INTRODUÇÃO

O carcinoma gástrico tem alta incidência global e baixa sobrevida média em países desenvolvidos e em desenvolvimento. Apesar dos avanços na terapia convencional, as taxas de recorrência permanecem altas e as de sobrevida baixas^{1,7,11,12,16,17,26,30,35}.

Alterações como as mutações, deleções, inativação por vírus e bactérias e hipermetilação estão envolvidas no surgimento do câncer gástrico^7,16,28,32. Os genes Wnt codificam proteínas de sinalização e são encontrados nos genomas de todos os animais. A sinalização é iniciada quando os ligantes da via Wnt são ligados em um complexo que consiste de um receptor da família frizzled e um membro da família de receptores lipídicos de baixa densidade²⁴. A principal molécula da cascata é a proteína β-catenina citoplasmática cuja estabilidade é regulada pelo chamado “complexo de destruição”^7,16,32.

As proteínas Wnt desempenham um papel importante na embriogênese e maturação dos tecidos. Elas atuam como ligantes dos componentes da família frizzled que são receptores celulares trans-membranas. Uma vez ligados a esses receptores, as proteínas Wnt podem ativar duas vias distintas de sinalização celular: a via canônica e a via não-canônica. Várias proteínas estão envolvidas nas duas vias^14,17,32.

A via de sinalização Wnt, frequentemente, está envolvida na carcinogênese gástrica e várias proteínas dessa via podem estar mutadas ou expressas atipicamente em tecido tumoral gástrico. No entanto, o envolvimento e os mecanismos da via Wnt no início do câncer gástrico não estão totalmente compreendidos como no câncer colorretal^8,32.

Um estudo anterior do nosso grupo de pesquisa sugeriu que a via Wnt/β-catenina pode estar envolvida na carcinogênese gástrica. Lins et al.(2016)²⁴ analisaram as expressões da E-caderina, β-catenina, APC, TCF-4 e survivina em tecidos de câncer gástrico por imunoistoquímica e verificaram a relação entre a expressão das proteínas e a idade dos pacientes e os aspectos anatomopatológicos do carcinoma gástrico como localização, classificação de Lauren e grau de infiltração tumoral na parede gástrica.

Para identificar outras proteínas da via Wnt nessas mesmas amostras, propusemos como objetivo deste trabalho estudar duas proteínas da via não canônica (Wnt-5a, FZD5) e seis da via canônica (GSK3B, axina, CK1, ubiquitina, ciclina D1 e myc) e relacionarmos as suas expressões com as características epidemiológicas e anatomopatológicas da amostra do tumor.

MÉTODO

O Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) aprovou o protocolo do estudo (Registro no 1.128.919 / 2015).

RESULTADOS

Os dados clínicopatológicos dos pacientes com câncer gástrico estão resumidos na Tabela 1. Quarenta e cinco eram homens e 25 mulheres com idade média de 65 anos. Quarenta e seis tumores eram da região proximal e 39 maiores que 5 cm. Nenhuma margem cirúrgica comprometida foi observada em 63 casos. Invasão venosa foi identificada em 23 pacientes e linfática em 39. A invasão perineural esteve presente em 43 pacientes. Em 38 os tumores foram moderadamente ou bem diferenciados e a classificação de Lauren incluiu 49 adenocarcinomas intestinais e 21 adenocarcinomas difusos. O estadiamento TNM mostrou que mais de 50% dos pacientes estavam em estágio avançado da doença.

A Figura 1 mostra fotomicrografia dos resultados imunoistoquímicos das proteínas Wnt-5a, FZD5, GSK3β, Axin, Ubiquitina, Ciclina D1, c-myc e CK1 em tecidos de adenocarcinoma gástrico.

FIGURA 1 Resultados imunoistoquímicos das proteínas: A=Wnt-5a; B=FZD5; C=GSK3β; D=axin; E=ubiquitin; F=ciclin D1; G=c-myc; H=CK1  

A Tabela 2 mostra a presença ou ausência das proteínas Wnt-5a, FZD5, GSK3β, Axina, CK1, Ubiquitina, Ciclina D1 e c-myc em tecidos de adenocarcinoma gástrico. Nenhuma proteína estudada mostrou marcação de membrana.

