Variação do gene fator de crescimento endotelial vascular como preditor de risco para a degeneração discal

Variação do gene fator de crescimento endotelial vascular como preditor de risco para a degeneração discal

Autores:

Aline Amaro,
Ana Beatriz Guerra,
Matheus Pippa Defino,
Luiz Angelo Vieira,
Carla Peluso,
Bianca Bianco,
Luciano Miller Reis Rodrigues

ARTIGO ORIGINAL

Einstein (São Paulo)

versão impressa ISSN 1679-4508versão On-line ISSN 2317-6385

Einstein (São Paulo) vol.15 no.4 São Paulo out./dez. 2017

http://dx.doi.org/10.1590/s1679-45082017ao4053

INTRODUÇÃO

A lombalgia é um dos problemas de saúde mais comuns na sociedade - entre 50 e 80% dos indivíduos relatam pelo menos um episódio durante a vida - e é causa frequente de faltas no trabalho e utilização de serviços de saúde.(1) Entre os processos patológicos que podem afetar o disco intervertebral, sua degeneração é considerada o principal fator causador de lombalgia e lumbosciatalgia.(2-5) Tal degeneração ocorre primariamente como resultado do envelhecimento do disco intervertebral; porém, a degeneração discal também acomete pacientes jovens. Há hipóteses de que fatores genéticos e ambientais, bem como os fatores de risco sobrecarga de trabalho, tabagismo, sobrepeso, obesidade e sedentarismo(6) contribuíam cada vez mais para o aparecimento de dor crônica associada à degeneração discal em indivíduos mais jovens.(7)

Anatomicamente, o disco intervertebral é formado por três principais estruturas: placas terminais cartilaginosas, núcleo pulposo central e ânulo fibroso, localizado na periferia do disco.(8,9) O disco intervertebral lombar é o maior tecido avascular, e seu processo de nutrição ocorre principalmente pela vasculatura adjacente por meio da difusão das placas terminais vertebrais. Desta forma, há sugestões de que alterações no fluxo sanguíneo do disco intervertebral podem levar à degeneração discal.(10) Além disto, pode ocorrer involução de vasos sanguíneos no disco degenerado pela placa terminal vertebral ou pelo ânulo fibroso.(11)

Considerando-se que a angiogênese ocorre simultaneamente ao processo de degeneração discal, é possível presumir que genes a ela relacionados possam determinar o risco de desenvolvimento de degeneração discal.(11) Assim, polimorfismos em genes previamente implicados em angiogênese podem contribuir para a etiologia da degeneração do disco intervertebral.

Um dos mais importantes peptídeos relacionados à angiogênese é o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), codificado pelo gene VEGF e altamente polimórfico, localizado no cromossomo 6p21.3, e que contém 14kb na região codificadora, com oito éxons e sete íntrons.(12)

O VEGF opera direta e seletivamente por meio dos receptores de VEGFR-1 e VEGFR-2, expressos predominantemente e, talvez, exclusivamente no endotélio vascular. A conexão do VEGF a estes receptores causa alterações no formato das células, divisão e migração celular, e influxo citoplasmático de cálcio, aumentando sua concentração em até quatro vezes. O aumento da permeabilidade venosa para as macromoléculas permite que as proteínas plasmáticas se espalhem por todo o espaço vascular, levando à coagulação do fibrinogênio e deposição de gel de fibrina, o que funciona como matriz provisória para o crescimento de novos vasos sanguíneos. A maior permeabilidade microvascular parece invariavelmente preceder e/ou suceder a angiogênese em uma variedade de processos fisiológicos e patológicos, o que faz o gene VEGF ser considerado um importante mediador da angiogênese.(12)

Considerando-se a influência do VEGF na formação de novos vasos, e a importância da nutrição dos discos intervertebrais para sua vitalidade, levantamos a hipótese de uma possível relação entre os polimorfismos do gene VEGF e a degeneração discal.

OBJETIVO

Avaliar a frequência de polimorfismos e o haplótipo do gene fator de crescimento endotelial vascular [-2578C/A (rs699947), −1154G/A (rs1570360), +405G/C (rs2010963), −460T/C (rs833061) e +936C/T (rs3025039)] em pacientes com degeneração discal e no Grupo Controle.

