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Variação da concentração extracelular de 5’-trifosfato de adenosina na medula espinal de rata associadas a fibras aferentes vesicais. Um estudo com microdiálise

Variação da concentração extracelular de 5’-trifosfato de adenosina na medula espinal de rata associadas a fibras aferentes vesicais. Um estudo com microdiálise

Autores:

Jeová Nina Rocha

ARTIGO ORIGINAL

Einstein (São Paulo)

versão impressa ISSN 1679-4508versão On-line ISSN 2317-6385

Einstein (São Paulo) vol.14 no.4 São Paulo out./dez. 2016

http://dx.doi.org/10.1590/s1679-45082016ao3794

INTRODUÇÃO

O 5’-trifosfato de adenosina (ATP) foi detectado em extratos de gânglios dorsais há mais de 50 anos.(1) Poucos anos depois, observou-se que a estimulação antidrômica de fibras aferentes primárias causavam um aumento de níveis extracelulares de ATP em tecidos inervados pelas fibras aferentes estimuladas.(2) Desde então, as evidências acumuladas indicaram que o ATP, além de seu papel consagrado como fonte de energia intracelular, pode também agir como mensageiro extra- e intracelular, liberado por diversas células, incluindo neurônios no sistema nervoso central e periférico.(3,4)

Também foi proposto que o ATP seria o neurotransmissor, liberado pelas terminações nervosas de alguns neurônios aferentes primários,(5,6) embora a maior parte das evidências que apoiam esta proposta sejam indiretas. Por exemplo, estudos eletrofisiológicos (patch-clamp), em cortes de medula espinal mostraram que dois supostos antagonistas seletivos do receptor P2 [piridoxal fosfato-6-azofenil-2’, 4’-ácido dissulfônico (PPADS) e suramina] reduziram, ao passo que os inibidores de ectonucleotidase (ARL 67156) aumentaram a amplitude de correntes pós-sinápticas excitatórias (EPSC - excitatory postsynaptic currents) de neurônios da lâmina V, provocadas pela estimulação da raiz dorsal.(6) Além disso, em estudos in vitro, com culturas primárias de neurônios do corno dorsal (lâminas I-III) de ratos recém-nascidos, verificou-se que as correntes pós-sinápticas foram reduzidas por antagonistas dos receptores purinérgicos.(7) Ademais, o ATP é liberado por preparações de sinaptossomas obtidos dos cornos dorsais da medula espinal quando esses são despolarizados pelo aumento da concentração extracelular de K(8) e que o pré-tratamento com capsaicina dos animais não alterou a quantidade de ATP liberado por esses sinaptossomas. Como a quantidade de ATP liberado pelas sinaptossomas do corno dorsal da medula espinal foi apenas parcialmente reduzida pela rizotomia dorsal, tem sido proposto que o ATP tenha sido originado principalmente de fibras aferentes primárias não sensíveis à capsaicina (Ab e Ad), bem como de neurônios intrínsecos da medula espinal.(8,9) Com a administração intratecal de antagonistas seletivos do P2X, Kaan et al. sugeriram que receptores purinérgicos espinais poderiam regular os sinais aferentes oriundos da bexiga.(10)

Considerando os experimentos iniciais em camundongos knockout dos receptores do P2X3, bem como o uso de antagonistas seletivos, foi sugerido que receptores periféricos P2X1 e P2X3, localizados na bexiga, estariam envolvidos no reflexo miccional.(11-14)Mais recentemente, foi demonstrado que o ATP é liberado pelo urotélio e que o mesmo é capaz de ativar receptores purinérgicos presentes nas terminações periféricas das fibras aferentes primárias da bexiga.(15) Porém, experimentos recentes, conduzidos em ratos geneticamente modificados que não expressam receptores P2X2 nem P2X3, mostraram que esses receptores não são essenciais para o reflexo miccional em condições normais.(16)

Todavia, ainda não existem resultados experimentais que confirmem se o ATP é liberado a nível espinal em resposta a impulsos aferentes oriundos da bexiga, e se o ATP está envolvido na integração do reflexo miccional a nível medular.

OBJETIVO

Determinar as concentrações extracelulares do 5’-trifosfato de adenosina nos segmentos medulares L6-S1, em condições basais ou durante a ativação mecânica e química das fibras aferentes vesicais.

MÉTODOS

Ratas Sprague Dawley, pesando entre 230 e 260g, foram usadas neste experimento. Todos os procedimentos foram aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, protocolo 013/2014-1.