Houve diferenças significativas para a expressão de ubiquitina no citoplasma e núcleo para tumores moderadamente e bem diferenciados (p=0,03) e para aqueles do tipo intestinal da classificação de Lauren (p=0,03). A expressão negativa da proteína c-myc no citoplasma foi relacionada aos tumores intestinais de Lauren (p=0,028, Tabela 3). As expressões das proteínas GSK3β, Axina e expressão nuclear de c-myc não foram relacionadas a nenhuma das variáveis clinicopatológicas. No entanto, notamos que a expressão da proteína Axina no núcleo e no citoplasma foi maior em tumores moderadamente e bem diferenciados e aqueles do tipo intestinal de Lauren, mas sem significância estatística. A expressão positiva de CK1 no citoplasma das células neoplásicas foi relacionada aos tumores com margens cirúrgicas livre de envolvimento neoplásico (p=0,03). A expressão positiva da proteína ciclina D1 foi maior nos tumores dos homens (p=0,03), mas não foi relacionada a nenhuma outra variável clinicopatológica. Não houve relação da expressão positiva ou negativa das proteínas Wnt-5a e FZD5 no citoplasma ou núcleo com quaisquer variáveis clinicopatológicas.

DISCUSSÃO

A via Wnt está frequentemente envolvida na carcinogênese gástrica e a via canônica é considerada a mais importante nesta carcinogênese. No entanto, a via não-canônica também tem sido relacionada à gênese da neoplasia gástrica^5,8,18,32.

A proteína Wnt-5a é considerada inibidora da via de sinalização canônica e supressora tumoral. No presente estudo, a expressão positiva de Wnt-5a e FZD5 não foi relacionada às variáveis estudadas. Com imunoistoquímicao Kurayoshi et al. (2006)²² mostraram expressão anormal de Wnt-5a em 71 de 237 casos de câncer gástrico. A positividade de Wnt-5a foi correlacionada aos estágios avançados da neoplasia e com o pior prognóstico dos pacientes. Ara et al. (2016)² avaliaram a relação de Wnt-5a com laminina g2, uma proteína relacionada à adesão celular e invasão neoplásica. Os resultados sugerem que a proteína Wnt-5a está envolvida na progressão do câncer gástrico, um achado similar ao encontrado por outros autores^15,29,33. Zhang et al. (2015)³⁴ mostraram que a expressão positiva de Wnt-5a está relacionada com o melhor prognóstico do câncer gástrico. Por outro lado, os receptores FZD5 recebem sinais canônicos e não canônicos, sendo importantes na via Wnt. No entanto, a proteína FZD5 foi mais relacionada à via Wnt não-canônica³¹.

A GSK3 é proteína multifuncional envolvida nas vias reguladoras de células de mamíferos, incluindo a via Wnt, e faz parte do complexo de destruição da β-catenina. No presente estudo, identificamos forte expressão da proteína GSK3β no núcleo e no citoplasma, mas não houve relação com as variáveis epidemiológicas dos pacientes e anatomopatológicas do tumor, o que também foi observado como tal por outros autores^31,34. Cho et al. (2010)⁹ analisaram a expressão de GSK3β em 281 casos de carcinoma gástrico. A expressão positiva desta proteína foi relacionada aos tumores precoces, sem metástases linfonodais e sem invasão angiolinfática.