MÉTODOS

Foi realizado um estudo transversal com 217 indivíduos selecionados e divididos em dois grupos: pacientes com lombalgia crônica (Grupo Caso) e indivíduos saudáveis (Grupo Controle). Os participantes foram analisados para investigar-se a presença de cinco polimorfismo do gene VEGF [-2578C/A (rs699947), −1154G/A (rs1570360), +405G/C (rs2010963), −460T/C (rs833061) e +936C/T (rs3025039)].

Para o Grupo Caso, foram selecionados 110 pacientes com lombalgia crônica do Grupo de Especialidades Clínicas - Cirurgia de Coluna Vertebral do Hospital Estadual Mário Covas, coordenado pela disciplina Doenças do Sistema Locomotor, da Faculdade de Medicina do ABC, em Santo André (SP), Brasil. Os critérios de inclusão utilizados foram paciente com lombalgia crônica (há mais de 3 meses); idade inferior a 50 anos; ressonância magnética para confirmação de degeneração discal em pelo menos um disco, analisado principalmente no plano sagital em T2, incluindo os discos entre L4 e L5, e, L5 e S1. A degeneração discal foi classificada utilizando-se o sistema de classificação de Pfirrmann et al.,(13) e o diagnóstico foi confirmado por dois radiologistas após teste de ressonância magnética nuclear. Foram adotados os seguintes critérios de exclusão: pacientes previamente submetidos a tratamento cirúrgico; com deformidades congênitas da coluna vertebral; e com hérnia de disco lombar.

Para o Grupo Controle, foram coletadas amostras de 107 indivíduos saudáveis sem deformidades da coluna vertebral ou história de lombalgia, atendidos no Ambulatório da Faculdade de Medicina do ABC. Os seguintes critérios de inclusão foram baseados em observações clínicas: ter entre 20 e 45 anos de idade; sem história de cirurgia da coluna; sem história de tratamento para hérnia de disco; sem história de hospitalização por lombalgia; sem uso de medicamentos para lombalgia por mais de 7 dias; e que não tivessem familiares com menos de 50 anos de idade com hérnia de disco ou tratamento clínico para lombalgia.

O recrutamento de todos os pacientes e a metodologia adotada foram realizados entre janeiro de 2015 e novembro de 2016. A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina do ABC, sob protocolo 1.142.930, CAAE: 45904515.9.0000.0082.

Estudo do polimorfismo

Foram coletados 4mL de sangue periférico para a extração do DNA, de acordo com o protocolo de Lahiri e Nurnberger (1991) pelo método de salting-out. O DNA obtido foi quantificado e qualificado por espectrofotômetro Thermo Scientific NanoDrop 2000 e diluído até a concentração padrão de 25ng/μL.

Os polimorfismos C-2578A/rs699947, G-1154A/ rs1570360, G+405C/rs2010963, T-460C/rs833061 e C+936T/rs3025039 (Tabela 1) foram identificados por reação em cadeia (PCR) em tempo real quantitativa. Os ensaios TaqMan foram adquiridos comercialmente da Life Technologies® (Foster City, CA, EUA). Os ensaios foram feitos com TaqMan Genotyping Master Mix, com 50ng de DNA por reação. As condições da PCR estavam de acordo com as recomendações do fabricante: desnaturação inicial a 95°C (15 minutos), seguida de 40 ciclos de desnaturação a 95°C (15 segundos) e anelamento/extensão a 60°C (1 minuto).

Tabela 1 Polimorfismos do gene fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e os respectivos ensaios TaqMan 

Gene Localização Polimorfismo rs Ensaio TaqMan
VEGF 6: 43736389 C2578A rs699947 C___8311602_10
6: 43737830 G-1154A rs1570360 C___1647379_10
6: 43738350 G405C rs2010963 C___8311614_10
6: 43737486 T-460C rs833061 C___1647381_10
6: 43752536 C+936T rs3025039 C__16198794_10

Análise estatística

Os resultados foram analisados estatisticamente por meio do programa Stata 11.0. Foi utilizado o Genetic Power Calculator(14) para estimar o poder estatístico dos resultados relacionados aos dados individuais de polimorfismo.