No dia anterior à realização da microdiálise, as ratas foram anestesiadas com isoflurana (isoflurana 3-4% para indução e 1-2% como dose de manutenção durante a cirurgia) e ventiladas com oxigênio puro (100%). Após tricotomia e antissepsia com betadine, foi feita incisão cirúrgica dorsal mediana na região da vértebra T13 até L5. O procedimento de implante do cateter de microdiálise foi realizado conforme já descrito.(17) Uma broca dental, (com 300µm de diâmetro) foi usada para produzir orifícios nas duas lâminas da vértebra L2. Em seguida, um cateter multiperfurado para microdiálise (200µm de diâmetro) de 6,0cm de comprimento, revestido com uma fina camada de epóxi (com exceção de uma região mediana de 2mm, que permaneceu sem o revestimento para constituir a zona efetiva para a microdiálise) foi introduzido através desses orifícios, para posicioná-lo entre os segmentos L6-S1 da medula espinal para dialisar o interstício do corno dorsal e da comissura dorsal destes segmentos. O cateter foi fixado com cianoacrilato e cola epóxi, e suas extremidades foram conectadas a cateteres de polietileno (PE-20), que foram exteriorizados na região cervical dorsal através de um túnel subcutâneo. As cânulas foram preenchidas com heparina 10% e seladas com um eletrocautério. Imediatamente após a cirurgia, todos os animais receberam injeção de ampicilina (100mg/kg, intramuscular) e foram colocados em gaiolas individuais com água e alimentação à vontade.

Experimentos com microdiálise

Os animais foram anestesiados com uretana (1g/kg, subcutâneo). Um cateter (PE-10 Clay Adams, New Jersey, EUA) foi introduzido na veia femoral direita para infusão contínua de solução salina com glicose 5% (5µL/minuto). Um cateter de polietileno (PE-60) foi introduzido na bexiga através da uretra e fixado ao meato uretral para monitorar a pressão intravesical em condições isovolumétricas.

Cânulas de etileno propileno fluorado (FEP), previamente perfundidas com etanol 30% (30 a 40 minutos) e lavadas com água ultrapura Milli-Q, por 20 minutos, foram conectadas a cânulas PE-20 para perfundir o cateter de microdiálise (velocidade de fluxo de 5µL/minuto), usando uma bomba de microdiálise (modelo CMA-102, CMA, Suécia); a perfusão foi realizada usando solução de Krebs (mM: NaCl 113; KCl 4,7; CaCl2 2,5; MgSO4 1,2; NaHCO3 2,5; KH2PO4 1,2 e d-glicose 11,5), saturada com O2 95%/CO2 5%. A bexiga foi distendida até valores de pressão de 20 ou 40cmH2O, por 10 minutos, com solução salina 0,9% ou solução salina 0,9% com ácido acético 0,1%, ou solução salina 0,9% com capsaicina (10µm).

Em um grupo de animais (n=6), 1mM do inibidor ectonucleotidase 6-N, N-dietil-D-β, γ-dibromo metileno-ATP (ARL 67156) foi adicionado à solução dialisante de Krebs, 90 minutos após o início da microdiálise. Depois de acrescentar ARL 67156, continuou-se a microdiálise por mais 135 minutos. Em todos os experimentos, após 30 a 40 minutos de equilíbrio, o microdialisado foi coletado em amostras de 15 minutos (75µL), com um coletor de frações (CMA-142). As amostras foram mantidas em gelo até a determinação do ATP, feita imediatamente após a finalização da microdiálise.

Determinação do 5’-trifosfato de adenosina

As concentrações do ATP nas frações da microdiálise foram determinadas em triplicatas, com o kit de ensaio de bioluminescência para ATP (Sigma; FL-AA, MO, USA). A luminescência foi medida em um luminômetro (Turner, TD 20/20, Sunnyvale, CA, EUA). A curva padrão foi construída com o uso de ATP dissódico dissolvido em solução de Krebs.

Histologia

No final do procedimento de microdiálise, os animais receberam uma overdose de uretana e foram imediatamente perfundidos mediante uma agulha intracardíaca, com 150mL de solução salina gelada, seguida de 300 a 350mL de paraformaldeído 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS). A medula espinal foi então dissecada, e o segmento contendo a região lombossacral foi pós-fixado no mesmo fixador (4°C, 24 horas). O segmento da medula espinal foi incluído em parafina, e cortes transversais de 10µm foram obtidos com um micrótomo; os mesmos foram corados com hematoxilina-eosina para identificar a posição do cateter.

Análise estatística

Os valores da concentração de ATP foram expressos em percentagem de valor basal, e apresentados como média±EPM. A significância estatística foi determinada pelo teste t de Student para amostras pareadas. Foram considerados estatisticamente significativos valores de p<0,05.