A proteína Axin é parte do complexo de destruição da β-catenina e atua como um supressor de tumor. Mutações em genes que sintetizam a Axina estão relacionadas à gênese do carcinoma hepatocelular, adenocarcinoma endometrial e meduloblastoma^20,25. Neste estudo, a expressão da proteína Axina foi mais intensa no núcleo do que no citoplasma e foi identificada em 100% dos núcleos das células de carcinoma gástrico. A expressão citoplasmática também foi intensa e predominou em tumores moderadamente ou bem diferenciados e no tipo intestinal da classificação de Lauren²³. Kim et al (2014)²⁰ mostraram que nove dos 45 carcinomas gástricos com instabilidade de microssatélites (MSI) tinham uma mutação frameshift da AXINA2. Pan et al. (2008)²⁷ analisaram 70 carcinomas gástricos e identificaram 7,1% de mutação no gene AXINA e concluíram que essas mutações contribuíram para a carcinogênese gástrica. Mazzoni e Fearon (2014)⁴ revisaram a importância da Axina e suas variantes nos carcinomas gastrointestinais e observaram que a proteína Axina apresentou expressão fortemente positiva em células neoplásicas.

A proteína CK1 pode ser identificada na membrana celular, núcleo ou citoplasma. São conhecidos sete membros da família CK1 em humanos. CK1 epsilon foi relacionado à fosforilação da via Wnt. Existem poucos estudos avaliando a expressão da CK1 e sua relação com o aparecimento do câncer gástrico. Como parte do complexo de destruição da β-catenina, a expressão positiva desta proteína sugere que ela possa estar presente nos estágios iniciais do carcinoma gástrico^4,21. No presente estudo, uma forte expressão positiva da CK1 foi observada no citoplasma das células neoplásicas onde normalmente exerce sua função e não no núcleo.

A ubiquitina é responsável por rotular a proteína a ser degradada da cadeia da poliubiquitina. A regulação da concentração plasmática de β-catenina como um membro da via Wnt é realizada pelo complexo de destruição juntamente com a ubiquitina. No presente estudo, a proteína ubiquitina mostrou forte expressão tanto no núcleo como no citoplasma. Tanto no núcleo quanto no citoplasma, a expressão protéica foi significativamente maior nos tumores moderadamente ou bem diferenciados e no tipo intestinal da classificação de Lauren²³.

Arici et al. (2009)³ avaliaram a expressão da proteína ciclina D1 na mucosa gástrica e no tecido gástrico neoplásico. A expressão dela foi detectada em 72% das células do carcinoma gástrico e em 55,8% das células da mucosa gástrica. Tal descoberta sugere que a expressão da ciclina D1 aparece nas lesões gástricas iniciais e tende a permanecer com a progressão do tumor. Identificamos a expressão positiva da ciclina D1 apenas no núcleo das células neoplásicas e não houve expressão citoplasmática desta proteína. Maior número de tumores dos homens apresentou expressão positiva do que os tumores das mulheres. Apenas a expressão nuclear era esperada tendo em vista que a ciclina D1 é proteína sintetizada a partir da estimulação de β-catenina no núcleo. Esse achado sugere que a via Wnt canônica é ativada.

No presente estudo, a expressão da proteína c-MYC foi positiva no citoplasma em 24,2% e no núcleo em 42,9% dos casos. A expressão citoplasmática negativa foi significativamente mais frequente no tipo intestinal da classificação de Lauren²³. Estudos mostraram que a amplificação do gene MYC no câncer gástrico varia de 38,1% a 40%. Khaleghian et al. (2016)¹⁹ avaliaram a relação da expressão e amplificação do gene MYC com as características anatomopatológicas e biodemográficas do carcinoma gástrico. A hibridização in situ foi positiva em 43% e a expressão positiva foi identificada em 14,7% dos casos. Esses autores identificaram o aumento da expressão de MYC em tumores difusos, ao contrário de Calgano et al. (2013)⁶ que identificaram maior expressão da proteína MYC no tipo intestinal da classificação de Lauren²³. Além disso, nenhuma diferença foi encontrada na expressão da proteína MYC em relação aos estágios do tumor. Liu et al (2014)²⁵ verificaram a presença da expressão positiva da proteína MYC em 66,3% dos tumores gástricos.

CONCLUSÃO

A relação da expressão das proteínas da via canônica com as variáveis epidemiológicas e tumorais sugere sua participação na carcinogênese gástrica. Por outro lado, a ausência da relação das expressões das proteínas da via não-canônica sugere sua não participação na carcinogênese gástrica.