O teste χ2 foi utilizado para comparar a frequência dos genotipos e alelos entre os grupos, e estimar o equilíbrio Hardy-Weinberg. A odds ratio (OR) foi calculada em relação à presença do genotipo de referência, por meio de um modelo de regressão logística. O nível de significância estabelecido foi de 0,05 (α<0,05). Além disso, a associação entre o genotipo combinado de polimorfismos do gene VEGF e o risco de degeneração discal também foi avaliada pelo estudo de haplotipos por meio do programa Haploview, versão 4.1 (http://www.hapmap.org).

RESULTADOS

As características da amostra estão demonstradas na tabela 2.

Tabela 2 Características dos pacientes 

Características Degeneração discal Controle
Idade 39,2±7,58 32,3±7,17
Sexo, n (%)
Masculino 53(48) 22 (21)
Feminino 57 (52) 85 (79)
Etnia, n (%)
Branco 62 (56) 69 (65)
Negro 32 (29) 26 (24)
Sem resposta 16 (15) 12 (11)

A análise dos polimorfismos do gene VEGF foi feita em todos os participantes do estudo. Podem ser observadas a frequência dos alelos e a frequência polimorfica para rs699947, rs1570360, rs2010963, rs833061 e rs3025039 na tabela 3. O poder calculado do tamanho da amostra do teste foi <0,50 (0,05) para o Grupo Degeneração Discal, considerando-se os polimorfismos estudados.

Tabela 3 Frequência de polimorfismos do gene fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) na população com degeneração discal intervertebral e na população controle 

VEGF SNP População Estudada Genótipos Alelos Valor de p OR (IC95%) HWE
n (%) n (%) n (%) n (%) n (%)
rs3025039 Controle CC CT TT C T
81 (73,7) 26 (23,6) 3, (2,7) 188 (85,5) 32 (15,4) 0,230 1,49 (0,83-2,65) 0,875
+936C/T Casos 85 (79,4) 22 (20,6) 0 (0) 192 (89,7) 22 (10,3) 0,495
rs833061 Controle CC CT TT C T
19 (17,3) 58 (52,7) 33 (30) 96 (43,6) 124 (56,4) 0,596 0,88 (0,60-1,30) 0,752
-460C/T Casos 13 (12,2) 61 (57,0) 33 (30,8) 87 (40,7) 127 (59,3) 0,171
rs699947 Controle CC CA AA C A
17 (15,5) 55 (50,0) 38 (34,5) 89 (40,5) 131 (59,5) 0,475 0,76 (0,52-1,13) 0,924
-2578C/A Casos 9 (8,4) 55 (51,4) 43 (40,2) 73 (34,1) 141 (65,9) 0,332
rs1570360 Controle GG GA AA G A
67 (60,9) 34 (30,9) 9 (8,2) 168 (76,4) 52 (23,6) 0,862 1,07 (0,68-1,67) 0,321
-1154G/A Casos 64 (59,8) 38 (35,5) 5 (4,7) 166 (77,6) 48 (22,4) 0,977
rs2010963 Controle GG GC CC G C
49 (44,5) 51 (46,4) 10 (9,1) 149 (67,7) 71 (32,3) 0,823 1,07 (0,71-1,60) 0,817
+405G/C Casos 50 (46,8) 48 (44,8) 9 (8,4) 148 (69,2) 66 (30,8) 0,867

SNP: single nucleotide polymorphism; OR: odds ratio; IC95%: intervalo de confiança de 95%; HWE: Hardy-Weinberg equilibrium.

Não foram observadas diferenças significativas nos polimorfismos do gene VEGF estudados. Ademais, descrevemos o equilíbrio de Hardy-Weinberg, e todos os polimorfismos estavam em equilíbrio na população estudada. Os mesmos dados foram aplicados na análise dos haplotipos para estimar se havia correlação entre os polimorfismos estudados (Tabela 4).

Tabela 4 Análise dos haplótipos dos polimorfismos rs8330661, rs699947, rs1570360, rs2010963 e rs3025039 do gene fator de crescimento endotelial vascular em pacientes com degeneração discal e em indivíduos do Grupo Controle 

Haplótipo* Degeneração discal (%) Controles (%) Valor de p
TCGCC 26,7 26,3 0,923
TCGGC 21,7 27,9 0,136
CAAGC 19,3 19,3 0,995
CAGGC 14,7 9,5 0,094
TCGCT 5,4 4,0 0,474
CCGGC 2,4 6,1 0,054
CAAGT 3,9 3,1 0,649
CAGGT 2,5 1,7 0,584
TCGGT 2,0 1,1 0,450

*Haplótipo dos polimorfismos rs8330661(T/C), rs699947 (C/A), rs1570360 (G/A), rs2010963 (G/C) e rs3025039 (C/T).