Reagentes e drogas

Uretana, ARL 67156, ATP, ácido acético e todos os componentes da solução de Krebs foram comprados de Sigma Chemical Co.; a capsaicina foi adquirida de Tocris Cookson Inc.; ampicilina foi obtida da Bayer.

RESULTADOS

A posição correta do cateter (100 a 150µm dorsalmente ao canal central) foi histologicamente confirmada em 13 dos 42 animais operados. Na figura 1, observa-se um corte transversal da medula espinal representativo de um animal em que o cateter foi considerado corretamente posicionado. Os dados descritos e analisados nestes resultados correspondem apenas aos 13 animais cuja sonda foi considerada corretamente posicionada.

Figura 1 Microfotografia de um corte transversal da medula espinal representante (10µm) corado com hematoxilina-eosina, mostrando o local de um cateter de microdiálise corretamente posicionada. A ausência do tecido da medula espinal (sulco sem coloração) corresponde ao local onde o cateter foi implantado 

Nos animais com bexigas não distendidas (condições basais), a quantidade de ATP acumulada no microdialisado durante os 15 minutos do período de coleta basal foi de 110,9±35,34fmol (n=13). Quando a bexiga foi distendida por 10 minutos, com solução salina até atingir uma pressão vesical de aproximadamente 20cmH2O, a quantidade de ATP no microdialisado aumentou significativamente e de maneira reprodutível – esse aumento foi transitório, retornando aos valores basais após a remoção da distensão (Figura 2). O aumento na concentração de ATP foi ligeiramente maior, embora não estatisticamente significativo quando a bexiga foi distendida com solução salina até atingir um valor de pressão intravesical de 40cmH2O (Figura 2). É interessante notar que, quando a bexiga foi distendida à pressão intravesical de 20cmH2O com solução salina contendo ácido acético (0,1%) ou capsaicina (10µm), a quantidade de ATP no microdialisado não foi maior do que o observado na bexiga distendida apenas com a solução salina. E ainda mais surpreendente foi que, após a bexiga ter sido distendida com a solução salina contendo capsaicina, os níveis de ATP no microdialisado não aumentaram durante a distensão da bexiga com solução salina subsequente (Figura 2).

ATP: 5’-trifosfato de adenosina; Estim: estimulação; Sal: salina; AA: ácido acético; Caps: capsaicina.

Figura 2 Média±EPM de níveis de 5’-trifosfato de adenosina em amostras sucessivas de microdiálise, expressas como percentagem de valores iniciais, durante períodos de bexiga não distendida, e bexiga distendida a 20 ou 40cmH2O com solução salina, ou solução salina contendo ácido acético (0,1%) ou capsaicina 10µm, n=7; *=p<0,05, em comparação ao valor precedente 

A quantidade de ATP no microdialisado aumentou significativamente quando se adicionou ARL 67156 à solução dialisante. Os níveis de ATP permaneceram elevados na presença contínua de ARL e, surpreendentemente, a distensão da bexiga de 10 minutos, com solução salina até atingir uma pressão de 20 ou 40cmH2O, não causou aumento de ATP no microdialisado (Figura 3).

ATP: 5’-trifosfato de adenosina.

Figura 3 Média±EPM de níveis de 5’-trifosfato de adenosina em amostras sucessivas de microdialisados (75µL, coletadas em 15 minutos), expressos como percentagem de valores iniciais. Seguindo a amostra 6, ARL 67156 foi adicionado à solução dialisante de Krebs [(n=6) – (p<0,05)] em comparação ao valor precedente 

DISCUSSÃO

Os resultados deste estudo usando microdiálise de medula espinal in vivo mostram, pela primeira vez, que o ATP está presente no líquido extracelular do corno dorsal dos segmentos L6-S1 da medula espinal de ratos, na ausência de distensão da bexiga, sugerindo que o ATP é liberado tonicamente neste segmento da medula espinal. Considerando-se que a porção permeável da sonda era de 2mm, a área dialisada incluiu principalmente ambos os cornos dorsais bem como a comissura cinzenta dorsal, e dado que os segmentos L6-S1 recebem informações de fibras aferentes mecanossensíveis, que inervam a bexiga urinária, não é improvável que parte do ATP encontrado no fluido extracelular na ausência de estimulação vesical seja liberado em resposta a inputs de fibras aferentes mecanossensíveis ativas da bexiga, previamente descritas.(18)

