm sido eficientes nesses quesitos por possuírem ferramentas de quantificação semelhantes ao Image J⁽¹⁸⁾.