Os resultados da haplotipagem identificaram dois blocos de haplotipos que envolviam todos os polimorfismos estudados. O primeiro, CAGGC, apre sentava correlação com a presença de degeneração discal (p=0,094), ao passo que o CCGGC mostrou-se mais presente no Grupo Controle (p=0,054).

DISCUSSÃO

O presente estudo não encontrou correlação entre os polimorfismos de VEGF e a degeneração discal em indivíduos brasileiros. Todavia, observamos correlação entre o haplotipo CAGGC e a degeneração discal, além de uma maior presença do haplotipo CCGGC no Grupo Controle. O disco intervertebral é um tecido avascular, mas os vasos adjacentes fornecem os nutrientes adequados e removem os resíduos metabólicos, e estes processos são importantes para manter o disco saudável.

Nos estágios da angiogênese, diversos fatores contribuem para este processo: citocinas (polipeptídeos), enzimas, componentes da matriz extracelular e moléculas de superfície. Há dois fatores que estimulam primariamente o crescimento do endotélio vascular - VEGF e FGF-2. David et al.,(15) confirmaram, por meio de exames imuno-histoquímicos, a presença deste polipeptídeo do VEGF em hérnias de disco intervertebrais e/ou em degenerações discais. Porém, ainda não está claro como a expressão do VEGF neste tecido é alterada em hérnias de disco e na degeneração discal.(16)

Alguns autores(17,18) já associaram a expressão do VEGF ao tecido discal degenerado. Lee et al.,(17) concluíram que seria necessária a ativação da interleucina (IL) 1β durante a degeneração discal, para permitir a expressão de VEGF, NGF e BDNF, resultando na angiogênese. Porém, Lu et al.,(18) encontraram um índice positivo da expressão do VEGF de 73,42% (116/156) na degeneração discal. Nos casos em que o tecido do disco intervertebral estava normal, não havia expressão positiva de VEGF. Além disto, tal expressão mostra-se maior em discos com infiltração vascular, do que em discos sem esta infiltração.

Um dos mecanismos que poderia justificar este fato seria a presença de polimorfismos no gene VEGF, o que alteraria sua expressão. A alteração no gene, causada por polimorfismos, e sua expressão já foram demonstradas em estudos clínicos. Para os polimorfismos −2578A e −1154A do VEGF, há uma diminuição da expressão do VEGF; porém, VEGF-634G> C SNP foi correlacionado a uma diminuição da capacidade de produzir VEGF.(10,19,20)

Awata et al.,(21) propuseram que o alelo VEGF −634C está associado ao aumento de níveis de transcrição de VEGF, ao passo que Lambrechts et al.,(22) relataram que o VEGF-634G está associado a uma menor expressão de VEGF. Porém, nenhum biomarcador de VEGF foi totalmente associado à lombalgia e a seus mecanismos.(23)

Han et al.,(24) observaram que a frequência da combinação dos genótipos VEGF-2578CA + AA/-634CC mostra-se mais alta em pacientes com degeneração discal. Ademais, consideram que o alelo VEGF-634C pode ser importante na suscetibilidade ao desenvolvimento da degeneração. Este foi um dos primeiros estudos feitos com a população coreana correlacionando o gene VEGF à degeneração discal.(25)

Neste trabalho, foram estudados os polimorfismos rs699947, rs1570360, rs2010963, rs833061 e rs3025039, e não foram observadas diferenças significativas nestes polimorfismos em relação à degeneração discal. A frequência dos polimorfismos, mesmo entre os alelos, não diferiu entre os Grupos Caso e Controle. No entanto, para a análise dos haplótipos, observamos tendência de significância para o haplótipo CCGGC, e os pacientes com esta combinação apresentavam maior proteção contra o desenvolvimento de degeneração discal. Estudos relacionando a degeneração discal e polimorfismos no gene VEGF são raros na literatura, sendo o presente trabalho muito relevante para a comunidade acadêmica.