Além disso, esses resultados também mostram pela primeira vez que uma distensão fisiológica da bexiga (pressão intravesical até aproximadamente 20cmH2O) está associada a um aumento de ATP extracelular na metade dorsal dos segmentos espinais L6-S1. O aumento observado é significativamente menor do que o relatado para liberação de ATP medido mediante biossensores na área quimiossensível do tronco encefálico induzida por hipercapnia,(19) ou no núcleo do trato solitário (NTS) após ativação de receptores de estiramento pulmonar.(20) É provável que esse aumento no ATP extracelular resulte de sua liberação por neurônios espinais intrínsecos, ativados pelas terminações centrais dos aferentes mecanossensíveis da bexiga. Essa interpretação é consistente com os dados que mostram que neurônios intrínsecos do corno dorsal em cultura liberam ATP,(7) e também com um relatório recente que mostra que ATP é liberado por neurônios intrínsecos do corno dorsal de forma dependente do transportador vesicular de nucleotídeos (VNUT).(21) Alternativamente, o ATP também pode ter se originado de células gliais do corno dorsal, uma vez que essas células podem liberar ATP em resposta ao glutamato.(22) É importante notar que o glutamato já foi proposto como neurotransmissor liberado por aferentes primários mecanossensíveis da bexiga, no corno dorsal.(23,24)

Outra importante observação deste estudo foi o fato de que o aumento no ATP extracelular do corno dorsal, quando a bexiga estava distendida com solução salina contendo ácido acético ou capsaicina, conhecidos ativadores de fibras aferentes quimiossensíveis da bexiga urinária, não foi maior do que aquele causado pela distensão da bexiga só com solução salina. Esta observação indicaria que as terminações centrais de neurônios primários quimiossensíveis que inervam a mucosa vesical não liberam ATP e nem ativam células intrínsecas da medula espinal para liberarem ATP. Essa interpretação é consistente com estudos prévios que mostram que a quantidade de ATP liberada por sinaptossomas obtidos do corno dorsal não foi diminuída pelo pré-tratamento com capsaicina.(8) Esses achados são aparentemente conflitantes com o papel postulado do ATP como mediador em terminações centrais aferentes primárias e sinapses de neurônios do corno dorsal;(25) porém, estudos mais recentes mostraram que o ATP não medeia a transmissão sináptica rápida entre neurônios dos gânglios dorsais e neurônios do corno dorsal em segmentos lombares da medula espinal.(23,26)

Talvez a observação mais intrigante do presente estudo seja o fato de que a distensão da bexiga com solução salina, subsequente à distensão com salina contendo capsaicina (10µm), não se associou a um aumento nos níveis de ATP do corno dorsal. A interpretação mais simples dessa observação é a de que os neurotransmissores liberados pelos terminais centrais de neurônios aferentes primários sensíveis à capsaicina que inervam a bexiga, inibem direta ou indiretamente as células espinais intrínsecas, que liberam ATP no corno dorsal, em resposta a informações de aferentes primários mecanossensíveis.

Finalmente, esses achados também indicam que o próprio ATP poderia estar envolvido no controle autoinibitório de sua liberação, uma vez que, após adição do inibidor de ATPase ARL 67156 à solução dialisadora, que por si só aumentou os níveis de ATP extracelular, a distensão da bexiga não se associou a um aumento maior de ATP no interstício do corno dorsal. O fato de que os níveis de ATP aumentaram durante a microdiálise contendo ARL 67156 é consistente com a descrição da presença de ectonucleotidases capazes de degradar ATP no corno dorsal dos segmentos lombares da medula.(27) Esse controle autoinibitório poderia ser exercido diretamente nas células espinais (neuronais ou gliais) que liberam ATP, ou por uma ação indireta nos interneurônios espinais, provocando a liberação de neurotransmissores inibitórios, como GABA e glicina, conforme demonstrado anteriormente.(28,29)

CONCLUSÃO

Em resumo, este estudo mostra pela primeira vez, usando microdiálise in vivo, que a ativação de fibras aferentes mecanossensíveis da bexiga causou um aumento da concentração de 5’-trifosfato de adenosina extracelular no corno dorsal dos segmentos L6-S1 da medula espinal. Ainda não foi investigado se esse aumento resulta do 5’-trifosfato de adenosina liberado por neurônios espinais intrínsecos, células gliais, ou ambos, em resposta às informações sinápticas de fibras aferentes mecanossensíveis primárias. Esses achados também indicam que a liberação de 5’-trifosfato de adenosina parece ser modulada apenas pelo próprio 5’-trifosfato de adenosina e pela atividade de neurônios aferentes primários sensíveis à capsaicina. Finalmente, embora sejam necessários mais estudos para elucidar o papel do 5’-trifosfato de adenosina liberado no corno dorsal na modulação do reflexo miccional em condições fisiológicas e fisiopatológicas, não é improvável que a neurotransmissão purinérgica no corno dorsal da medula, ativada por distensão da bexiga, constitua-se em num alvo farmacoterapêutico potencial para corrigir alterações clinicamente relevantes no reflexo miccional.

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