Esta divergência entre os resultados mostra que diferentes mecanismos podem ativar a transcrição genética do VEGF. Binch et al.,(16) estudaram a expressão de citocinas e descreveram as respostas mediadas por elas, mostrando efeitos mínimos na degeneração discal. Porém, células do núcleo pulposo podem regular o crescimento de células endoteliais em um processo de degeneração discal por meio de vias catabólicas, levando à lumboscitalgia.(26) Por outro lado, não se sabe exatamente em qual estágio da degeneração discal o processo de neovascularização é ativado, mas fatores como tabagismo, sobrepeso e prática de exercício também podem influenciar no processo de angiogênese.(15)

Polimorfismos são fatores importantes para o entendimento da diferença entre expressões genéticas, como em tecidos normais ou patológicos, mas atualmente são pouco observados na prática clínica. Neste estudo com a população brasileira, não foram encontradas associações entre os polimorfismos do VEGF e a degeneração discal. No entanto, considerando-se que muitos polimorfismos podem ter um efeito de adição, a análise dos haplótipos ainda pode ser explorada, aumentando-se o tamanho da amostra.

O tamanho da amostra de nosso estudo pode representar grande limitação. Porém, o pequeno número de pacientes estudados é resultado do critério de seleção, já que todos os pacientes incluídos neste estudo apresentavam apenas degeneração discal, sem história de cirurgia, e com idade menor que 47 anos. Por outro lado, as amostras apresentavam-se dentro do equilíbrio Hardy-Weinberg, permitindo as análises de genótipos e haplótipos. Outra limitação do estudo pode ser atribuída ao fato de que os exames de ressonância magnética não foram avaliados no Grupo Controle; porém, o critério de exclusão utilizado foi bastante rígido.

O presente estudo ainda apresenta diversos pontos fortes. O campo genético foi identificado como promissor, aumentando as chances de melhor entendimento sobre cada condição que pode afetar a saúde de um indivíduo. A lombalgia é, muitas vezes, subdiagnosticada, sendo tratados apenas os sintomas. O compartilhamento de novas ferramentas para o diagnóstico, o tratamento e a prevenção de doenças é imprescindível para o entendimento de problemas de saúde.

CONCLUSÃO

A presença de polimorfismos do gene VEGF como preditor de risco para degeneração discal foi negativa na população estudada. Porém o gene VEGF tem grande região polimórfica, sendo ativado por diversos fatores catabólicos e metabólicos no processo de degeneração discal, mas este processo ainda não está totalmente claro.

REFERÊNCIAS

1. Andersson GB. Epidemiology of low back pain. Acta Orthop Scand Suppl. 1998;281:28-31.
2. Luoma K, Riihimäki H, Luukonen R, Raininko R, Viikari-Juntura E, Lamminen A. Low back pain in relation to lumbar disc degeneration. Spine (Phila Pa 1976). 2000;25(4):487-92.
3. Gunzburg R, Fraser RD, Fraser GA. Lumbar intervertebral disc prolapse in teenage twins. A case report and review of the literature. J Bone Joint Surgery Br. 1990;72(5):914-6. Review.
4. Richardson JK, Chung T, Schultz JS, Hurvitz E. A familial predisposition toward lumbar disc injury. Spine (Phila Pa 1976). 1997;22(13):1487-92; discussion 1493.
5. Simmons ED Jr, Guntupalli M, Kowalski JM, Braun F Seidel T. Familial predisposition for degenerative disc disease: A case-control study. Spine (Phila Pa 1976). 1996;21(13):1527-9.
6. Battié MB, Videman T, Levälahti E, Gill K, Kaprio J. Genetic and environmental effects on disc degeneration by phenotype and spinal level: a multivariate twin study. Spine (Phila Pa 1976). 2008;33(25):2801-8.
7. Bishwajit G, Tang S, Yaya S, Feng Z. Participation in physical activity and back pain among an elderly population in South Asia. J Pain Res. 2017;10:905-13. eCollection 2017.
8. Bernick S, Cailliet R. Vertebral end-plate changes with aging of human vertebrae. Spine (Phila Pa 1976). 1982;7(2):97-102.
9. Maroudas A, Stockwell RA, Nachemson A, Urban J. Factors involved in the nutrition of the human lumbar intervertebral disc: cellularity and diffusion of glucose in vitro. J Anat. 1975;120(Pt 1):113-30.
10. Niinimäki J, Korkiakoski A, Parviainen O, Haapea M, Kuisma M, Ojala RO, et al. Association of lumbar artery narrowing, degenerative changes in disc and endplate and apparent diffusion in disc on postcontrast enhancement of lumbar intervertebral disc. MAGMA. 2009;22(2):101-9.
11. Moore RJ. The vertebral endplate: disc degeneration, disc regeneration. Eur Spine J. 2006;15 Suppl 3:S333-7. Review.
12. Haro H, Kato T, Komori H, Osada M, Shinomiya K. Vascular endothelial growth factor (VEGF) -induced angiogenesis in herniated disc resorption. J Orthop Res. 2002;20(3):409-15.
13. Pfirrmann CW, Metzdorf A, Zanetti M, Hodler J, Boos N. Magnetic resonance classifcation of lumbar intervertebral disc degeneration. Spine (Phila Pa 1976). 2001;26(17):1873-8.
14. Purcell S, Cherny SS, Sham PC. Genetic power calculator: design of linkage and association genetic mapping studies of complex traits. Bioinformatics. 2003;19(1):149-50.
15. David G, Ciurea AV, Iencean SM, Mohan A. Angiogenesis in the degeneration of the lumbar intervertebral disc. J Med Life. 2010;3(2):154-61.
16. Binch LA, Cole AA, Breakwell LM, Michael AR, Chiverton N, Cross AK, et al. Expression and regulation of neurotrophic and angiogenic factors during human intervertebral disc degeneration. Arthritis Res Ther. 2014;16(5):416.
17. Lee JM, Song JY Baek M, Jung HY Kang H, Han IB, et al. Interleukin- 1β induces angiogenesis and innervation in human intervertebral disc degeneration. J Orthop Res. 2011;29(2):265-9.
18. Lu XY Ding XH, Zhong LJ, Xia H, Chen XD, Huang H. Expression and significance of VEGF and p53 in degenerate intervertebral disc tissue. Asian Pac J Trop Med. 2013;6(1):79-81.
19. Watson CJ, Webb NJ, Bottomley MJ, Brenchley PE. Identification of polymorphisms within the vascular endothelial growth factor (VEGF) gene: correlation with variation in VEGF protein production. Cytokine. 2000;12(8): 1232-5.
20. Awata T, Inoue K, Kurihara S, Ohkubo T, Watanabe M, Inukai K, et al. A common polymorphism in the 5'-untranslated region of the VEGF gene is associated with diabetic retinopathy in type 2 diabetes. Diabetes. 2002;51(5):1635-9.
21. Awata T, Kurihara S, Takata N, Neda T, Iizuka H, Ohkubo T, et al. Functional VEGF C-634G polymorphism is associated with development of diabetic macular edema and correlated with macular retinal thickness in type 2 diabetes. Biochem Biophys Res Commun. 2005;333(3):679-85.
22. Lambrechts D, Devriendt K, Driscoll DA, Goldmuntz E, Gewillig M, Vlietinck R, et al. Low expression VEGF haplotype increases the risk for tetralogy of Fallot: a family based association study. J Med Genet. 2005;42(6):519-22.
23. Weber KT, Satoh S, Alipui DO, Virojanapa J, Levine M, Sison C, et al. Exploratory study for identifying systemic biomarkers that correlate with pain response in patients with intervertebral disc disorders. Immunol Res. 2015;63(1-3):170-80.
24. Han IB, Ropper AE, Teng YD, Shin DA, Jeon YJ, Park HM, et al. Association between VEGF and eNOS gene polymorphisms and lumbar disc degeneration in a young Korean population. Genet Mol Res. 2013;12(3):2294-305.
25. Martirosyan NL, Patel AA, Carotenuto A, Kalani MY Belykh E, Walker CT, et al. Genetic alterations in intervertebral disc disease. Front Surg. 2016;21(3):59. eCollection 2016. Review.
26. de Campos MF, de Oliveira CP Neff CB, Correa OM, Pinhal MA, Rodrigues LM. Studies of molecular changes in intervertebral disc degeneration in animal model. Acta Ortop Bras. 2016;24(1):16-21.
Política de Privacidade. © Copyright, Todos os direitos reservados.